BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG CAO ĐẲNG CƠNG NGHIỆP TUY HỊA KHOA CƠNG NGHỆ HĨA    \ BÀI GIẢNG HỌC PHẦN: THỰC TẬP VI SINH VẬT KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG DÀNH CHO SINH VIÊN BẬC CAO ĐẲNG NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT MƠI TRƯỜNG TUY HỊA – 2010 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường CHƯƠNG GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM 1.1 Trang thiết bị cần thiết phòng thí nghiệm 1.1.1 Máy móc a) Nồi hấp vô trùng áp suất cao ( autoclave): Dùng để khử trùng nhiều loại dụng cụ, môi trường ni cấy số ngun liệu khác Nó đạt hiệu cao thiết bị vô trùng sử dụng nước bão hòa áp suất cao để đốt nóng mơi trường b) Tủ sấy: Thiết bị làm kim loại chịu nhiệt Phía bên tủ có nút điều chỉnh nhiệt độ tùy theo yêu cầu sử dụng Nó dùng để khử trùng làm khô loại dụng cụ sắt, thủy tinh có khả chịu nhiệt cao c) Tủ cấy vơ trùng: Đó thiết bị có cấu trúc dạng hộp, kính, có khả vơ trùng nhờ hệ thống đèn tử ngoại phận thổi khí vơ trùng d) Dụng cụ lọc vi khuẩn: Dùng để khử trùng loại môi trường không chịu nhiệt độ áp suất cao e) Tủ ấm: Thiết bị có khả trì nhiệt độ thích hợp cho q trình ni cấy để nghiên cứu đặc điểm sinh lý vi sinh vật g) Máy lắc: Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật cách lắc bình ni theo chiều khác cách đặn để tăng lượng ooxxi hòa tan mơi trường h) Máy li tâm: Máy dùng để tách sinh khối tế bào môi trường nuôi cấy tách tiểu phần có độ lắng khác thành phần tế bào i) Máy đo pH: Dùng để xác định pH môi trường nuôi cấy vi sinh vật k) Cân phân tích: Dùng để định lượng chất trình làm mơi trường nghiên cứu vi sinh vật 1.1.2 Các dụng cụ thiết bị phòng thí nghiệm a) Phiến kính: Dùng làm tiêu nghiên cứu hình thái, sinh lý tế bào b) Lá kính: Dùng để đậy lên vết bôi tiêu giúp cho việc quan sát, nghiên cứu vi sinh vật dễ dàng Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Mơi Trường c) Phiến kính lõm: Phiến kính giúp ta nghiên cứu khả di động, hình thành bào tử đặc điểm sinh sản tế bào vi sinh vật d) Hộp lồng ( đĩa pêtri): Dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy phân lập tế bào vi sinh vật e) Bình tam giác: Dùng để ni cấy, nhân giống, chứa loại mơi trường Nó gồm nhiều loại: 100 ml, 250ml, 500 ml… Trong loại 250 ml sử dụng nhiều g) Que gạt: Dụng cụ để phân lập, tuyển chọn tế bào vi sinh vật h) Que cấy: Gồm có loại que cấy: que cấy đầu tròn, que cấy đầu nhọn, que cấy đầu hình thước thợ Cơng dụng chủ yếu để lấy giống, cấy truyền làm tiêu vi sinh vật i) Các nguyên liệu dụng cụ khác: - Agar: Thường dùng dạng thạch dùng để nấu môi trường - Các loại thuốc nhuộm - Dầu bách hương: Dùng quan sát mẫu vật bội giác có độ phóng đại lớn kính hiển vi - Axeton: Dùng để lau vật kính tiêu có dầu - Vải xơ: Dùng để lọc tiêu làm nút bông: - Giấy lọc - Giấy báo cũ dùng để bao gói dụng cụ - Bông thấm nước - Bông mỡ ( không thấm nước) để làm nút cho ống nghiệm bình tam giác - Các loại dụng cụ để chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật: dao, thớt, xoong nhơm, vá… 1.1.3: Kính hiển vi: Là dụng cụ quan trọng nghiên cứu vi sinh vật Nó cho phép ta quan sát, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý tế bào nhờ khả phóng đại từ hàng chục đến hàng vạn lần hình ảnh mẫu vật quan sát Tùy theo yêu cầu mà người nghiên cứu lựa chọn sử dụng loại kính hiển vi khác a) Kính hiển vi thông thường:Dùng ánh sáng thường từ chiếu lên Kính cho phép ta quan sát nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo sinh lý nói chung tế bào nên sử dụng phổ biến giảng dạy học tập Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường b) Kính hiển vi đen: Cũng dùng ánh sáng thường nhờ cấu trúc đặc biệt kính tụ quang nên