Khóa luận tốt nghiệp KHĨA LUẬN/ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thẩm định phương pháp: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BISPHENOL A TRONG GIẤY IN NHIỆT THEO QTTN/KT3 9:2018 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BPA CV ECG EFSA Bisphenol A Coefficient of variation Electrocardiogram European Food Safety Hệ số biến thiên Điện tâm đồ Cơ quan An toàn Thực FCM Association Food Contact Materials phẩm Châu Âu Vật liệu tiếp xúc thực HPLC High peformance liquid phẩm Sắc ký lỏng hiệu cao ISO chromatography International Standard Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế LC - MS Organization Liquid Chromatography – Sắc ký lỏng khối phổ LOD LOQ MS QC RSD SD Mass Spectrometry Limit of Detection Limit of Quantification Mass Spectrometry Quality Control Relative standard deviation Standard deviation Giới hạn phát Giới hạn định lượng Khối phổ Kiểm soát chất lượng Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 So sánh độ lặp lại, độ chụm trung gian độ tái lặp 16 Bảng 3.1 Kết khảo sát thời gian lắc mẫu .29 Bảng 3.2 Kết sau tính tốn 29 Bảng 3.3 Đường chuẩn ngày 29/09/2018 30 Bảng 3.4 Đường chuẩn ngày 25/10/2018 31 Bảng 3.5 Đường chuẩn ngày 30/10/2018 32 Bảng 3.6 Khảo sát độ tuyến tính 33 Bảng 3.7 Độ lặp lại mẫu thêm chuẩn nồng độ 0,5 µg/mL 34 Bảng 3.8 Độ lặp lại mẫu thêm chuẩn nồng độ 1,0 µg/mL 35 Bảng 3.9 Độ lặp lại mẫu thêm chuẩn nồng độ 0,5 µg/mL 36 Bảng 3.10 Độ lặp lại mẫu blank, QC CC 36 Bảng 3.11 Khảo sát giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp .38 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1Tổng hợp Bisphenol A từ acetone phenol Hình 1.2 Cấu trúc không gian Bisphenol A Hình 1.3 Cơ chế in giấy nhiệt Hình 1.4 Mơ hình hệ thống HPLC .8 Biểu đồ 3.1 Kết khảo sát thời gian lắc mẫu 29 Biểu đồ 3.2 Mối quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích peak ngày 29/09 .30 Biểu đồ 3.3 Mối quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích peak ngày 25/10 31 Biểu đồ 3.4 Mối quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích peak ngày 30/10 .32 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu đối tượng: 1.1.1Giới thiệu Bisphenol A (BPA): 1.1.1.1 Sự đời cấu tạo bisphenol A: Bisphenol A lần tổng hợp nhà hóa học người Nga Alexander Dianin vào năm 1891.[1] Tuy nhiên tài liệu tổng hợp BPA cơng bố thức Thomas Zincke, đại học Marburd, Đức vào năm 1905 Hợp chất tổng hợp ngưng tụ acetone (do hậu tố A tên) với hai phân tử phenol Phản ứng xúc tác acid mạnh, chẳng hạn acid chlohydric (HCl) nhựa polystyrene sulfonate hóa Hình 1.1Tổng hợp Bisphenol A từ acetone phenol Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian Bisphenol A 1.1.1.2 Tính chất hóa lý: BPA tinh khiết dạng tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 158-159oC, nhiệt độ sơi 220oC, áp suất bốc 0,2 mmHg (ở 170oC) BPA tan dung môi hữu phân cực acetone, benzene, chloroform, methanol, toluene, xylene không tan nước dung môi phân cực acid acetic, C 2H5OH, formaldehyde số chất khác 1.1.1.3 Ứng dụng: Bisphenol A xuất