PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

64 384 0
PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Từ nhiều năm nay, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh tế ở nƣớc ta vì nƣớc ta là một nƣớc nông nghiệp. Nó đã cung cấp một phần nhu cầu thực phẩm thiết yếu của cuộc sống con ngƣời. Trong đó ngành chăn nuôi heo không ngừng phát triển để cung cấp đủ số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cho ngƣời tiêu dùng. Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lƣợng heo nuôi ngày càng tăng cao. Song song với quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hƣởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trƣởng của heo nhƣ: bệnh FMD, bệnh dịch tả heo, bệnh đóng dấu son, bệnh giả dại…và gần đây nhất là một vấn đề đang làm đau đầu giới chăn nuôi, nó ảnh hƣởng không nhỏ đến hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome). Bệnh do virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết trƣớc khi sinh, còi cọc, chậm lớn. Những nghiên cứu về PRRS trƣớc đây chỉ dừng lại ở việc điều tra tỷ lệ nhiễm bằng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS. Mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trƣờng tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dƣơng tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này. 2 Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của ThS. Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT- PCR”.

iii BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ NGỌC THƠ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iv BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN VÕ NGỌC THƠ BSTY. HOÀNG THANH HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Các Thầy Cô anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Hải, Cô Hà các Thầy Cô Bộ Môn Vi Sinh-Truyền Nhiễm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Anh Lê Hồng Phong ở Cục Thú Y vùng 6 đã rất tận tình chỉ bảo giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Anh Uyên đã động viên chia sẻ vấn đề của tôi. Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 (nhất là các bạn trong phòng 14A, cƣ xá B) đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.  Đặc biệt tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cô Trần Thị Bích Liên Anh Hoàng Thanh Hải đã rất tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện khóa luận.  Con xin gởi lòng mang ơn đặc biệt nhất đến với cha mẹ, những ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ luôn cho con một tinh thần thoải mái để luôn chú tâm vào chuyện học.  lời cám ơn đặc biệt nhất tôi xin gởi đến ngƣời bạn thân thiết nhất, Nguyễn Minh Khôi, đã luôn luôn bên tôi, an ủi động viên để tôi làm tốt nhất. Xin cám ơn, cám ơn từ tận đáy lòng tôi. Thủ Đức, tháng 8 năm 2007 iv Võ Ngọc Thơ TÓM TẮT Đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng Vi Sinh Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi Thú Y tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài là phân lập virus từ các loại mẫu khác nhau xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Nội dung nghiên cứu gồm:  Hồi phục tế bào xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên bình nuôi cấy 25cm 2 với những lƣợng tế bào là 7.10 5 10 6 .  Khảo sát bệnh tích tế bào MARC-145 sau khi nuôi cấy phân lập từ các loại mẫu khác nhau: huyết thanh, hạch amiđan, phổi, hạch phổi.  Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ bệnh tích tế bào MARC-145 sau gây nhiễm bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Sau thời gian thực hiện, chúng tôi có các kết quả sau: o Thời gian một lần cấy chuyển ở lọ 25cm 2 với những lƣợng tế bào: 7.10 5 , 10 6 lần lƣợt là 72,56 giờ 46 giờ. o Tế bào MARC-145 sau khi đƣợc hồi phục từ nitơ lỏng vẫn phát triển bình thƣờng. o Phân lập virus PRRS từ hạch phổi, phổi, huyết thanh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Ghi nhận đƣợc 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào là 2 mẫu hạch phổi 1 mẫu phổi chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11). o Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả dƣơng tính chiếm tỷ lệ 33,33% trên mẫu xét nghiệm. v SUMMARY Graduating thesis: " Isolating PRRS virus by MARC-145 cell and confirming the virus by RT-PCR technology". The thesis have been done from March to August, 2007 at Microbiology And Infectious Diseases Dept. of Faculty Of Animal Science Veterinary and Center For Chemical And Biological Analysis And Experiment of Nong Lam university Hồ Chí Minh city. Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and determine its appearance by RT-PCR technology. The contain is concerned about:  Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.10 5 and 10 6 .  Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with different specimens such as: serum, lung, lympho nodes.  Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Finally, we have results: o The average period of one transfer with the amount of 7.10 5 cells is 72,565 hours, 10 6 cells is 46 hours. o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally. o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell invironment. 3 specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: 2 lymphonotes, 1 lung (3/11 specimens). o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY . v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG . xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích - Yêu cầu 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào 3 2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật 3 2.1.2. Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy 4 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 6 2.1.4. Sự tạp nhiễm cách hạn chế . 6 2.2. Phƣơng pháp PCR 6 2.2.1. Nguyên tắc 7 2.2.2. Thực nghiệm . 7 2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 8 2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR 9 2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus . 10 2.3.1. Lịch sử bệnh 10 2.3.2. Căn bệnh học . 11 2.3.2.1. Phân loại . 11 2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái cấu trúc 12 vii 2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy 14 2.3.2.4. Sức đề kháng 16 2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS . 16 2.3.3.1. Loài mắc bệnh 16 2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan . 16 2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập 17 2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh 17 2.3.4. Triệu chứng lâm sàng 20 2.3.5. Chẩn đoán 20 2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng . 20 2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng . 21 2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 21 2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên 22 2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS 23 2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào 23 Chƣơng 3: NỘI DUNG PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 25 3.1. Thời gian địa điểm . 25 3.2. Đối tƣợng số lƣợng mẫu 25 3.3. Nội dung nghiên cứu 25 3.4. Vật liệu dụng cụ 26 3.4.1. Thiết bị dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào phân lập virus 26 3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 . 26 3.4.3. Thiết bị dụng cụ dùng cho phản ứng PCR . 27 3.4.4. Vật liệu hoá chất cho chiết tách RNA 27 3.4.5. Vật liệu hoá chất sử dụng cho RT-PCR . 27 3.4.6. vật liệu hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR . 28 3.5. Phƣơng pháp tiến hành . 28 3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 28 3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 28 viii 3.5.2.1. Hồi phục tế bào 28 3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào 29 3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 34 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 . 34 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 . 35 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 37 4.4. Kết quả RT-PCR 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ . 44 5.1. Kết luận 44 5.2. Tồn tại 44 5.3. Đề nghị . 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 45 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS 19 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập xác định virus PRRS 31 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR . 33 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Virus PRRS . 12 Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng 15 Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS . 15 Hình 2.4. Triệu chứng bệnh tai xanh . 20 Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS . 20 Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer 30 Hình 4.1. Đối chứng âm . 40 Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào . 40 Hình 4.3. Đối chứng dƣơng 40 Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP 41 Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2 . 41 Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào . 42 . Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định virus bằng kỹ thuật. kháng virus PRRS. Mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trƣờng tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dƣơng tính và