ánh sáng chiếu vào mẫu vật từ phía bên Kính cho phép ta nhìn thấy cấu trúc khó quan sát kính hiển vi thường, tiêu không nhuộm màu tiêu tế bào sống c) Kính hiển vi đổi pha: Cũng dùng ánh sáng thường nhờ cấu trúc đặc biệt kính tụ quang, vật kính, thị kính làm đổi pha dao động ánh sáng Kính cho phép ta nhìn thấy rõ cấu trúc nhỏ, rõ nét tiên mao, lớp màng, không bào, ti thể… d) Kính hiển vi huỳnh quang: Dùng chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu nhuộm màu chất huỳnh quang Trong tế bào, cấu trúc khác phát quang với màu sắc khác cho phép ta phân biệt rõ chúng e) Kính hiển vi điện tử: Dùng chùm tia điện tử với độ phân giải cao thay cho ánh sáng thường cho phép nhìn thấy ảnh mẫu vật phóng đại từ 30- 50 vạn lần Có loại: - Kính hiển vi điện tử truyền suốt: Dùng để nghiên cứu đại phân tử sinh học - Kính hiển vi điện tử quét: Dùng để nghiên cứu cấu trúc có kích thước lớn đại phân tử sinh học Tuy nhiên kính hiển vi điện tử thường trang bị tạ phòng thí nghiệm có quy mơ lớn với cán chun mơn có đủ trình độ kinh nghiệm sử dụng 1.2 Quan sát vi sinh vật kính hiển vi 1.2.1 Phương pháp làm tiêu vi sinh vật 1.2.1.1 Phương pháp làm tiêu tạm thời: - Cách làm tiêu giọt ép: + Dùng que cấy ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bơi + Đặt kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không để tạo thành bọt khí.Muốn để mép kính tiếp xúc với phiến kính từ từ hạ kính xuống + Đưa tiêu lên quan sát kính hiển vi - Cách làm tiêu giọt treo: Dùng để theo dõi sinh sản, hình thành bào tử, khả di động phản ứng tế bào vi sinh vật với loại kích thích + Dùng phiến kính đặc biệt có lõm hình tròn + Bơi vazolin quanh phần lõm phiến kính Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường + Cho giọt canh trường lên kính + Thận trọng xoay ngược kính cho giọt canh trường xuống phía đươi đặt lên phần lõm phiến kính - Cách làm tiêu tạm thời có nhuộm màu: a Nguyên tắc: Phương pháp sử dụng thuốc nhuộm khơng độc với vi sinh vật pha loãng nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật sống hoạt động sau nhuộm b Cách nhuộm: + Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh meetylen 0,001% lên phiến kính + Nhỏ giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm + Đậy kính lên giọt dịch + Quan sát tiêu vật kính (x10) (x40) 1.2.1.2 Phương pháp làm tiêu cố định: - Các bước tiến hành làm tiêu cố định: Làm vết bôi: Cố định vết bôi: Các cách cố định : + Cố định nhiệt: + Cố định hóa chất: * Phương pháp phức tạp không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu trúc tế bào không làm đứt tiên mao * Người ta thường dùng hóa chất rượu axeton để cố định vết bôi * Cách cố định: Có thể thực cách sau: Nhúng vết bôi vào rượu Với rượu 95 ngâm vết booit 5-15 phút Với rượu CH3OH ngâm khoảng 2-5 phút Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton phút Nhỏ vài giọt rượu 90-950 lên vết bôi Đốt cháy dập tắt Làm vài lần để khô 1.2.2 Phương pháp nhuộm vi sinh vật 1.2.2.1 Nhuộm màu tiêu cố định a Nguyên tắc: Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường - Sử dụng thuốc nhuộm có khả thẩm thấu qua màng tế bào kết hợp với thành phần khác tế bào thành hợp chất màu đặc trưng bền vững - Tùy theo mục đích nghiên cứu khả bắt màu khác thành phần tế bào mà chọn thuốc nhuộm cách nhuộm cho phù hợp - Có cách nhuộm chính: + Nhuộm đơn: Chỉ dùng loại thuốc nhuộm tiêu + Nhuộm kép: Dùng đồng thời hay nhiều thuốc nhuộm tiêu b) Cách nhuộm đơn: - Đặt tiêu lên cầu thủy tinh ( đặt nằm ngang miệng khay nhân, thủy tinh) - Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziel, để yên từ -2 phút - Rửa vết bơi cách nghiên phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ qua vết bơi đến nước chảy khơng màu - Dùng giấy