1 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: So sánh khác biệt trình tự gen sinh tổng hợp astaxanthin chủng hoang dại chủng đột biến, tối ưu hóa mơi trường ni cấy chủng đột biến nấm men Rhodosporidium toruloides để thu nhận astaxanthin 2 MỤC LỤC 3 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ATP BBD BP CCD Contig DNA DNA sequencing GB Nanowell NCBI NGS Read RSM Scaffold TCA Adenosine triphosphate Box - Behnken Design Base pair Central Composite Design Đoạn trình tự dài, tạo từ nhiều đoạn reads Deoxyribonucleic acid Đọc trình tự DNA Giga base pair Giếng nano National Center for Biotechnology Information Next Generation Sequencing Đoạn trình tự ngắn Response surface methodology Tạo từ nhiều đoạn contigs Trichloroacetic acid 4 DANH MỤC HÌNH 5 DANH MỤC BẢNG 6 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Astaxanthin carotenoid màu đỏ cam có nhiều loài vi sinh vật động vật biển Là chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhóm hợp chất thuộc carotenoid, hoạt tính kháng oxy hóa astaxanthin gấp 10 lần zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, β-carotene cao gấp 100 lần so với αtocopherol Nhiều nghiên cứu astaxanthin tác dụng kháng oxy hóa có khả làm giảm nguy bệnh tim mạch, ung thư, tăng cường khả miễn dịch thể giúp chống lại virus, vi khuẩn, nấm ký sinh trùng Vì có nhiều tác dụng có lợi tới sức khỏe người nên ngày nhu cầu sử dụng astaxanthin nguồn dinh dưỡng bổ sung thực phẩm chức ngày tăng cao Ở Việt Nam, nấm men Rhodosporidium toruloides phân lập tiến hành nhiều nghiên cứu sinh tổng hợp astaxanthin chủng hoang dại Năm 2017, tác giả tiến hành gây đột biến ngẫu nhiên chủng hoang dại tác nhân vật lý hóa học benomyl, ethyl methanesulfonate, ethidium bromide, tia UV tia Co-60, kết thu chủng Rhodosporidium toruloides đột biến cho hàm lượng carotenoid tổng hàm lượng astaxanthin tăng lên đáng kể so với chủng Rhodosporidium toruloides hoang dại Tuy nhiên, nghiên cứu chủng đột biến dừng lại việc làm tăng hàm lượng carotenoid tổng hàm lượng astaxanthin đột biến ngẫu nhiên mà chưa nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy lên phát triển sinh tổng hợp astaxanthin Ngoài ra, tiến hành phương pháp đột biến ngẫu nhiên chủng đột biến tạo thành chưa xác định vị trí biến đổi kiểu gene Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: “So sánh khác biệt trình tự gen sinh tổng hợp astaxanthin chủng hoang dại chủng đột biến, tối ưu 7 hóa môi trường nuôi cấy chủng đột biến nấm men Rhodosporidium toruloides để thu nhận astaxanthin.” 1.2 Mục tiêu đề tài Khảo sát so sánh khác biệt trình tự gen ảnh hưởng đến sinh tổng hợp astaxanthin chủng hoang dại số chủng đột biến nấm men Rhodosporidium toruloides Nghiên cứu lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp cho nấm men Rhodosporidium toruloides sinh trưởng sinh tổng hợp astaxanthin, tối ưu hóa mơi trường ni cấy phương pháp đáp ứng bề mặt để thu nhận astaxanthin 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Tìm khác biệt trình tự gen ảnh hưởng đến sinh tổng hợp astaxanthin chủng nấm men Rhodosporidium toruloides hoang dại đột biến để làm sở khoa học giải thích cho việc hàm lượng astaxanthin tăng lên chủng đột biến Lựa chọn môi trường thích hợp xác định nồng độ tối ưu thành phần môi trường cho sinh trưởng sinh tổng hợp astaxanthin chủng nấm men Rhodosporidium toruloides đột biến 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Astaxanthin thu nhận từ chủng nấm men Rhodosporidium toruloides đột biến nghiên cứu sử dụng để thực nghiên cứu lĩnh vực công nghiệp thức ăn chăn nuôi, phụ gia thực phẩm, thực phẩm chức dược phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường 8 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan astaxanthin 2.1.1 Giới thiệu Astaxanthin xanthophyll carotenoid tìm thấy nhiều loài vi sinh vật động vật biển Astaxanthin có màu đỏ tan hồn tồn chất béo, chúng khơng có hoạt tính tiền vitamin A thể người lại có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhiều hợp chất khác thuộc nhóm carotenoid [1] Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (USFDA) cấp phép cho việc sử dụng astaxanthin làm chất màu phụ gia thực phẩm thức ăn chăn nuôi cho động vật thức ăn cho cá [2] Nhiều nghiên cứu astaxanthin có khả làm giảm nguy bệnh tim mạch, ung thư, tăng cường khả miễn dịch thể