Đang tải... (xem toàn văn)
MỞ ĐẦU Sâm Việt Nam (còn gọi là Sâm Ngọc linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) đƣợc tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973. Đến năm 1985, đƣợc xác định tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân sâm (Araliaceae) [3]. Hiện nay, Sâm Việt Nam cũng đƣợc lựa chọn là cây thuốc hàng đầu trong danh mục sản phẩm quốc gia. Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng đề án: “Chƣơng trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dƣợc liệu trong nƣớc và các sản phẩm từ dƣợc liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030. Xây dựng hồ sơ 40 dƣợc liệu có tiềm năng khai thác và phát triển thị trƣờng”. Trong đó cây Sâm Việt Nam đƣợc chọn đứng vị trí đầu tiên trong danh sách. Bên cạnh đó, theo Quyết định số 787/QĐ/TTg ngày 05/6/2017 của Thủ tƣớng chính phủ, Sâm Việt Nam là sản phẩm thuộc chƣơng trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020. Sâm Việt Nam đƣợc thế giới biết đến nhƣ là một loài Sâm mới và có giá trị cao nhƣ Nhân Sâm. Hiện nay, Sâm Việt Nam đƣợc trồng tại một số vùng đặc hữu nhƣ Kon Tum và Quảng Nam. Trên thị trƣờng, Sâm Việt Nam thƣờng bị giả mạo bởi những dƣợc liệu khác, nhiều trƣờng hợp không những không có tác dụng điều trị mà còn có thể gây độc hại cho ngƣời dùng. Vì vậy việc kiểm nghiệm đánh giá chất lƣợng Sâm Việt Nam là cần thiết. Bên cạnh đó, sự phát hiện một thứ của cây Sâm Việt Nam là Panax vietnamensis var. Fuscidiscus có hình thái giống Sâm Việt Nam, mọc hoang tại Vân Nam thuộc Trung Quốc và Lai Châu của Việt Nam. Cây sâm này đã đƣợc đánh giá bƣớc đầu bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho thấy trong thành phần saponin có nhóm ocotillol nhƣ Sâm Việt Nam [33]. Saponin nhóm ocotillol chỉ phát hiện trong Sâm Việt Nam mà không có trong Nhân sâm gồm một số hợp chất tiêu biểu nhƣ majonosid-R2, vinaginsenosid-R1, vinaginsenosid-R2,...Tuy nhiên, vài nghiên cứu trƣớc đã công bố phƣơng pháp định lƣợng một số saponin thuộc nhóm này bằng phƣơng pháp HPLC với detector dãy diod quang (DAD) hay detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) [75] nhƣng vẫn chƣa xác định chính xác hàm lƣợng riêng biệt từng chất nhƣ vinaginsenosid-R2. Do đó, việc nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng các saponin thuộc nhóm ocotillol góp phần tiêu chuẩn hóa và xây dựng thƣơng hiệu quốc gia về Sâm Việt Nam là vấn đề cấp thiết. Về mặt tác dụng dƣợc lý, các kết quả nghiên cứu trƣớc đây đƣợc tiến hành trên mẫu Sâm Việt Nam mọc hoang với nhiều tác dụng nhƣ: tăng lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ [3], [51], [53]. Tuy nhiên, hiện nay nguồn sâm sử dụng trên thị trƣờng chủ yếu là từ nguồn sâm trồng. Cho đến nay, chƣa có nghiên cứu một cách hệ thống về tác dụng dƣợc lý của Sâm Việt Nam trồng, nếu sử dụng các kết quả nghiên cứu trƣớc đây của sâm mọc hoang cho sâm trồng thì sẽ không thuyết phục. Vì các lý do cần thiết trên, tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam”. Đề tài đƣợc thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu: 1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lƣợng đồng thời một số saponin chính trong Sâm Việt Nam trồng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) và phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC– DAD). 2. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng. 3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6 năm tuổi: - Tác dụng tăng lực của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi. - Tác dụng bảo vệ gan của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi. - Tác dụng chống stress tâm lý của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi. - Tác dụng chống stress tâm lý của một số saponin thuộc nhóm ocotillol.
BỘ GÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƢƠNG HỒNG TỐ QUYÊN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV., ARALIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH, Năm 2019 i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC ẢNG iv DANH MỤC CÁC H NH vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI PANAX .3 1.2 SÂM VIỆT NAM 15 1.3 NGHIÊN CỨU VỀ TIÊU CHUẨN HÓA SÂM VIỆT NAM .27 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 32 NGHIÊN CỨU 32 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 32 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM TRỒNG 57 3.2 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN SÂM VIỆT NAM TRỒNG .83 3.3 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM TRỒNG TUỔI .87 CHƢƠNG ÀN LUẬN .112 4.1 XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM TRỒNG .112 4.2 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN SÂM VIỆT NAM TRỒNG 116 4.3 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM TRỒNG TUỔI 118 KẾT LUẬN 135 KIẾN NGHỊ 137 DANH MỤC CÁC C NG TR NH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic AST Aspartate aminotransferase ALT Alanine aminotransferase AF Asymetric factor AAPH (2,2‟- azobis (2- Nghĩa tiếng việt Hệ số bất đối amidinopropane hydrochloride)) CC Column Chromatography CHCl3 Cloroform CCl4 Carbon tetrachlorid CY Cyclophosphamide CS Cộng DCF-DA 2‟,7‟dichlorodihydrofluorescein Sắc ký cột Cyclophosphamid - diacetat DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DAD Diode Array Detector Detector dãy diốt quang EC50 Effective Concentration 50% Nồng độ kháng oxy hóa 50% FST Forced swimming test Thực nghiệm bơi bắt buộc G- Ginsenoside Ginsenosid GABA Gamma-aminobutyric acid Acid aminobutyric GSH Glutathione Glutathion HPLC High Perfomance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1- Acid (4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid) piperazineethanesulfonic) iii Từ viết tắt Từ đầy đủ Nghĩa tiếng việt I.P Intraperitoneally Tiêm phúc mô LD50 Lethal dose 50% Liều chết 50% MDA Malonyl dialdehyde Malonyl dialdehyd M- Majonoside Saponin majonosid MS Mass Spectroscopy Phổ khối NO Nitrogen oxide NS Nhân sâm OD Optical Density Mật độ quang OCT Ocotillol Saponin nhóm ocotillol P Panax Chi Panax Q-TOF-MS Quadrupole Time of Flight Máy đo phổ khối tứ cực – thời Mass Spectrometer gian bay ROS Reactive Oxygen Species Gốc tự oxy hóa Rt Retention time Thời gian lƣu SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sâm VN