XÁC NHẬN GIÁ TRN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP & ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHƠNG ĐẢM BẢO ĐO TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT ThS Trương Huỳnh Anh Vũ Phòng Vi Sinh Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang: NỘI DUNG 1.  PHÂN LOẠI PHƯƠNG PHÁP 2.  XÁC NHẬN GIÁ TRN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP 3.  MỘT SỐ THUỘC TÍNH CẦN XÁC ĐNNH 4.  ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO 2/20/19 5.  ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM 6.  THỰC HÀNH ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 2/20/19 PHÂN LOẠI PHƯƠNG PHÁP Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : PHÂN LOẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2/20/19 Phương pháp tiêu chuẩn - Phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học chấp nhận rộng rãi giới - Phương pháp thử công nhận hiệu lực phạm vi quốc tế quốc gia áp dụng rộng rãi VD: ISO, FDA, BS, TCVN,… Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : PHÂN LOẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH (tt) 2/20/19 Phương pháp không tiêu chuẩn/phương pháp nội - Phương pháp phòng thử nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn nhà sản xuất thiết bị, phương pháp theo tạp chí, tài liệu chuyên ngành VD: Kit phát hiện, phương pháp phát hiện/định lượng nhanh VSV,… Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 2/20/19 LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP Yêu cầu chung: •  PTN cần lựa chọn phương pháp phân tích có thể cho kết phù hợp với mục đích sử dụng cụ thể, nói cách khác: có thể đưa kết đáng tin cậy trước u cầu cụ thể •  Nếu có nhiều phương pháp thì PTN cần nêu rõ tiêu chí sử dụng loại Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 2/20/19 LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP (tt) ISO 17025 nói gì: Mục 5.4.2 •  PTN phải sử dụng phương pháp, kể phương pháp lấy mẫu, đáp ứng yêu cầu khách hàng thích hợp với phép thử •  Ưu tiên sử dụng phương pháp tiêu chuẩn quốc tế, quốc gia khu vực •  PTN phải đảm bảo sử dụng tiêu chuẩn nhất, trừ khơng phù hợp với mục đích khơng có khả thực •  PTN có thể sử dụng phương pháp thử nội bộ, phương pháp thử khơng tiêu chuẩn thích hợp với mục đích sử dụng phải xác nhận giá trị Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 2/20/19 XÁC NHẬN GIÁ TRN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 2/20/19 XNGTSD CỦA PHƯƠNG PHÁP ? Theo ISO/TR 13843:2000 Quy trình thực để chứng minh phương pháp thử phát hay định lượng vi sinh vật mục tiêu nhóm vi sinh vật phù hợp với độ chụm độ xác Theo ISO 17025:2005 Việc khẳng định kiểm tra cung cấp chứng khách quan yêu cầu xác định cho việc sử dụng cụ thể đáp ứng Kết việc XNGTSD phương pháp sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy kết phân tích Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 2/20/19 “XNGTSD phương pháp phân tích phần khơng thể thiếu muốn có kết phân tích đáng tin cậy” Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 10 2/20/19 CÁC NGUỒN CHÍNH GÂY ĐKĐBĐ TRONG PHÂN TÍCH VI SINH Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 37 MỘT SỐ LƯU Ý KHI ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ 1.  Tính tốn/ước lượng ĐKĐBĐ cần phải phù hợp với mục đích dự kiến phép thử việc sử dụng kết thử nghiệm 2/20/19 2.  Nên tính tốn/ước lượng ĐKĐBĐ nồng độ “chính yếu”, “nhạy cảm” Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 38 2/20/19 ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ TRONG PHÂN TÍCH VI SINH THAM KHẢO ISO/TS 19036:2006 Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 39 NGUYÊN TẮC CHUNG 1.  Số đếm vi sinh thu phép thử số xấp xỉ kết thực 2.  ĐKĐBĐ thị mang tính định lượng độ dao động phân tích kết 2/20/19 3.  ĐKĐBĐ minh họa cho mức giá trị kết báo cáo/ phần mẫu thử 4.  ĐKĐBĐ cho phép đánh giá độ tin cậy kết Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 40 2/20/19 PHẠM VI ÁP DỤNG 1.  Hướng dẫn ước lượng độ không đảm bảo đo cho phương pháp định lượng vi sinh vật thực phẩm kỹ thuật đếm khuẩn lạc 2.  Các dạng thực phẩm cho người, thức ăn gia súc, mẫu môi trường … 3.  Cách tiếp cận tính ĐKĐBĐ dựa “standard deviation of reproducibility of the final result of the measurement ”/ độ lệch chuẩn tái lặp kết đo cuối 4.  Không áp dụng cho trường hợp định lượng kỹ thuật MPN 5.  Đối với phép thử kĩ thuật MPN giới hạn độ tin cậy kết đo 95% (tra bảng) Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 41 CÁCH TIẾP CẬN 1.  Trong phân tích vi sinh thực phẩm, nên chọn cách tiếp cận toàn diện thay cho xác định ĐKĐBĐ qua nhiều bước 2.  Dựa dao động tổng hợp trình phân tích 2/20/19 3.  Trong phân tích vi sinh, nguồn lớn gây độ không đảm bảo đo phát sinh từ việc lấy mẫu 4.  Sự phân bố không đồng vi sinh vật mẫu thử Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 42 ƯỚC LƯỢNG ĐỘ LỆCH CHUẨN TÁI LẶP SR 1.  Độ lệch chuẩn tái lặp nội PTN 2.  Các nghiên cứu thử nghiệm liên phòng 2/20/19 3.  Các chương trình thử nghiệm thành thạo Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 43 NGUYÊN TẮC CHUNG ƯỚC TÍNH SR 1.  Ước tính cho loại vsv đích (hoặc nhóm vsv) 2.  Cho loại mẫu/nền mẫu (hoặc nhóm mẫu) 3.  Ít thực với 10 mẫu 4.  Lặp lại qui trình ngày khác 2/20/19 5.  Ưu tiên cho mẫu nhiễm bẩn tự nhiên 6.  Mẫu chọn cho bao gồm dải nồng độ thử nghiệm hàng ngày Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 44 2/20/19 NGUYÊN TẮC CHUNG ƯỚC TÍNH SR Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 45 ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ Trường hợp chung Độ không đảm bảo đo U, với hệ số phủ k = (tương ứng với mức tin cậy 95%) tính tốn theo cơng thức (1): 0.18861 U =2 S + ∑C 2/20/19 R Trong đó: SR: độ lệch chuẩn độ tái lặp 0.18861/∑C: yếu tố thay đổi phân bố Poisson, ∑C tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 46 ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ (tt) Phân biệt số đếm thấp cao (tùy chọn) Đối với số đếm cao, cơng thức (1) đơn giản hóa thành công thức (2): U = 2S R Giá trị giới hạn, Clim tính theo cơng thức (3): 2/20/19 Clim (log10e ) 1.75 = ≈ −2 S R ((1 − 0.05) − 1) S R Hai trường hợp phân biệt: Nếu ∑C > Clim , sử dụng cơng thức (2) để tính U Nếu ∑C ≤ Clim , sử dụng công thức (1) để tính U Chú ý: Việc tính tốn Clim không cần thiết công thức (1) sử dụng tất trường hợp Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 47 ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ (tt) Biểu diễn độ không đảm bảo đo báo cáo kết thử nghiệm 2/20/19 x cfu/g [10y-U, 10y+U] x cfu/ml [10y-U, 10y+U] Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 48 2/20/19 ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 49 KIỂM TRA TAY NGHỀ KNV (Sr) THỬ NGHIỆM THÀNH THẠO (SR) ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO (U) 2/20/19 THỰC HIỆN MẪU BLANK SỬ DỤNG CHUẨN CHỦNG KHI PHÂN TÍCH Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 50 2/20/19 MỘT SỐ TÀI LIỆU LIÊN QUAN •  ISO/IEC 17025:2005 - General requirements for the competence of testing and calibration laboratories •  AGL 04 (BoA) - Yêu cầu bổ sung để cơng nhận phòng thử nghiệm lĩnh vực Sinh •  ISO/TR 13843:2000 - Water quality - Guidance on validation of microbiological methods •  ISO/TS 19036:2006 (TCVN9332:2012): Hướng dẫn ước lượng độ không đảm bảo đo định lượng “Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations” AMENDMENT 1: measurement uncertainty for low counts Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh Trang : 51