thấm khô tiêu hơ nhẹ tiêu đèn cồn -Quan sát tiêu vật kính (x40) chuyển sang vật kính (x100) dùng dầu soi c) Nhuộm kép: Việc sử dùng đồng thời loại thuốc nhuộm tiêu cho phép ta quan sát phân biệt cấu trúc dễ dàng - Phương pháp nhuộm Gram : + Nguyên tắc:Dựa khả bắt màu tế bào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iot mà hình thành nên loại phức chât khác  Loại phức chất thứ giữ nguyên màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi xử lý cồn Vi sinh vật có phức chất thuộc loại Gram dương  Loại phức chất thứ hai không giữ màu thuốc nhuộm nên màu xử lý cồn bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất thuộc loại Gram âm.\ + Cách tiến hành:  Làm tiêu bản: * Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi phiến kính ( hai đầu phiến kính) * Dùng que cấy lấy chút khuẩn lạc chúng làm vết bơi theo thứ tự sau:Bên trái phiến kính Bac Subtilis bên phải phiến kính E Coli, phiến kính Bac Subtilis trộn lẫn với E Coli * Để khơ vết bơi khơng khí cố định nhẹ đèn cồn Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường  Nhuộm tiêu bản: * Đặt miếng giấy lọc lên ba vết bôi * Nhuộm tiêu thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc phút * Nhuộm lugol phút * Rửa nước * Tẩy cồn 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn tan hết màu * Rửa nước * Nhuộm bổ sung Fuchsin hay saframin từ 10-30 giây * Rửa nước * Làm khơ soi tiêu với vật kính dầu  Kết quả: * Vết bơi Bac Subtilis màu tím – gram dương * Vết bôi trộn Bac Subtilis với E Coli có màu hồng lẫn màu tím * Vết bơi E Coli có màu hồng – gram âm Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Mơi Trường CHƯƠNG NI CẤY VI SINH VẬT 2.1 Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật 2.1.1 Chuẩn bị dụng cụ Qúa trình chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy bao gồm bước sau: - Xử lý dụng cụ - Bao gói dụng cụ - Khử trùng dụng cụ 2.1.1.1 Xử lý dụng cụ Nguyên tắc chung Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật trong, không bị nứt mẻ Phương pháp xử lý Phương pháp xử lý gồm giai đoạn: trung tính dụng cụ rửa dụng cụ a) Phương pháp trung tính dụng cụ: - Đổ vào bên dụng cụ nước có pH = - Hấp khử trùng dụng cụ 1200C 30 phút nồi hấp - Lấy dụng cụ để nguội kiểm tra pH nước dụng cụ - Nếu nước có pH > tiếp tục ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2% kiểm tra pH = thơi - Rửa kĩ nước nhiều lần dùng b) Phương pháp rửa dụng cụ: * Phiến kính: - Với phiến kính cũ( dùng làm tiêu bản) + Chùi mỡ vazolin phiến kính miếng vải tẩm xilen ngâm tiêu vào dung dịch sunphôbicromat 48h + Ngâm tiêu vào nước xà phòng đun sơi 1h + Rửa nước, để + Ngâm tiêu vào cồn 900 12h + Lau khô chúng vải mịn sấy khơ - Với phiến kính cần kiểm tra độ pH xử lý để đạt độ trung tính * Ống nghiệm: Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường - Với ống nghiệm cũ bị nhiễm khuẩn : + Hấp trùng 1200C 30 phút + Lấy đổ vật phẩm ống nghiệm + Ngâm ống nghiệm vào nước ấm + Rửa ống nghiệm cách: Dùng chổi chấm xà hay tro bếp cọ xát vào thành ống khắp nhiều lần Rửa nước 2- lần Úp ống nghiệm cho thật nước khô Sấy khô 700C - Với ống nghiệm không nhiễm khuẩn hay chứa vi khuẩn khơng gây bệnh khơng phải hấp khử trùng tiến hành rửa * Đĩa pêtri: - Đặt ngữa đĩa petri lòng bàn tay trái - Tay phải dùng dẻ có chấm tro xà bơng xát vào mặt đĩa, khe chân đĩa thành đĩa - Rửa nước -3 lần - Úp nghiêng đĩa giỏ nhựa cho thật khô * Các dụng cụ thủy tinh khác: phễu, chai lọ, bình cầu, bình tam giác - Dùng giẻ với nước xà cọ rửa phần ngoại dụng cụ - Dùng nước xà đặc lắc kĩ để rửa phần dụng cụ - Rửa nước nhiều lần cho để * Nút ống cao su: - Phân loại dụng cụ theo kích thước to, nhỏ, tốt, xấu, hay bẩn - Ngâm loại riêng vào nước ấm ( 50 – 800C) 3- h - Cọ rửa kĩ nước xà - Rửa nước lã nhiều lần - Phơi nắng -3h cất dùng dần 2.1.1.2 Bao gói dụng cụ Nguyên tắc - Dụng cụ bao gói phải đảm bảo khơ - Việc bao gói phải thật kín cẩn thận để dụng cụ sau khử trùng đảm bảo vô trùng lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường Phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm khâu: - Làm nút : cho ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que gạt - Bao gói: cho hầu hết dụng cụ thủy tinh 2.1.1.3 Khử trùng dụng cụ Nguyên tắc - Sau khử trùng cần đảm bảo: + Sự vô trùng tuyệt đối cho vật phẩm dụng cụ + Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật Các phương pháp khử trùng Khi khử trùng nhiệt, tế bào sinh dưỡng vi sinh vật bị tiêu diệt dễ dàng bào tử tồn nhiệt độ Khả chịu nhiệt vi sinh vật phụ thuộc vào: - Tính chất mơi trường - Số lượng tế bào - Độ pH vật định khử trùng Do vậy, để khử trùng nhiệt có hiệu cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp khoảng thời gian ngắn cần thiết để tiêu diệt toàn vi sinh vật bào tử chúng có dụng cụ khử trùng 2.1.2 Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy vi sinh vật 2.1.2.1 Môi trường dinh dưỡng Khái niệm - Các chất dinh dưỡng hợp chất tham gia vào trình trao đổi chất nội bào - Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định độ pH môi trường Các yêu cầu mơi trường dinh dưỡng - Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết - Có độ pH thích hợp - Có độ nhớt định - Khơng chứa yếu tố độc hại - Hồn tồn vơ trùng 10 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 3.2 Thủ tục tiến hành - Cắt nốt sần từ rễ đậu đỗ rữa vòi nước chảy Quan sát nốt sần - Cắt nốt sần thành nửa dao lam Quan sát bên Nghiền nốt sần giữ lam kính tạo vết bơi cách quay lam kính với - Cấy ria vòng que cấy dịch nghiền mơi trường thạch Ni nhiệt độ phòng khoảng ngày - Làm khơ khơng khí lam kính có vết bôi cố định lại nhiệt Nhuộm tiêu tỏng phút xanh methylen Rửa quan sát vật kính dầu - Quan sát sinh trưởng vi khuẩn đĩa Nhuộm đơn xanh methylen So sánh hình thái vi khuẩn tiêu với tiêu chuẩn bị sẵn từ nốt sần 35 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường Bài số : CHUYỂN HÓA LƯU HUỲNH DƯỚI TÁC DỤNG CỦA VI SINH VẬT Mục đích yêu cầu : + Hiểu vai trò VSV việc đảm bảo vòng tuần hồn lưu huỳnh + Vẽ biểu đồ vong tuần hoàn lưu huỳnh xãy cột Vinogradskii Nội dung kiến tập : + Quan sát sinh trưởng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cột Vinogradskii 1.Nguyên lý chung Một hướng nghiên cứu vi sinh vật đất vong tuần hoàn lưu huỳnh Vi khuẩn lam màu tía tham gia vào vòng tuần hồn sinh hóa lưu huỳnh Mặc dù sắc tố quang hợp vi khuẩn lam định sắc tố vi khuẩn, chúng xuất màu nâu có mặt thêm sắc tố quang hợp màu đỏ gọi carotenoit Vi khuẩn quang hợp màu tía xuất màu tía màu đỏ có số lượng lớn carotenoit Vi khuẩn màu tía có sắc tố vi khuẩn Vi khuẩn quang hợp sử dụng sắc tố để sinh điện tử cho tổng hợp ATP sử dụng lưu huỳnh, hợp chất chứa lưu huỳnh, khí hydro phân tử hữu nguồn cung cấp điện tử Phương trình tổng quát cho quang hợp vi khuẩn là: + Một số vi khuẩn dự trữ hạt lưu huỳnh tế bào kết sản xuất ion sulfit Lưu huỳnh dự trữ dùng làm nguồn cung cấp điện tử trình quang hợp, kết tạo sulphat Trong tự nhiên, sunfit hydro sinh từ biến đổi sulphat bị biến đổi thành sunfit huydro giống vi khuẩn chuyển hóa sunfat ( rõ Desulfovibrio) CO mà vi khuẩn quang hợp sử dụng cung cấp trình lên men hydratcacbon mơi trường yếm khí + Kỹ thuật nuôi cấy làm giàu bao gồm phương thức tái tạo môi trường gọi cột Vinogradsky dùng cho tập Chúng ta sử dụng để tăng cường sinh trưởng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh điều kiện yếm khí Một vài loại vi sinh vật thường nuôi cấy phụ thuộc vào phản úng với