Sâm Việt Nam Sâm VN-MH Sâm Việt Nam mọc hoang TBA Thiobarbituric acid Acid thiobarbituric TST Tail suspension test Thực nghiệm treo đuôi chuột TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u Sâm Việt Nam trồng iv DANH MỤC CÁC ẢNG Bảng 1.1 Các loài sâm đƣợc chấp nhận thuộc chi Panax Bảng 1.2 Chỉ tiêu kiểm nghiệm vài loài sâm theo chuyên luận Dƣợc điển Bảng 1.3 Thành phần saponin Sâm Việt Nam .18 Bảng 1.4 Một số tác dụng dƣợc lý khác Sâm Việt Nam 25 Bảng 2.5 Cách pha dung dịch đƣờng chuẩn 38 Bảng 2.6 Nồng độ giai mẫu mẫu xây dựng đƣờng tuyến tính HPLC-DAD .41 Bảng 3.7 Thơng số detector phổ khối áp dụng định lƣợng saponin 58 Bảng 3.8 Kết HPLC-MS nhận dạng ion saponin đối chiếu 60 Bảng 3.9 Hàm lƣợng saponin chiết siêu âm chiết lắc 61 Bảng 3.10 Saponin chiết với methanol nồng độ định lƣợng HPLC-MS 61 Bảng 3.11 Hàm lƣợng saponin chiết nhiệt độ định lƣợng HPLC-MS 61 Bảng 3.12 Hàm lƣợng saponin chiết thời gian định lƣợng HPLC-MS 62 Bảng 3.13 Tính tƣơng thích hệ thống HPLC-MS định lƣợng saponin .62 Bảng 3.14 Thời gian lƣu saponin HPLC-MS sau lần tiêm mẫu 63 Bảng 3.15 Dữ liệu xác nhận khối lƣợng ion số saponin chuẩn 63 Bảng 3.16 Kết phƣơng trình tính tuyến tính .65 Bảng 3.17 Độ lặp lại ngày phƣơng pháp HPLC-MS .65 Bảng 3.18 Độ lặp lại liên ngày phƣơng pháp HPLC-MS 66 Bảng 3.19 Kết độ định lƣợng G-Rg1 HPLC-MS 67 Bảng 3.20 Kết độ định lƣợng M-R2 HPLC-MS 67 Bảng 3.21 Độ phƣơng pháp định lƣợng V-R2 HPLC-MS .67 Bảng 3.22 Kết độ định lƣợng G-Rb1 HPLC-MS 68 Bảng 3.23 Kết độ phƣơng pháp định lƣợng G-Rd HPLC-MS 68 Bảng 3.24 Giới hạn phát định lƣợng saponin HPLC-MS .68 Bảng 3.25 Hàm lƣợng saponin Sâm Việt Nam trồng - tuổi .69 Bảng 3.26 Hàm lƣợng saponin chiết xuất MeOH với hàm lƣợng khác 72 Bảng 3.27 Hàm lƣợng saponin chiết mức nhiệt độ khác 72 v Bảng 3.28 Hàm lƣợng saponin theo thời gian chiết xuất 73 Bảng 3.29 Hàm lƣợng saponin từ số lần chiết xuất khác 73 Bảng 3.30 Giá trị thông số sắc ký ứng với pic G-Rg1 mẫu chuẩn 73 Bảng 3.31 Giá trị thông số sắc ký ứng với pic M-R2 mẫu chuẩn 74 Bảng 3.32 Giá trị thông số sắc ký ứng với pic G-Rb1 mẫu chuẩn 74 Bảng 3.33 Giá trị thông số sắc ký ứng với pic G-Rd mẫu chuẩn 74 Bảng 3.34 Diện tích pic tƣơng ứng với nồng độ mẫu đối chiếu 78 Bảng 3.35 Phƣơng trình hồi quy chất chuẩn G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 .79 Bảng 3.36 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng HPLC-DAD 79 Bảng 3.37 Độ lặp lại ngày phƣơng pháp HPLC-DAD 80 Bảng 3.38 Kết độ lặp liên ngày phƣơng pháp HPLC-DAD .81 Bảng 3.39 Kết độ phƣơng pháp HPLC-DAD định lƣợng G-Rg1 .81 Bảng 3.40 Kết độ phƣơng pháp HPLC-DAD định lƣợng M-R2 82 Bảng 3.41 Kết độ phƣơng pháp HPLC-DAD định lƣợng G-Rb1 .82 Bảng 3.42 Kết độ phƣơng pháp HPLC-DAD định lƣợng G-Rd .82 Bảng 3.43 Kết hàm lƣợng số saponin Sâm Việt Nam trồng 87 Bảng 3.44 Khối lƣợng cao toàn phần saponin toàn phần 88 Bảng 3.45 Độ quy trình định lƣợng saponin cao Sâm VN .88 Bảng 3.46 Hàm lƣợng saponin cao Sâm Việt Nam trồng tuổi .89 Bảng 3.47 Thời gian bơi tuyệt đối nhóm chuột thử nghiệm Brekhman 89 Bảng 3.48 Thời gian bơi tƣơng đối nhóm chuột thực nghiệm Brekhman 90 Bảng 3.49 Thời gian bơi tuyệt đối