dạng tinh khiết phiến màu trắng có mùi phenol nhạt BPA vật liệu tiếp xúc thực phẩm FCM (Food Contact Materials), monomer tổng hợp polycarbonate chất làm dẻo sử dụng sản xuất nhựa epoxy sử dụng để ngăn chặn tiếp xúc thực phẩm ion kim loại, đảm bảo độ ổn định nhiệt độ bền học chúng BPA không sử dụng sản xuất bao bì thực phẩm, mà cho vật liệu nha khoa, thiết bị chăm sóc sức khỏe, đồ chơi nhựa sản phẩm dành cho trẻ em trẻ sơ sinh BPA biết đến sử dụng trình phát triển chất nhuộm sử dụng với giấy nhiệt (thường thấy biên nhận thu ngân) [2] 1.1.1.4 Độc tính: BPA sử dụng việc chuẩn bị nhựa để sản xuất vật liệu, bao bì nhựa, đồ dùng nhà bếp, lớp phủ nắp bình có tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm Do đó, BPA di chuyển vào thức ăn tùy thuộc vào nhiệt độ thực phẩm, thời gian gia nhiệt đặc tính hóa lý Vào năm 2017, Cơ quan Hóa chất châu Âu kết luận BPA nên liệt kê mối quan ngại lớn tính chất gây rối loạn nội tiết, liên quan đến Khóa luận tốt nghiệp nguy bao gồm thay đổi chuyển hóa, bệnh tim mạch, tác động đến hệ sinh sản nguy khác.[3] Trong nghiên cứu thí nghiệm sử dụng mơ mỡ người, nhóm nghiên cứu đại học Cincinnati phát BPA ức chế hormone thiết yếu, adiponectin, chịu trách nhiệm điều chỉnh độ nhạy cảm insulin thể đồng thời gây nguy mắc hội chứng chuyển hóa cao cho người Phát họ công bố tạp chí Environmental Health Perspectives, số trực tuyến ngày 14 tháng 8, 2008 Trong nghiên cứu Patrica Hunt cộng phía bắc Carolina cho biết chuột tiếp xúc với BPA cho thấy có khả làm gián đoạn q trình phân li nhiễm sắc thể tế bào trứng động vật có vú tạo kiểu phân li khác kỳ trình giảm phân Các nghiên cứu thực nghiệm việc tiếp xúc với BPA kể thời gian ngắn liều lượng thấp đủ để gây bất thường trình phân li nhiễm sắc thể Quan trọng hơn, nghiên cứu cho thấy có mối liên quan rõ ràng với biến dị lệch bội người [4] Trẻ nhỏ sớm tiếp xúc với Bisphenol A bị tổn thương vĩnh viễn, Liên minh châu Âu (EU) cấm sử dụng chai sữa cho trẻ em làm từ polycarbonate từ tháng năm 2011 Trong năm qua, tỷ lệ sản xuất ngày cao làm cho BPA diện ạt môi trường Việc tiếp xúc với BPA diễn không từ chuỗi thức ăn, vào thể thơng qua đường hơ hấp (bụi sàn, sơn) Ngồi ra, BPA đặc biệt có giấy nhiệt, thứ mà người đại sử dụng ngày Một nghiên cứu tiến hành Shelley Ehrlich cộng vào năm 2015, Đại học Havard, khoa Y tế cộng đồng năm 2015, phát thấy gia tăng nồng độ BPA nước tiểu sau tiếp xúc với hóa đơn liên tục mà khơng có găng tay.[5] Khóa luận tốt nghiệp 1.1.2 Bisphenol A giấy nhiệt: Việc sử dụng giấy nhiệt cho hóa đơn bán vé, vé số, biên nhận ngân hàng, vé xe bus, biên nhận tiền mặt, vé xem phim, thẻ hành lý, máy rút tiền ATM giấy fax nguyên nhân làm tăng khả tiếp xúc BPA với người Năm 2015, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) giấy nhiệt nguồn tiếp xúc BPA thứ hai sau vật liệu tiếp xúc thực phẩm.