giúp chống lại virus, vi khuẩn, nấm ký sinh trùng Vì có nhiều tác dụng có lợi tới sức khỏe người nên ngày nhu cầu sử dụng astaxanthin nguồn dinh dưỡng bổ sung thực phẩm chức ngày tăng cao [3] 2.1.2 Nguồn thu nhận Trong tự nhiên, astaxanthin tìm thấy chủ yếu tảo, nấm men, lồi cá hồi, tơm số lồi vi sinh vật khác (Bảng 2.1) Astaxanthin sản xuất cho thương mại chủ yếu thu nhận từ nấm men đỏ Phaffia rhodozyma, vi tảo lục Haematococcus pluvialis thông qua tổng hợp hóa học, vi tảo lục Haematococcus pluvialis nguồn thu nhận tốt astaxanthin tự nhiên [4] Tơm, cua cá hồi nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên cho người tốt thông qua chế độ ăn hợp lý, trung bình người ăn 165 gram cá hồi ngày để có 3,6 mg astaxanthin, lượng astaxanthin cần thiết tạo nhiều lợi ích sức khỏe cho người theo báo cáo Iwamoto cộng [5] Bảng 2.1: Một số loài vi sinh vật cung cấp astaxanthin [3] Nguồn thu nhận Hàm lượng astaxanthin 9 Haematococcus pluvialis Chlorococcum Chlorella zofingiensis Neochloris wimmeri Enteromorpha intestinalis Ulva lactuca Catenella repens Agrobacterium aurantiacum Paracoccus carotinifaciens Xanthophyllomyces dendrorhous Thraustochytrium sp Pandalus borealis Pandalus clarkia (% sinh khối khô) 3,8 0,2 0,001 0,6 0,02 0,01 0,02 0,01 2,2 0,5 0,2 0,12 0,015 Hình 2.1: Vi tảo lục Haematococcus pluvialis [6] 2.1.3 Đặc tính hóa sinh Astaxanthin có cơng thức phân tử C40H52O4 khối lượng phân tử 596,84 g/mol Astaxanthin có cấu trúc bao gồm hai vòng β-ionon nối với chuỗi polyene, phân tử astaxanthin có hai carbon bất đối xứng nằm vị trí 3, 'của vòng β-ionon với nhóm hydroxyl (-OH) hai đầu phân tử (hình 2.2) [3] Trong nguồn tự nhiên, astaxanthin tồn dạng đồng phân lập thể, 10 10 đồng phân hình học dạng tự bị este hóa Astaxanthin có chứa liên kết đơi liên hợp, nhóm hydroxyl (-OH) keto (C=O), có tính chất ưa béo tốt ưa nước Loại liên kết đôi liên hợp hoạt động chất chống oxy hóa mạnh cách góp electron tự chúng vào phản ứng với gốc tự sau chuyển đổi chúng thành sản phẩm ổn định chấm dứt phản ứng chuỗi gốc tự nhiều sinh vật sống Astaxanthin cho thấy hoạt tính sinh học tốt chất chống oxy hố khác liên kết với màng tế bào từ bên bên ngồi [3] 2.1.4 Hoạt tính sinh học Astaxanthin hợp chất hòa tan chất béo, với hấp thu tăng lên tiêu thụ với loại dầu ăn Astaxanthin kết hợp với dầu cá làm tăng tác dụng hạ lipid máu, hạ cholesterol huyết tương tăng hoạt tính kích hoạt bạch cầu trung tính so sánh riêng lẻ astaxanthin dầu cá Astaxanthin hấp thu vào thể chất béo vận chuyển qua hệ thống bạch huyết vào gan, hấp thụ astaxanthin phụ thuộc vào thành phần chế độ ăn kèm theo, chế độ ăn có nhiều chất béo làm tăng hấp thu astaxanthin chế độ ăn chất béo làm giảm hấp thụ Astaxanthin kết hợp với axit mật sau ăn hấp thu phần tế bào niêm mạc ruột Trong số carotenoid tự nhiên, astaxanthin coi carotenoid tốt bảo vệ tế bào, lipid màng lipoprotein chống lại hư hỏng oxy hố gây Nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe astaxanthin phát chứng minh [3] 60 60 môi trường YM Broth đến sinh tổng hợp astaxathin nấm men Rhodosporidium toruloides chủng BE1 Phương trình hồi quy tuyến tính: Y = 3360,66 + 60,4X1 + 67,73X2 + 45,24X3 + 35,38X1X2 + 54,72X1X3 + 29,97X2X3 - 94,07X12 - 108,70X22 - 152,01X32 (1) Với X1, X2 X3 biến mã hóa glucose, peptone cao malt Bảng 4.15: Phân tích phương sai cho mơ hình thực nghiệm Hệ số Tổng bình Trung bình tự phương bình phương a Mơ hình 715104 79456 Phần dư 10 37147 3715 Tổng 19 752250 a Hệ số xác định (R ) = 0,95; Hiệu chỉnh R2 = 0,91 Giá trị F Giá trị P 21.39 0,000 Qua bảng 4.2, độ tương thích phương trình hồi quy tuyến tính với thực nghiệm có ý nghĩa mặt thống kê (do P = 0,00 < 0,05) Hệ số xác định R = 0,95 cho thấy 95% thay đổi sinh tổng astaxanthin nấm men Rhodosporidium toruloides chủng BE1 ảnh hưởng thành phần bên môi trường (Glucose, Peptone, cao malt) có 5% sai số ngẫu nhiên Bảng 4.16: Ý nghĩa thống kê hệ số mơ hình thực nghiệm Hệ số β0 β1 β2 β3 β11 β22 β33 β12 β13 β23 a Giá trị 3360,66 60,40 67,73 45,24 -94,07 -108,70 -152,01 35,38 54,72 29,97 tα/2,n-p = t0,025,10 = 2,23 Sai số chuẩn 24,86 16,49 16,49 16,49 16,05 16,05 16,05 21,55 21,55 21,55 Giá trị t a 135,197 3,663 4,107 2,743 -5,859 -6,770 -9,468 1,642 2,539 1,391 Giá trị P 0,000 b 0,004 b 0,002 b 0,021 b 0,000 b 0,000 b 0,000 b 0,132 0,023 b 0,194 61 61 b P