thử nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng .91 Bảng 3.50 Thời gian bơi tƣơng đối thực nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng 91 Bảng 3.51 Hoạt tính kháng oxy hóa tế bào Hep G2 93 Bảng 3.52 Hoạt độ AST, ALT huyết tƣơng thực nghiệm CCl4 94 Bảng 3.53 Hàm lƣợng MDA, GSH gan chuột thực nghiệm CCl4 96 Bảng 3.54 Hàm lƣợng MDA GSH gan chuột thực nghiệm CY 97 Bảng 3.55 Sự thay đổi trọng lƣợng thể lô chuột thử nghiệm .98 Bảng 3.56 Hoạt độ AST, ALT huyết tƣơng thực nghiệm ethanol 99 Bảng 3.57 Kết hàm lƣợng MDA, GSH gan chuột vào tuần .100 vi Bảng 3.58 Tiềm thời thời gian ngủ lô chuột sau tuần thí nghiệm 101 Bảng 3.59 Tác dụng cao Sâm Việt Nam tiềm thời thời gian ngủ 102 Bảng 3.60 Thời gian sáng số lần sáng lô chuột liều .104 Bảng 3.61 Thời gian sáng số lần sáng điều trị sau ngày 105 Bảng 3.62 Thời gian bất động lô chuột thí nghiệm liều 106 Bảng 3.63 Thời gian bất động lô chuột điều trị liều sau 14 ngày 107 Bảng 3.64 Thời gian ngăn sáng số lần ngăn sáng thực nghiệm sáng tối 108 Bảng 3.65 Thời gian bất động chuột thực nghiệm FST TST .109 Bảng 3.66 Hàm lƣợng MDA, GSH tế bào não chuột trầm cảm cô lập 110 Bảng 4.67 So sánh tác dụng dƣợc lý Sâm VN với Nhân Sâm Sâm VN-MH 132 vii DANH MỤC CÁC H NH Hình 1.1 Khung saponin thuộc chi Panax Hình 1.2 Bộ phận mặt đất (A) phận dƣới mặt đất Sâm Việt Nam (B) 16 Hình 3.3 SKĐ thăm dò chƣơng trình pha động điều kiện 57 Hình 3.4 SKĐ tổng ion (TIC) từ saponin đối chiếu HPLC-MS 59 Hình 3.5 SKĐ extract ion (EIC) saponin đối chiếu HPLC-MS 59 Hình 3.6 Phổ MS saponin đối chiếu 60 Hình 3.7 Phổ MS saponin đối chiếu sau lần lƣợt cắt phân tử đƣờng 64 Hình 3.8 SKĐ mẫu thử điều kiện 72 Hình 3.9 SKĐ độ tinh khiết saponin hỗn hợp mẫu đối chiếu 76 Hình 3.10 SKĐ độ tinh khiết pic saponin định lƣợng mẫu thử 77 Hình 3.11 SKĐ mẫu trắng .77 Hình 3.12 SKĐ mẫu đối chiếu saponin 78 Hình 3.13 SKĐ saponin định lƣợng mẫu thử .78 Hình 3.14 SKĐ mẫu thử thêm saponin mẫu đối chiếu 78 Hình 3.15 Bộ phận dƣới mặt đất Sâm Việt Nam trồng tuổi 83 Hình 3.16.Vi phẫu thân rễ Sâm Việt Nam trồng tuổi 84 Hình 3.17 Vi phẫu rễ củ Sâm Việt Nam trồng tuổi 85 Hình 3.18 Đặc điểm bột thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam 86 Hình 3.19 Sắc ký lớp mỏng mẫu Sâm Việt Nam trồng tuổi 86 Hình 3.20 SKĐ cao tồn phần Sâm Việt Nam trồng tuổi 88 MỞ ĐẦU Sâm Việt Nam (còn gọi Sâm Ngọc linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) đƣợc tìm thấy vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973 Đến năm 1985, đƣợc xác định tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân sâm (Araliaceae) [3] Hiện nay, Sâm Việt Nam đƣợc lựa chọn thuốc hàng đầu danh mục sản phẩm quốc gia Năm 2011, Bộ Y Tế triển khai xây dựng đề án: “Chƣơng trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dƣợc liệu nƣớc sản phẩm từ dƣợc liệu giai đoạn từ đến năm 2020 tầm nhìn đến 2030 Xây dựng hồ sơ 40 dƣợc liệu có tiềm khai thác phát triển thị trƣờng” Trong Sâm Việt Nam đƣợc chọn đứng vị trí danh sách Bên cạnh đó, theo Quyết định số 787/QĐ/TTg ngày 05/6/2017 Thủ tƣớng phủ, Sâm Việt Nam sản phẩm thuộc chƣơng trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 