[6] BPA có mặt giấy nhiệt monome tự do, hoạt động chất kết dính màu đồng tác nhân kích hoạt hình thành màu tiếp xúc với nhiệt 1.1.2.1 Giấy nhiệt chế in:[5] Giấy nhiệt sử dụng rộng rãi nhà bán lẻ để in hóa đơn bán hàng lĩnh vực khác cửa hàng tạp hóa, máy ATM ngân hàng để đảm bảo dịch vụ nhanh chóng xác Giấy nhiệt sử dụng đại lý bán vé, hệ thống xổ số doanh nghiệp khác, u cầu in có độ xác cao số lượng lớn Các lĩnh vực y tế chuyên ngành ngành y tế sử dụng hình ảnh chất lượng cao tạo in nhiệt cho in quan trọng kỹ thuật cao, cần có độ xác điện tâm đồ (ECG), in siêu âm toa thuốc Lớp phản ứng nhiệt giấy nhiệt chứa BPA có vai trò chất tráng phim loại thuốc nhuộm leuco, chất ổn định chất kết dính Cơ chế in giấy nhiệt: Khóa luận tốt nghiệp Bề mặt giấy phủ hỗn hợp trạng thái rắn thuốc nhuộm chất kết dính phù hợp, ví dụ: thuốc nhuộm fluoran leuco Gia nhiệt nhiệt độ nóng chảy Thuốc nhuộm Fluoran leuco phản ứng với acid (thường BPA) Dạng thay đổi sau bảo tồn trạng thái siêu bền chất kết dính rắn lại đủ nhanh Hình 1.3 Cơ chế in giấy nhiệt 1.1.2.2 Ưu điểm in giấy nhiệt: Máy in giấy nhiệt nhanh nhiều so với loại máy in khác khiến thời gian chờ đợi quầy tốn Các hình ảnh tạo có chất lượng cao rõ ràng so với loại in ấn khác, làm cho chúng trở thành thành phần thiếu sử dụng khắp nơi Chúng sử dụng tất nơi khác nhau, từ bệnh viện, nơi độ xác in quan trọng cửa hàng địa phương, nơi hóa đơn ghi lại thông qua in nhiệt giúp người tiêu dùng ý đến chi tiêu họ Khóa luận tốt nghiệp Các máy in có khả in mã vạch chất lượng cao trực tiếp biên nhận làm cho giao dịch phức tạp trả hàng trao đổi trở nên dễ dàng cho khách hàng, nhà bán lẻ ngăn chặn việc trộm cắp làm hóa đơn giả Nói chung, giấy nhiệt phủ BPA làm ổn định chịu nhiệt BPA sử dụng để làm lớp phủ cho giấy nhiệt đem lại cho đặc tính vượt trội việc in khơng sử dụng mực 1.2 Các nghiên cứu BPA giấy in nhiệt: 1.2.1 Khối phổ (MS): Khối phổ (mass spectrometry) thiết bị phân tích dựa xác định khối lượng phân tử hợp chất cách phân tách ion phân tử theo tỉ số khối lượng diện tích (m/z) chúng Cấu tạo thiết bị khối phổ gồm phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích phận phát Đầu tiên mẫu ion hóa nguồn ion đưa vào phận phân tích để tách ion theo tỉ số m/z Các ion sau vào bội phận phát khuếch đại chuyển thành tín hiệu Một số kỹ thuật ion hóa thường sử dụng ion hóa đầu phun điện tử (ESI – electrospray ionization), ion hóa hóa học áp suất khí (APCI – atmospheric pressure chemical ionization) … Tác giả Russo cộng thực xác định BPA ESI-MS thực chế độ ion âm Quá trình ESI bao gồm trình: - Tạo thành giọt mang điện tích - Làm giảm kích thước hạt phân nhỏ chúng Khóa luận tốt nghiệp 27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết khảo sát 3.1.1 Kết khảo sát thời gian lắc mẫu Bảng 3.1 Kết khảo sát thời gian lắc mẫu Thời gian lắc t, h Không lắc Nồng độ Co, mg/L 8.77 10.66 10.27 10.13 10.49 10.23 10.36 Diện tích peak 1651238 2005740 1933249 1905886 1973503 1925276 1950022 Bảng 3.2 Kết sau tính tốn Thời gian lắc t, h Nồng độ Co, mg/L 8.77 10.66 10.27 10.13 10.49 10.23 10.36 Nồng độ C, ppm 877 1066 1027 1013 1049 1023 1036 Khóa luận tốt nghiệp 28 Kết khảo sát thời gian lắc mẫu 1200 1000 800 Nồng độ, ppm 600 400 200 0 Thời gian, h Biểu đồ 3.1 Kết khảo sát thời gian lắc mẫu Nhận