ánh sáng oxy sẵn có chúng Vật liệu Hỗn hợp bùn (bùn CaCO3, cỏ khô hay giấy CaSO4) ống nghiệm ống đong Que gạt Bùn đất 36 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường Đệm Vinogradsky (NH4Cl, Na2S, KH2PO4, K2HPO4) Giấy nhôm, nguồn sáng Dịch nuôi cấy Psedomonas aecruginosa Thủ tục tiến hành a Xếp chặt hỗn hợp bùn đến 2/3 chiều cao ống nghiệm lớn ống đong Xếp chặt chẽ để hạn chế bọt khí ống b Cẩn thận xếp lớp mỏng bùn đất lên lớp hỗn hợp bùn c Nhẹ nhàng đổ dung dịch đệm xuống cạnh ống đong, ý không làm xáo trộn bề mặt bùn Đổ đầy ống đong đến mức d Đẩy miệng ống giấy nhơm đặt phía trước nguồn sáng Người hướng dân ấn định nguồn sáng khác (ví dụ ánh sáng nóng, huỳnh quang, đỏ xanh) e Quan sát ống thí nghiệm tuần lần tuần Ghi lại xuất khu vực màu sắc Bùn hào khí có màu nâu bùn yếm khí có màu đen.(Hình …) g Sau tuần, chuẩn bị tiêu giọt treo từ vết xanh tím ống Quan sát kính hiểm vi xuất vi khuẩn xem có hạt lưu huỳnh hay không ? 37 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường Bài 3: PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CÁC LOẠI VI KHUẨN Tổng số vi sinh vật hiếu khí 1.1 Nguyên tắc Tổng vi sinh vật hiếu đếm cách đổ ủ điều kiện hiếu khí 300C/72±6 1.2 Mơi trường thiết bị - Dịch pha loãng: Saline Peptone Water (SPW) - Môi trường nuôi cấy: Platecount agar (PCA) - Tủ ấm: 30 ±10C 1.3 Quy trình - Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau đồng hoặt pha lỗng nồng độ thích hợp vào đĩa petri vô trùng, mỗ nồng độ đĩa Trong 15 phút, đỗ vào đĩa 15-20ml môi trường nuôi cấy (PCA) làm nguội đến 45 0C Sau trộn điều mẫu mơi trường nuôi cấy - Nuôi ủ: Các đĩa lật ngược ủ 72±6 30±10C 1.4 Đọc kết Đọc kết có thẻ dùng mắt thường hoạc qua kính lúp có độ phóng đại 2,3 lần để đếm số khuẩn lạc mọc đĩ petri (chỉ đếm đĩa petri có số khuẩn lạc 30-350 khuẩn lạc) sau nhân với hệ số pha lỗng Coliforms - Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 44 ấn lần 4, 1995 1.1 Nguyên tắc Dựa vào lên lên men đường lactose mơi trường thích hợp (thạch Violet red bile) 370C 24 Sau khảng định lại mơi trường canh Brilliant Green Bile Salt Coliforms sinh khí mơi trường 37 0C 24 38 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 1.2 Môi trường thiết bị - Dung dịch Salin Pepton - Thạch Violet red bile (VRBL) - Canh Brilliant Green Bile Salt (BGBL) - Thạch Tryptone Soya (TSA) - Tủ ấn 37±10C 1.3 Quy trình - Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng, sử dụng hai nồng độ pha lỗng liên tiếp Đổ vào mơic đĩa khoản 5ml mơi trường TSA 450C Sau cho mơi trường đơng hồn tồn đổ thên 10-15ml mơi trường thạch VRBL 450C - Nuôi ủ: Các đĩa lật ngược ủ 24±3 37±10C 1.4 Đọc kết Đếm đĩa có số khuẩn lạc 100 sau 24 ni cấy Khuẩn lạc coliforms có màu đỏ tía, đường kính 0.5mm, đơi bao quanh vùng đỏ tủa Tính giá trị trung bình từ độ pha lỗng đê qui số coliform g mẫu 1.5 Khẳng định Cấy riêng khuẩn lạcn nghi ngờ loại vào ống nghiệm chứa môi trường canh BGBL có ống Durham , ủ 37 0C 24 Phản ứng coi dương tính có tạo khí dù ống nghiệm Escherichia coli - Phương pháp: tham chiếu theo TCVN 5287, ấn lần 2, 1994 1.1 Nguyên tắc 39 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường Cấy lượng dịch mẫu vào môi trường tăng sinh (canh Brilliant green bile lactose), lựa khuẩn lạc điển hình mơi trường chọn lọc (EMB) để phép thử sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC) 1.2 Môi trường thiết bị - Dung dịch Saline (SPW) - Canh Brilliant green bile lactose BGBL - Thạch Eosin Methylene Blue Lactose (EMB) - Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP) - Canh Tryptone (hoặc peptone) - Thạch Simmons Citrat - Thuốc thử Methyl red 0,2%, α-naphtol 5%, kovac’s - Dung dịch KOH 40% - Tủ ấm 37±10C, 44±10C 1.3 Quy trình - Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu nồng độ 10 -1 vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường tăng sinh (BGBL), ủ 44,0±0,50C 24 - Cấy phân lập: Sau tăng sinh cấy dịch mẫu từ ống nghiệm có phản ứng dương tính (mơi trường chuyển đục sinh hơi) sang môi trường EMB, ủ 37±1/24 Trên mơi trường EMB: khuẩn lạc màu tím, ánh kim, tròn, bờ điều, đường kính khoảng 0,5mm 1.4 Khẳng định - Chọn ích khuẩn lạc điển hìnhtreen môi trường chọn lọc sang môi trường thạch không chọn lọc (TSA) ủ 37±10C 19-24 - Kết thử nghiệm sinh hóa E coli phù hợp: indol(+), methyl red(+), voges proskauer(-), khẳng sử dụng citrat(-) 1.5 Đọc kết & báo cao 40 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường Phát hay không phát Salmonella - Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 71 ấn lần Năm 1999 1.1 Nguyên tắc - Phương pháp dùng để định tính phát hay khơng phát - Quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua bốn gia đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh, phân lập khẳng định 1.2 Môi trường thiết bị - Canh Peptone đệm (BPW) - Canh Rappaport-Vasiliadis soy peptone - Thạnh Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS) - TSI, TSA - Canh Lysine decarboxylase, Urea phenol red, Manitol Phenol red báe - Bể điều nhiệt ±0.20C - Tủ ấm 37±10C 1.3 Quy trình - Lấy mẫu: Lấy mãu vùng bề mặt rộng tốt - Tiền tăng sinh: trộn 25g mẫu với 225ml nước đệm peptone đệm, đônh nhất băng máy dập mẫu Ủ 37±0,10C từ 18 đến 24 - Phân lập: tu môi trường sinh cấy chuyển khuẩn dịch lên bề mặt môi trường phân lập XLD cho co thể tạo khuẩn lạc tách rời Lật ngược đĩa ủ 37±0,2 0C 24±3 Trên môi trương XLD khuẩn lac Salmonella điển hình trong, nhuốm đỏ thay đổi chất thị môi trường, phần lớn có tâm đen Bao nhận thấy vung môi trường đỏ lớn hay nhỏ 41 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 1.4 Khẳng định Những khuẩn lạc nghi ngờ kiểm tra khảng định thử nghiệm sinh hóa: Lactose (-), Sucrose (-), Glucose (+), Urease (-), Indol (-), Mannitol (+), VP (-), LDC (+), ODC (+) amygdaline (-) 1.5 Đọc kết & báo cáo Phát hay không phát Clostridium perfringens - Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 56 ấn lần Năm 1994 1.1 Nguyên tắc Định lượng Clostridium cánh cấy lượng mẫu biết vào mơi trường thích hợp có chứa ion Fe3+ ion (S2O3)2- ủ 370C 1-2 ngày 1.2 Môi trường thiết bị - Thạch iron sulphite - Dung dich muối peptone pha loãng 1.3 Quy trình - Cấy mẫu: Chuyển 1ml mẫu nồng độ thích hợp vào ống nghiệm Sau đó, đổ 12ml mơi trường thạch iron sulphite vào ống trộn điều mẫu trước môi trường đông lại Sau môi trường đông đổ thêm 2-3ml môi trường thạch iron sulphite lên bề mặt ủ 37±10C 28-48 1.4 Đọc kết - Đếm tất khuẩn lạc đen, xung quanh có quầng đen nhân với nồng độ pha lỗng Virio Cholerae Virio parahaemolyticus - Phương pháp: tham chiếu theo sổ tay phân tích vi sinh FDA , ấn lần 8, năm 1995 1.1 Nguyên tắc 42 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường - Virio Cholerae Virio parahaemolyticus nuôi ủ môi trường lỏng chọn lọc từ dịch khuẩn cấy chuyền sang môi trường rắn chọn lọc khuẩn lạc giống Virio Cholerae Virio parahaemolyticus thử nghiệm phản ứng sinh hóa 1.2 Mơi trường thiết bị - Thạch Thiosulphate citrate Bile salt sucrose (TCBS agar) - Peptone kiềm chứa 1% Nacl (APW) - TSA + 1,5 %Nacl - Tủ ấm 37±10C 1.3 Quy trình + Tăng sinh: Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào túi PE vô trùng Cắt mẫu lớn thành mảnh nhỏ thêm 225 ml nước pepton kiềm APW Dập mẫu phút, ủ 37±1 0C 16-24 + Phân lập đọc kết quả: từ môi trường tăng sinh cấy ria vào môi trường TCBS thạch ủ 37,0 ± 1,00C 18 - 24 + Trên môi trường TCBS thạch khuẩn lạc V cholerae tròn, lớn có đường kính 2-3mm dẹt, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), đậm có viền mờ xung quanh V parahaemolyticus tròn, lớn có đường kính 3-4mm , màu xanh dương 1.4 Thử nghiệm sinh hóa -Khuẩn lạc nghi ngờ TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 1,5% NaCl ủ nhiệt độ 37,0± 1,0oC 18 - 24 + Thử nghiệm sơ bộ: Phép thử Phản ứng tiêu biểu Phản ứng tiêu biểu Virio parahaemolyticus Virio Cholerae TSI K/A K/A Tinh động + + 43 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường Oxydase + + KOH + + Phản ứng tiêu biểu Phản ứng tiêu biểu Virio parahaemolyticus Virio Cholerae 0% NaCl - + 3% NaCl - + 6% NaCl + - 8% NaCl + - 10% NaCl - - Sucrose - + Lactose - - Maninitol + + ONPG - + ADH - - LDC + + Urease - + + Thử nghiệm khẳng định Phép thử Tính chịu mặn Lên men sinh axít từ 1.5 Báo kết Phát hay không phát Staphylococci aureus Coagulase positive - Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 66 ấn lần 3, 1999 44 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 1.1 Nguyên tắc Định lương St aureus Coagulase positive thực cánh cấy trang lượng mẫu biết lên môi trường thạnh Bard Parker, vi khuẩn cho khuẩn lạc đặt trưng Và xác định phản ứng coagulase 1.2 Môi trường thiết bị - Dung dịch Saline Peptone - Thạch Trypton Soya - Thạch Bảid Parker - Canh Brain Heart Infusion (BHI) - Huyết thỏ - Tủ ấn 37±10C 1.3 Quy trình Cấy trang 1ml mẫu vào đĩa đĩa petri lật ngược đĩa ủ 37±1 0C 24±3 48±4 1.4 Đọc kết - Sau 24±3 giờ, môi trường Baird Paker khuẩn lạc Staphylococci aureus Coagulase positive có đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng lồi Mỗi khuẩn lạc có quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh Những khuẩn lạc điển hình đánh dấu mặt sau đĩa tiếp tục ủ thêm 24 - Sau 48 Staphylococci aureus Coagulase positive 1,5-2mm có màu đen, sáng lồi, quanh khuẩn lạc có vùng đục mờ hẹp, tiếp vùng sáng rộng 24mm - Một vài chủng St aureus không tạo quầng sáng bao quanh, vùng đục sát khuẩn lạc có thê khơng có (khuẩn lạc khơng điển hình) Cả hai loại khuẩn lạc điều đánh dấu mặt sau đĩa 45 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 1.5 Khẳng định Cấy khuẩn lạc điển hình khơng điển hình sang mơi trường TSA ủ 37±10C 24 Từ môi trường TSA cấy chuyển vi khuẩn sang ống nghiệm có chứa 0,3ml huyết tương thỏ ủ 37±1 0C kiểm tra hình thành khối đơng sau 1,3,6 24 Kết Dương tinh có hình thành khối đơng Âm tính khơng có hình thành khối đơng 46 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Mơi Trường Bài 4: ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT Dụng cụ nguyên vật liệu 1.1 Dụng cụ: Đĩa petri, cồn 760, nước vô trùng, bình tam giác bình cầu 100, 250, 500, 1000ml Bình tia, lam kính, đèn cồn, thuốc nhuộm, kính hiển vi… Môi trường nuôi cấy chủng giống VSV nghiên cứu Đánh giá đặc tính sinh học theo tiêu: Việc đánh giá đặc tính sinh học vi sinh vật tuyển chọn dựa vào tiêu sau: 2.1 Xác định thời gian mọc VSV Theo phương pháp nuôi cấy môi trường thạch môi trường dung dịch ( tùy giống vi sinh vật) tủ ổn định nhiệt độ 28 -60 0C ( tùy thuộc vào đặc điểm vi sinh vật) Theo dõi thời gian khác từ 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 giờ… Từng thời gian quan sát VSV mọc thời gian nuôi tủ ổn định nhiệt, tính Xác định xem chủng giống thuộc nhóm mọc nhanh hay mọc chậm) 2.2 Xác định kích thước khuẩn lạc đo trực tiếp thước (mm) Do nhiều khuẩn lạc sau tính trung bình trung ( tốt nuôi ngày đo) 2.3 Xác định kích thước tế bào phương pháp đo trực tiếp kính hiển vi Cố định tiêu bản, nhuộm tế bào sau đo dụng cụ đo chuyên dụng kính hiển vi 2.4 Xác định khả thích ứng mơi trường pH khác Bằng phương pháp nuôi cấy trực tiếp mức pH khác nhau, cụ thể là: pH = 4,0 ; pH = 5,0 ; pH = 6,0 ; pH = 7,0 ; pH = 8,0 Cách làm sau: - Pha dung dịch đệm Sorensen 1: + Cân xác 9,078 g KH2PO4 1/15 M + Cân xác 11,876 g Na2HPO4 2H2O hòa tan vào lít nước cất dung dịch Na2HPO4 1/25 M Sau pha dung dịch theo tỉ lệ sau : ( 1000 ml môi trường) 47 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường pH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Tỉ lệ dung dịch (ml) Na2HPO4 KH2PO4 100 95 30 70 80 20 99 pH xác mơi trường tạo nhờ giúp đỡ dung dịch đệm phophat bổ sung vào môi trường vô trùng với số lượng 10% so với thể tích mơi trường - Chuẩn bị mơi trường chun tính chủng vi sinh vật sau pha mơi trường với nồng độ pH khác nhau, đem hấp khử trùng ( 1atm, 20 phút), đỗ đĩa petri( 15- 20 ml/ đĩa petri) Thí nghiệm nhắc lại lần mức pH khác - Môi trường dịch thể cho vào bình tam giác 100 ml ( 50 ml mơi trường dịch thể/ bình tam giác) Cấy ml dịch khuẩn chuyên tính chủng vi sinh vật vào bình tam giác chuẩn bị đưa lên máy lắc (150 vòng/ phút, vòng 48 giờ) Sau lấy 0,05 ml dịch vi khuẩn cấy vào mơi trường thạch ( chuẩn bị trên), dùng que gạt ( khử trùng) gạt dịch vi khuẩn bề mặt thạch Sau đem ni tủ định ơn ( nhiệt độ từ 28- 30 0C) Sau 48 nuôi cấy đưa đếm số lượng khuẩn lạ nồng độ pH khác 2.5 Xác định khả kháng kháng sinh ( khả cạnh tranh) Theo phương pháp ni cấy trực tiếp mơi trường có Streptomixin với nồng độ khác : 300, 500, 600, 800, 1000 mg/1 lít mơi trường Cách làm sau: Pha thuốc kháng sinh theo nồng định sẵn cho vào mơi trường chun tính chủng vi sinh vật ( môi trường khử trùng at, 30’) Sau chia đĩa petri để nguội Cấy 0,05 ml dịch khuẩn chuyên tính chủng vi sinh vật đĩa petri, đem nuôi tủ định ôn (nhiệt độ từ 28 – 300C) Sau ngày nuôi cấy đưa đếm quan sát số lượng khuẩn lạc mọc nồng độ kháng sinh khác MỤC LỤC 48 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM 1.1 Trang thiết bị cần thiết phòng thí nghiệm 1.1.1 Máy móc 1.1.2 Các dụng cụ thiết bị phòng thí nghiệm 1.1.3: Kính hiển vi: 1.2 Quan sát vi sinh vật kính hiển vi 1.2.1 Phương pháp làm tiêu vi sinh vật 1.2.2 Phương pháp nhuộm vi sinh vật CHƯƠNG 2: NUÔI CẤY VI SINH VẬT 2.1 Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật 2.1.1 Chuẩn bị dụng cụ .8 2.1.2 Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy vi sinh vật 10 2.2 Nuôi cấy vi sinh vật .16 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 16 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 20 CHƯƠNG : LẤY MẪU VÀ PHÂN TÍCH VI SINH VẬT 25 3.1 Phương pháp lấy mẫu để phân tích vi sinh vật 25 3.1.1 Xác định số lượng mẫu dụng cụ để lấy mẫu .25 3.1.2 Phương pháp lấy mẫu vận chuyển mẫu .26 3.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật 27 3.2.1 Các bước phân tích 27 3.2.2 Nuôi cấy 28 3.2.3 Tính số lượng vi sinh vật .29 CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CÁC LOẠI VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG 31 Bài 1: Q TRÌNH CHUYỂN HĨA NITƠ DƯỚI TÁC DỤNG CỦA VI SINH VẬT 32 Bài số : CHUYỂN HÓA LƯU HUỲNH DƯỚI TÁC DỤNG CỦA VI SINH VẬT 36 Bài 3: PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CÁC LOẠI VI KHUẨN .38 Bài 4: ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT 47 49 ... Lấy để nguội cho rượu vào 2.2 Nuôi cấy vi sinh vật 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật Nguyên tắc: - Tách rời tế bào vi sinh vật 16 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường - Nuôi... phân lập vi sinh vật dạng khiết Với hầu hết mẫu nghiên cứu, trình phân lập vi sinh vật dạng khiết bao gồm bước sau: - Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu - Phân lập vi sinh vật... dụng môi trường mà vi sinh vật cần phân lập phát triển bình thưòng ( bổ sung chất ức chế loại vi sinh vật khác) b) Phân lập vi sinh vật môi trường đặc đĩa petri - Đối với vi sinh vật hiếu khí