Sâm Việt Nam đƣợc giới biết đến nhƣ lồi Sâm có giá trị cao nhƣ Nhân Sâm Hiện nay, Sâm Việt Nam đƣợc trồng số vùng đặc hữu nhƣ Kon Tum Quảng Nam Trên thị trƣờng, Sâm Việt Nam thƣờng bị giả mạo dƣợc liệu khác, nhiều trƣờng hợp khơng khơng có tác dụng điều trị mà gây độc hại cho ngƣời dùng Vì việc kiểm nghiệm đánh giá chất lƣợng Sâm Việt Nam cần thiết Bên cạnh đó, phát thứ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis var Fuscidiscus có hình thái giống Sâm Việt Nam, mọc hoang Vân Nam thuộc Trung Quốc Lai Châu Việt Nam Cây sâm đƣợc đánh giá bƣớc đầu phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cho thấy thành phần saponin có nhóm ocotillol nhƣ Sâm Việt Nam [33] Saponin nhóm ocotillol phát Sâm Việt Nam mà khơng có Nhân sâm gồm số hợp chất tiêu biểu nhƣ majonosid-R2, vinaginsenosid-R1, vinaginsenosid-R2, Tuy nhiên, vài nghiên cứu trƣớc công bố phƣơng pháp định lƣợng số saponin thuộc nhóm phƣơng pháp HPLC với detector dãy diod quang (DAD) hay detector tán xạ ánh sáng bay (ELSD) [75] nhƣng chƣa xác định xác hàm lƣợng riêng biệt chất nhƣ vinaginsenosid-R2 Do đó, việc nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng saponin thuộc nhóm ocotillol góp phần tiêu chuẩn hóa xây dựng thƣơng hiệu quốc gia Sâm Việt Nam vấn đề cấp thiết Về mặt tác dụng dƣợc lý, kết nghiên cứu trƣớc đƣợc tiến hành mẫu Sâm Việt Nam mọc hoang với nhiều tác dụng nhƣ: tăng lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ [3], [51], [53] Tuy nhiên, nguồn sâm sử dụng thị trƣờng chủ yếu từ nguồn sâm trồng Cho đến nay, chƣa có nghiên cứu cách hệ thống tác dụng dƣợc lý Sâm Việt Nam trồng, sử dụng kết nghiên cứu trƣớc sâm mọc hoang cho sâm trồng khơng thuyết phục Vì lý cần thiết trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa đánh giá số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam” Đề tài đƣợc thực với mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng đánh giá quy trình định lƣợng đồng thời số saponin Sâm Việt Nam trồng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC– DAD) Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng Đánh giá số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam trồng năm tuổi: - Tác dụng tăng lực cao Sâm Việt Nam trồng tuổi - Tác dụng bảo vệ gan cao Sâm Việt Nam trồng tuổi - Tác dụng chống stress tâm lý cao Sâm Việt Nam trồng tuổi - Tác dụng chống stress tâm lý số saponin thuộc nhóm ocotillol ... lỏng với detector dãy diod quang (HPLC– DAD) Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng Đánh giá số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam trồng năm tuổi: - Tác dụng tăng lực cao Sâm Việt Nam trồng... Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa đánh giá số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam Đề tài đƣợc thực với mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng đánh giá quy trình định lƣợng đồng thời số saponin Sâm Việt Nam trồng phƣơng... [89] 1.2.4 Một số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam Sâm Việt Nam đƣợc phát từ năm 1973, nhiên có nghiên cứu ngồi nƣớc tác dụng sinh học loài loài sâm Năm 1998, Konoshima công bố tác dụng kháng khối