xét bàn luận kết quả: qua kết khảo sát ttrong khoảng thời gian lắc khác mẫu cho thấy có thay đổi nồng độ rõ rệt không lắc lắc mẫu Tuy nhiên, lại khơng có khác biệt lớn lắc đến Với kết khảo sát trên, ta chọn thực thẩm định phương pháp với thời gian lắc mẫu 3.1.2 Kết khảo sát lập đường chuẩn độ tuyến tính Khóa luận tốt nghiệp 29 Bảng 3.3 Đường chuẩn ngày 29-09-2018 Nồng độ dung dịch chuẩn, mg/L 0.5 10 Hệ số góc Hệ số chặn Hệ số tương quan Nồng độ chất phân tích, mg/L 0.478703 0.988087 2.100943 4.904534 10.027734 167501.172 3271.265 0.999833 Đường chuẩn ngày 1800000 f(x) = 167501.17x + 3271.27 R² = 1600000 1400000 1200000 1000000 Diện tích peak, mV.s 800000 600000 400000 200000 0 10 12 Nồng độ, ppm Biểu đồ 3.2 Mối quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích peak ngày 29/09 Bảng 3.4 Đường chuẩn ngày 25/10/2018 Khóa luận tốt nghiệp 30 Nồng độ dung dịch chuẩn, mg/L 0.5 10 Hệ số góc Hệ số chặn Hệ số tương quan Nồng độ chất phân tích, mg/L 0.466838 0.979570 2.008025 4.930633 10.2628295 172202.406 -9167.103 0.999819 Đường chuẩn ngày 2000000 1800000 f(x) = 172202.41x - 9167.1 R² = 1600000 1400000 1200000 Diện tích peak 1000000 800000 600000 400000 200000 0 10 12 Nồng độ Biểu đồ 3.3 Mối quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích peak ngày 25/10 Bảng 3.5 Đường chuẩn ngày 30/10/2018 Nồng độ dung dịch chuẩn, mg/L 0.5 Nồng độ chất phân tích, mg/L 0.632035 1.025682 1.907628 Khóa luận tốt nghiệp 31 10 Hệ số góc Hệ số chặn Hệ số tương quan 4.860979 10.073677 204558.895 -40052.111 0.999584 Đường chuẩn ngày 2500000 2000000 f(x) = 204558.89x - 40052.11 R² = 1500000 Diện tích peak 1000000 500000 0 10 12 Nồng độ Biểu đồ 3.4 Mối quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích peak ngày 30/10 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ tuyến tính Nồng độ dung dịch chuẩn, mg/L 0.5 1.0 2.0 5.0 10 Trung bình Độ lệch chuẩn Độ thu hồi 0.525858 0.997780 2.005532 4.898715 10.121413 0.092 0.025 0.097 0.035 0.125 105.2 99.8 100.3 98.0 101.2 Độ lệch chuẩn tương đối 17.5 2.5 4.8 0.7 1.2 Khóa luận tốt nghiệp 32 Hệ số góc Hệ số chặn Hệ số tương quan 20175.558 22306.620 0.000140 181420.824 -15315.983 0.999745 - Nhận xét bàn luận kết quả: Qua khảo sát kết cho thấy hệ số tương quan tốt theo hàm bậc 1, hàm số y = ax + b với R2 = 0.9997 khoảng nồng độ từ 0,5 đến 10,0 mg/L Đạt hệ số thu hồi từ 99,8% - 113,3% Trong trường hợp mẫu phân tích có hàm lượng bisphenol A lớn khoảng ta phải pha lỗng mẫu để kết phân tích nằm đường chuẩn Nếu mẫu có nồng độ nhỏ ta phải lấy lượng mẫu lớn tiêm thể tích mẫu lớn thiết bị 3.1.3 Khảo sát độ lặp lại phương pháp Bảng 3.7 Độ lặp lại mẫu thêm chuẩn nồng độ 0,5 µg/mL Nồng độ dung dịch Ngày thực nồng độphát Diện tích chuẩn hiện peak Nền mẫu 08/01/209 11/01/2019 15/01/2019 0.01 0.01 0.49 0.49 0.48 0.49 1045 1179 83803 82067 80997 84364 0.5 08/01/2019 11/01/2019 Thời gian lưu 11.44 11.82 11.49 11.44 11.45 11.44 11.51 Khóa luận tốt nghiệp 33 15/01/2018 0.55 0.53 0.54 0.54 0.46 Trung bình, 0.508 Độ lệch chuẩn % Thu hồi % Độ lệch chuẩn tương đối 0.030 101.556 6.001 95848 90974 95909 95169 82350 87942.33 6067.701 6.900 11.5 11.5 11.49 11.49 11.49 11.479 0.026 0.227 Bảng 3.8 Độ lặp lại mẫu thêm chuẩn nồng độ 1,0 µg/mL Nồng độ dung Ngày thực nồng độphát Diện tích Thời gian dịch chuẩn hiện 0.92 0.99 0.96 1.02 1.11 1.08 1.05 1.06 1.05 1.027 0.057 102.667 5.548 peak 156115 168105 162395 176596 191550 187148 187333 189203 185989 178270.444 12317.187 6.909 lưu 11.44 11.44 11.44 11.51 11.51 11.50 11.51 11.49 11.49 11.481 0.030 0.261 08/01/2019 1.0 11/1/2019 15/01/2019 Trung bình, Độ lệch chuẩn % Thu hồi % Độ lệch chuẩn tương đối Khóa luận tốt nghiệp 34 Bảng 3.10 Độ lặp lại mẫu thêm chuẩn nồng độ 5,0 µg/mL Nồng độ dung Ngày thực nồng độphát Diện tích Thời gian dịch chuẩn hiện 4.81 4.81 4.33 5.23 4.63 5.26 5.24 4.58 5.18 4.897 0.325 97.933 6.631 peak 814232 815314 734169 905432 800857 910759 932113 814260 921570 849856.222 65167.014 7.668 lưu 11.43 11.43 11.43 11.50 11.50 11.50 11.49 11.50 11.50 11.476 0.032 0.282 08/01/2019 5.0 11/1/2019 15/01/2019 Trung bình, Độ lệch chuẩn % Thu hồi % Độ lệch chuẩn tương đối Khóa luận tốt nghiệp 35 Bảng 3.10 Độ lặp lại mẫu blank, QC CC Nồng độ Loại mẫu dung dịch chuẩn Mẫu blank - Mẫu QC 2.0 Ngày thực 08/01/209 11/01/2019 15/01/2019 08/01/209 11/01/2019 15/01/2019 Trung bình, 2.0 Trung bình, Độ lệch chuẩn % Thu hồi % Độ lệch chuẩn tương đối độphát 0 2.24 2.11 2.09 2.147 Độ lệch chuẩn % Thu hồi % Độ lệch chuẩn tương đối Mẫu CC nồng 08/01/209 11/01/2019 15/01/2019 Diện tích peak Thời gian lưu - - 379154 365656 371149 371986.33 11.43 11.51 11.49 11.477 0.066 5542.253 0.034 107.333 3.098 1.490 0.296 2.27 384173 11.43 2.17 375671 11.5 2.14 380585 11.51 2.193 380143.000 11.480 0.056 3484.970 0.036 109.667 2.534 0.917 0.310 Nhận xét bàn luận kết quả: Qua kết khảo sát nồng độ cho thấy thời gian lưu cấu tử không sai lệch 0.23% nồng độ 0,5 µg/mL, 0.27% nồng độ 1,0 µg/mL, 0,30 % nồng độ 5,0 µg/mL 0.32% Khóa luận tốt nghiệp 36 mẫu QC, CC Dựa kết khảo sát ta thấy có ổn định mặt thời gian lưu, nhờ sử dụng thời gian lưu để làm yếu tố định danh hợp chất Đối với độ lặp lại tín hiệu: ta thấy có ổn định tương đối kết khoảng nồng độ khác nhau: 6,9% nồng độ 0,5 µg/mL 1,0 µg/mL, 7.668% nồng độ 5,0 µg/mL Sự lặp lại cho phép ta định lượng cách xác sai lệch nồng độ hợp chất mẫu tín hiệu ổn định 3.1.4 Kết khảo sát giới hạn phát (MDL) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp Giới hạn phát giới hạn định lượng yếu tố quan trọng việc đánh gia phương pháp thử Khóa luận tốt nghiệp 37 Bảng 3.11 Khảo sát giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Nồng độ Nồng độ Khối lượng cân chất phân chất phân 2.0236 2.0205 2.0188 2.0204 2.0243 2.0164 2.0239 2.0028 2.0148 tích 0.49 0.49 0.48 0.49 0.55 0.53 0.54 0.54 0.46 tích mg/kg 4.843 4.850 4.755 4.851 5.434 5.257 5.336 5.392 4.566 Trung bình 2.0184 0.5078 5.0316 Độ lệch chuẩn 0.0063 0.0305 0.3037 0.0882 - STT Giới hạn phát thiết bị (IDL) Giới hạn phát phương pháp (MDL), LOD phương pháp Giới hạn định lượng phương pháp (LOQ) = LOD*10/3 - Độ thu hồi 102,7% đạt yêu cầu 80%