Ngày đăng: 03/09/2013, 09:59

Hình ảnh liên quan

Hình 2.1. Virus PRRS - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 2.1..

Virus PRRS Xem tại trang 24 của tài liệu.
Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm                                                                                              PRRSV  - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 2.2..

Đại thực bào bình thƣờng Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm PRRSV Xem tại trang 27 của tài liệu.
Hình 2.4. Triệu chứng tai xanh Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS (Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com và http://www.thepigsite.com)  - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 2.4..

Triệu chứng tai xanh Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS (Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com và http://www.thepigsite.com) Xem tại trang 32 của tài liệu.
Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 3.1..

Buồng đếm Neubauer Xem tại trang 42 của tài liệu.
Bảng 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Bảng 4.1..

Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 Xem tại trang 46 của tài liệu.
Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Bảng 4.3..

Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 Xem tại trang 49 của tài liệu.
Hình 4.1. Đối chứng âm (độ phóng đại 100 lần)  - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 4.1..

Đối chứng âm (độ phóng đại 100 lần) Xem tại trang 50 của tài liệu.
Một số hình ảnh về phân lập virus trên môi trƣờng tế bào MARC-145: - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

t.

số hình ảnh về phân lập virus trên môi trƣờng tế bào MARC-145: Xem tại trang 50 của tài liệu.
Hình 4.3. Đối chứng dƣơng (độ phóng đại 100 lần)  - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 4.3..

Đối chứng dƣơng (độ phóng đại 100 lần) Xem tại trang 51 của tài liệu.
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 4.4..

Bệnh tích tế bào Xem tại trang 51 của tài liệu.
Hình 4.5. Bệnh tích tế bào - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 4.5..

Bệnh tích tế bào Xem tại trang 52 của tài liệu.
Bảng 4.4 Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau khi gây nhiễm - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Bảng 4.4.

Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau khi gây nhiễm Xem tại trang 53 của tài liệu.
Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào - PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hình 4.6..

Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào Xem tại trang 54 của tài liệu.

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan