B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO B ộ Y Tế TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM QUỐC CHINH XÂY D ựN G QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CÁC CHẤT MA TÚY TỐNG HỢP AMPHETAMIN VÀ METHAMPHETAMIN TRONG DỊCH SINH HỌC BẰNC SẮC KÝ LỎNG KHố I PHỔ Chuyên ngành: Mã số: Kiểm nghiệm thuốc độc chất 60.73.15 LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC r í- ■>' ' (A s ' Người hướng dẫn: TS Trần Việt Hùng Hà Nội - 2009 LỜ I C Ả M Ơ N Tơi xin bày tở lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Việt Hùng, người trực tiếp hướng dẫn, báo tơi q trình nghiên cứu thực luận văn Tôi xin gữi lời cám ơn chăn thành đến Bart giảm đốc, đồng nghiệp Viện Pháp V Quốc gia, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa Hóa pháp, Khoa Vật lý đo lường nơi công tác thực đề tài tạo điều kiện thuận lợi đế tơi hồn thành nhiệm vụ học tập nghiên cứu thời gian qua Xin trân trọng cám ơn Ban Giám hiệu nhà trường, cảm ơn thầy Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ mơn Phân tích Bộ mơn khác Trường Đại học Dược Hù Nội tạo điều kiện cho thời gian học tập trường Cuối tơi vơ biết ơn gia đình, bạn bè, người thân hết lòng động viên giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 24 thảng 12 năm 2009 Phạm Quốc Chinh MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cám ơn Mục lục Danh mục chữ viết lắt Danh mục hình Danh mục bỏne „ ° Trang ĐẶT VẤN Đ È Chưong 1: TỎNG QUAN LÝ THƯYÉT 1.1 TỎNG QUAN VÈ NHÓM CHẤT A T S 1.2 TỐNG QUAN VẺ AMPHETAM1N VÀ METHAMPHETAMIN 1.2.1 Công thức cấu tạo AM tính chất hóa l ý 1.2.2 Cơng thức cấu tạo MA tính chất hóa lý 1.2.3 Tác dụng dược lý dược động học AM M A 1.3 TỐNG QUAN VẺ CHIẾT PHA RẢN 11 1.3.1 Các loại cột chiết pha rắn thông th n g 13 1.3.2 Chế độ chiết pha ran hỗn hợp (mixed- m ode) 14 1.4 TỔNG QUAN VÈ SẮC KÝ LỎNG KIỈỐI PHỔ .16 1.4.1 Thiết bị sắc ký lỏng khối p h ổ 17 1.4.2 Một số kỹ thuật LC/MS 22 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MA VÀ AM TRONG DỊCH SINH H Ọ C 23 1.5.1 Xử lý m ẫu 23 1.5.2 Các phuong pháp xác đ ịn h 24 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 26 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIHN c ứ u 26 2.2 ĐIỀU KIỆN NGHIÊN c u 26 2.2.1 Hóa chất, thuốc t h ủ 26 2.2.2 Thiết bị dụng c ụ 26 2.3 PHƯƠNG PIỈÁP NG ỈIẺN c ứ u 27 2.3.1 Lấy mẫu bảo quản m ẫu 27 2.3.2 Chuẩn bị mẫu nghiên c u 28 2.3.3 Xử lý m ẫu 29 2.3.4 Định tính định lưọng AM M A 27 2.4 ÁP DỤNG QUY [RÌNH DỀ PHÂN TÍCH MẪU MÁU VÀ NƯỚC TIÊU TI l ự c TÍ; 32 2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ L IỆ U 32 Chương 3: KẾT Q U Ả 34 3.1 KẾT QUA XÂY D ựN G CHƯƠNG TRÌNH LC-MS ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG AM VẢ M A 34 3.1.1 Khảo sát lụa chọn cột phân tích pha đ ộ n g 34 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện khối p h ổ 37 3.1.3 Kháo sát phổ khối AM, MA P H 37 3.1.4 Thiết lập chưong trình LC-MS định tính, định lượng AM M A 40 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PIIẢP 43 3.2.1 Đánh giá tính phù họp hệ thống L C -M S 43 3.2.2 Đánh giá tính chọn lọc phưong pháp 45 3.2.3 Độ tuyến tính độ iặp l i 47 3.2.4 Đánh giá độ phương p h p 50 3.2.5 Đánh giá độ lặp lại 51 3.2.6 Đánh giá hiệu suất c h iết 52 3.2.7 Xác định giói hạn phát giói hạn định lượng 52 3.3 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐẾP1ỈÂN TÍCH MẪU MÁU VÀ NƯ'ỚC TIẾU THỰC T É 54 Chương 4: BÀN L U Ậ N 57 4.1 VỀ QUY TRÌNH CHI ÉT 57 4.2 VÈ LC-MS VÀ THẢM ĐỊNH PHƯƠNG P IIẢ P 57 4.3 VỀ PHẢN TÍCII MẦU TI l ự c TÉ 59 KỂT LUẬN VÀ ĐÈ X U Ẩ T 60 KẾT LUẬN 60 KIẾN N G H Ị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC C H Ữ VIÉT TẤ T AM : Amphetamin ATS : Amphetamin type stimulants Các chất kích thích thần kinh dạnu amphetamin CTPT : Cô nu thức phân tư ESI : KỸ thuật ion hóa bàng phun diện tứ (Electronspray ioni/ation) GC : Sắc kv khí (Gas chromatography) GC-MS : Sốc kí khí khối phổ (Gas chromatographv-Mass spectrometry) LC/MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatouraphy-Mass spectrometry) HPLC : Săc ký lỏnt> hiệu cao (High pcrlbrmance liquid chromatography) LOD : Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ MA Giới hạn định lượng (Limit of quantition) : Methamphetamin MDMA : 3,4-Methvlendioxymcthamphetamin PH : Phcnylephrin MeOH : Methanol RDS : Độ lệch chuủn tương dối (Relative Standard deviation) SD : DỘ lêch chuân (Standard deviation) SIM : Kỹ thuật phân lích chọn lọc ion (Selected lon Monotoring) SPE : Chiết pha ran (Solid phase extraction) TFA : TriHuoroacctic TLPT : Trọng lượng phân tứ OANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình dạng sỗ ma tủy nhóm ATS Hình 1.2 Cơng thức số ATS diến hình Hình 1.3 Con đườnti chun hố cua methamphetamin 10 Hình 1.4 Cơ ché chiót SIM 13 Hình 1.5 Liên kết chất phân tích với hệ chiết mix-mode 15 Hình 1.6 Cơ chế phân tách bànu chế độ chiết pha rắn hồn họp 16 Hình 1.7 Hệ thống LC/MS 17 Hình 1.8 Các phận detector khối p h ố 19 Hình 1.9 Kỹ thuật ESI .21 Hình 1.10 Bộ phân tích bẫy ion tứ c ực 21 Hình 1.11 Bộ phàn tích tứ cực dơn 22 Hình 1.12 Bộ phân tích t 22 Hình 1.13 Bộ phân tích thời uian bav 22 Hình 1.14 Bộ phàn tích cộnti hướng ioncyclotron 22 ITmh 2.15 Máy sắc ký lỏim sư dụng trongnghiên cứu 27 ỉũnh 3.16 Sắc ký dồ cua Pll, pha dộng MeOỈI - TFA 0,05 % (90:10) 35 ỉfình 3.17 Sắc ký đồ cua AM, pha dộng MeOH - TFA 0,05 % (90:10) .35 ỉfình 3.18: sắc ký đồ cua MA, pha động MeOII - TFA 0,05 % (90:10) .36 Hình 3.19 Phố khối MS MS2 cua M A 37 Hình 3.20 Phổ khối MS MS2 cua A M 38 ỉũnh 3.21 Phổ khối MS MS: cua P H 39 Hình 3.22 sắc ký đồ dunc, dịch chuẩn AM, MA PH nồng độ 0,05|ag/ml 41 Hình 3.23 sắc kv dồ AM AM PH nồng độ 0,05|ig/ml sau xử lý 42 Hình 3.24 'rương quan hồi quy tuyến tính diện tích pic nồng độ AM 44 Hình 3.25 Tương quan hồi quy tuyên tính diện tích pic nồng độ MA 45 Hình 3.26 Sac kí đồ mẫu nước tiêu trắng 46 ỈTinh 3.27 sấc ký dồ mẫu nước tiếu có thèm chuẩn AM, MA PH 0,005|ig/ml 46 Hình 3.28 Tương quan quy tuyến tính íiiĩra ti lệ AM/PH nồng độ AM máu 48 Hình 3.29 Tương quan quy tuyến tính ti lệ MA/PH nồng độ AM m u 48 Hình 3.30 Tương quan hồi quy tuvến tính ti lệ AM/PH nồng độ AM nước tiêu 49 Hình 3.31 Tương quan quy tuyến tính tỉ lệ MA/PH nồng độ AM nước tiếu 50 Hình 3.32 sắc ký đồ AM, MA khảo sát LOD LOQ 53 Hình 3.33 sắc ký dồ mẫu máu cua Vũ Duy c 56 Hình 3.34 Sac kv dồ mẫu nưức tiêu Nguyễn Thanh H 56 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Các thông so cúa khôi phô dùne đe xác định AM M A 40 Bảng 3.2 Ket khảo sát dộ lặp lại hệ thống LC-MS 43 Bảng 3.3 Kết khao sát độ tuvến tính AM M A 44 Bảng 3.4 Đường chuẩn cua AM MA máu 47 Bảng 3.5 Đường chuẩn cua AM MA nước tiểu .49 Bảng 3.6 Ket khảo sát độ phương pháp với AM vàMA máu nước tiêu 51 Bảng 3.7 Ket khảo sát hiệu suất chiết cúa AM M A .52 Bảng 3.8 Mầu trực tiếpgưi tới Viện Pháp y quốc g ia .54 Bảng 3.9 Mầu viện Pháp y Quân đội g i 55 ĐẶT VẤN ĐÈ Các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin ATS - Amphetamin Type Stimulants - có bán chấí hóa học amphetamin(AM) dẫn chất amphetamin bị lạm dụng giới ngày tăng Tình hình sản xuất, vận chuyển, bn bán sử dụng chất ma túy ATS trái phép giới Việt Nam ngày trở nên nghiêm trọng Trong năm gần đây, số lượng chủng loại ATS tăng lên đáng kể, amphetamin methamphetamin(MA) ATS sản xuất sử dụng nhiều thực tế Theo thống kê Trung tâm Thông tin ma tuý tổng hợp khu vực Châu Á - Thái Bình Dương (APAIC) Cơ quan phòng chống ma tuý Liên Hợp Quốc (UNODC), giới có khoảng 25 triệu người lạm dụng ma tuý tổng hợp ATS số có tới 60% thuộc khu vực Đông Đông Nam Á Methamphetamin chất nhiều người sử dụng nhất, chiếm khoảng 60% 151 Ở nhiều nước khu vực Đông Đông Nam Á Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan , methamphetamin loại ma tuý bị lạm dụng phổ biến Theo UNODC, năm 2005, Thái Lan thu giữ lượng methamphetamin lớn khu vực với số lượng 15 triệu viên, Lào đứng thứ hai với 4,5 triệu viên Myanmar đứng thứ ba với số lượng thu giữ khoảng 3,5 triệu viên Trong năm gần đây, hoạt động sản xuất methamphetamin bất hợp pháp tập trung nhiều địa bàn Trung Quốc Myanmar thời gian vừa qua, số quốc gia Indonesia, Malaysia Philipin lại có báo cáo cho thấy gia tăng bất thường số vụ bắt giữ ma tổng hợp dạng này.[5J 63 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO • ■ Tiếng Việt Tràn Tử An (2006), Hóa phán tích tập 2, Nxb Y Học, (tr 107-221) Trần Tử An (1997) Độc chất học, Bộ mơn phân tích, độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội,(trl25-130) Trần Tử An, Nsuyễn Văn Tuyền (1982), Bài giảng kiểm nghiêm độc chất, Nxb Y Học,(tr 197-200) Hoàng Thị Nil ọc Mai (2006), Xây dựng quy trình giám định Methamphetamine (MA) 3,4-Methylendioxymethamphetamine (MDMA) nước tiêu người nẹhiện, Luận văn thạc sĩ dược học Văn phòng Tuyên truyền phòng chống ma túy (2009), Những vấn đề vê công tác chông ma túy Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Đám bảo chất lượng thuốc sô phương pháp kiêm nghiệm thnôc, (tr 107-108) Tiếng Anh Anthony c Moffat M David Osselton, Brian Widdop (2004), Clarke's Analysis o f Drugs and Poisons Third edition, volume II, pages 12261228 Barry K Logan (2002), Methamphetamine-effects on human performance and behavior, Pages 134-145 Barry Levine (2002) Principles o f Forensic Toxicology, pages 67-153, 265-286 10 Brain science (2008) addiction and drugs, An Academy o f Medical Sciences working group report 64 11 Chi-Kong Lai, Tint! Lee Kam-Ming Au and Albert Yan-Wo Chan (1997), "Uniform solid-phase extraction procedure for toxicological drug screening in scrum and urine bv I1PLC with photodiode-array detection”, Clinical chemistry, 312-325 12 J.T Codv (1993), “Metabolic precursors to amphetamine and methamphetamine”, For Sci Rev.,5(2), 109-127 13 Drugs analysis section, NISI, Korea (2002), General Drug Screen Analysis From Urine or Plasma 14 Gan BK, Baugh D, Liu RH, Walia AS (1991), “Simultaneous analysis of amphetamine, mcthamphetamine, and 3, 4methylenedioxymethamphetamine (MDMA) in urine samples by solidphase extraction, derivatization, and gas chromatography/mass spectrometry", J Forensic ^/.,36(5): 1331-41 15 Hendrickson I I, Laurenzana E, Owens SM (2006), “Quantitative Determination of Total Methamphetamine and Active Metabolites in Rat Tissue by Liquid Chromatography With Tandem Mass Spectrometric Detection” A APS Journal.: 8(4): E709-E717 DOI 16 J.v.Jackson, M.S.Moss, B.Widdop (1986), Clarke's isolation and Identification o f Drug, pages 763-764 17 Y A King (2009) Forensic Chemistry o f Substance Misuse: A Guide to Druẹ Control 18 Ming-Ren Full, l i-Yu Wu and Tzuen-Yeuan Lin(2005), '‘Determination o f amphetamine and methamphetamine in urine by solid phase extraction and ion-pair liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectromctiyDepartment of Chemistty”, Soochow U n iv e r s ity P.O Box 86-72, Taipei, I'aivvan 65 19 Naresh c Jain, Thomas c Sneath, and Robert D Budd (1974), “Rapid Gas-Chomatoiiraphic Determination of Amphetamine and Methamphetamine in urine’' CLIN.Chem.,20/11,1460-1462 20 D Nutt, L.A Kins,, w Saulsburv and c Blakemore (2007), “Developing a rational scale for assessing the risks o f drugs o f potential misuse”, Lancet., 369, 1047-1053 21 Pat niak, p (2004) Dean's Analytical chemistry>Handbook, 2d ded New York: McGraw-Hill 22 G.F Phillips (1972), '•‘Controlling drugs o f abuse”, Chemistry in Britain, 123-130 23 Randall c Baselt (2000), Disposition o f Toxic Drugs and Chemicals in Man 24 Seung-Woon Mvunga * Hye-Ki Mina, Seungki Kima, Myungsoo Kima, Jin-Byom Chob and Taek-Jae Kimb (1998), “Determination of amphetamine, mcthamphetamine and dimethamphetamine in Human Urine bv Solid-Phase Microextraction (SPME)-Gas Chromato ,raphv/Mass Spectrometry” Journal o f Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Volume 716, Issues 1-2, Pages 359-365 25 Smith, M.A (2003), Principles o f Forensic Toxicology>, Vol-1,2 d ed Washing ton, DC; American Association o f Clinical Chemistry 26 Suzanne Bell (2006) Forensic chemistry 2006 by Pearson education, Inc Pearson Prentice Hall Pearson Hducation,Inc Upper Saddle River, newJersey 07458 27 E.M.Thuman, M.S.Mill (1998), “Solid phase extraction”, Principle and practice, Chemical analys, Volume 147 66 28 United Kingdom Drue, Situation (2007), UK Focal Point on Drugs, Annual Report to the European Monitoring Centre fo r Drugs and Drug Addiction - see Bibliography 29 Zengping Huanga and Shaoyu Zhang (25 July 2003), “Confirmation of amphetamine, methamphetamine, MDA and MDMA in urine samples using disk solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry after immunoassay screening”, Journal o f Chromatography B,Volume 792, Issue 2, Pages 241-247 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Một số hình ảnh cửa sổ Instrument setup đặt điều kiện chạy scan events PHỤ LỤC Tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối vói AM MA PHỤ LỤC Công thức phổ khối cuả số chất lựa chọn làm chuân nội PHỤ LỤC Một số hình phổ phân tích LC-MS PL-1 PHỤ LỤC Một số hình ảnh cửa số Instrument setup đặt điều kiện chạy scan event He LCQA dvantage mÊÊsãễm Hc-tp m\ xjifj □ iBSlal —Ị MS Detecloi Setup ị Sytingt* Pump Ị Diveit Vatve I Contact D osuie Ị SumnuNy I Hưnsettings -£X m4mạm mú segm ents Ị • A w jun e Jime irrnnj: 111 ’J LCO A dvW itsg e To disptay a chiOmniogram heiA US«I LCQ A dv*nt*g«/Op«n raw N» II - - ~ ~ Seainert - tietentiori I.ime (mnj r«Agmatil s*Hir>(Ị* il í irr-,e f>rrMIí | r S c « n fiv « r*» ị-J T u n * £5«tl-.od Scari Event |[ _ J — n W ';\C h ,,L YenUrfathodVMetan J J ị1 S can Event n event settings Scan mode /• MS r s can type: f ts SIM Full -1 RanoefsV M S/M S 11 R 7'rin -1 D9 rin Polarity: r* Positive < Data type: |V Centroid f Af methuiJ I j J l t B i ĩr IStrum e j ị T urwf; RiJ-i - Ms- " i IQualBfO ■■ I (SflMicrAM PL1.2 Hình ảnh cửa số Instrument setup dặt điều kiện chạy scan event dối với Methamphetamin P L -2 Enngaranaag File LCỌ A dvantage _ Q |lS |H ] # Hetp Xị? I ”jp Ị Syringe Pump Ị Divert Valve Ị Ỉ i^- p T0 display a chiomatogtam here, u te LCQ A dvaniage/O pen raw file Retention (ime (mini begm ent I settings Segmeni fctfn*Imn)' Sufveyoi LC Pump |3 Sr:*n events J ~~A ^ T111« method' |n ALC-MS\Chirth - YerA.MethoH^Melan S can Event jf- S can e v e ri ĩettm gĩ Surveyor PDA c FuH MS /MS Abundance 100 % 40 “ 20 ro CD 149.2 149 149 149 149 150 150 150.4 150.6 mil PL.4.1 Sắc ký dồ cua AM, MA khảo sát LOD LOQ 150.8 151.0 PL-9 D:\LC-M SU17-G-09\NT-3_09121712501 ? ;V:'2D09 Tt25:01AM RT- 0.00-9.98 DO 4.57 50 : i 78 U |''|| ; o.w 04 NL: N 2.9ŨE6 T TIC MS NNT-3_09E171E501 4.64 I 4./1 6.52 ■,4 53 09 126 1.65 2.29 3.01 3.33 65 6.60 6.65 II Ậ I j J5 92 7.13 7.82 8.-W 902 N L8.I7E5 87 913 - 0W 46 126 1.6 5 261 3.33 365 6.63 ■ B 429 5 575 7* 18 50 ■ 42 8.14 8.54 4.64 NL 9CE6 TIC F -c E S IS IM ms Ị 149.00-151.00] M S NT-3 iV lB 6.60 ■ 6.84 043 0.59 139 1.79 2.03 274 06 TIC F +cESISiM m s t 13500-137.00] MS N T -3 _09O T !K 01 3.78 1] 556 7 851 88 90 971 N L 149E 665 ] TIC F: +c ESI SIM ms ( Í7 0 -Ĩ9 0 ] MS NT-3 O T 1K : 3 0.56 1.12 1.44 184 29 7.61 8.01 56 304 3.52 99 4.39 82 5.30 562 8.65 9.60 Time(min) NT-3 091217112501 #1 RT: 0.01 AV: N L 7.46 E T: + c ESI S!M ms [ 167.00-169 00] 167.2 167.9 40 20 167.0 168.8 167.2 167.4 167 167 168.0 168.2 168.4 168.6 168.8 m/z PL.4.2, Sac ký mail nước tiểu Nguyễn Thanh H 169.0 P L -10 DÍLC-M SU 17-C-09\M -3_0S 1217114620 t2 /r.2009 11:462 AM R T :4 50 -t).00 75 100 48 40 I -I ] Ỉ4.60 67 83 07 5.31 ’ : 598 = TIC MS M-3_0912Í7H462Ũ 725 V ’: NL: 1.33E6 ; 53 8.69 7.73 781 8.05 909.9.17 9.49 9.81 70 N L 85E5 TIC F +cESISIM m s( : 50 13500-137.00] MS j 4.70 4.94 34 566 5.98 638 „ “ ? 7.49 773 805 821 853 869 9 9.33 9 9.81 M-3_G9t217W620 675 N l ‘ 33E6 ® °; TIC F TC ESI SIM ms I 149OO-'SICOl M S j 60 A fti c fi7 ■ 53 / 71 95 A7 07 64^ b4J 55 794 26 842 914930 8.82 M-3 091217114620 962 9.78 48 NL 9.42E5 TICF:+c ESISIMms [ «7.00-16900] MS M -3_0912Ư11462Ũ 50 ■ 73 45 5.B 5.45 561 84 5.0 55 : 60 65 728 7.44 7.6 _7.92 8.08 8.40 664 8 11 70 75 M 8.5 9.0 967 9.5 Vo Time (min) M-3_0912171 14620 #257 RT: 6.75 AV; NL: 1.12E6 F: + c ESI SIM ms [ 149 00-151.00] 1500 100 cn 20 149.2 150.8 - 149.0 ■ 149 ■ i - Ị - r - - T ^ 149.4 149.6 149.8 150.0 150.2 150.4 I I I 150.6 I i I 150.8 m/z PL.4.3, S ă c k ý d ô m a u n c t i ế u c ủ a V ũ D u y c I - 151.0 ... dựng quy trình xác định ma túy tổng hợp amphetamin methamphetamin dịch sinh học sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) nhằm đưa quy trình chuấn giám định amphetamin methamphetamin máu nước tiểu ứng dụng... thành khối phổ đồ phổ khối Nó cung cấp thơng tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng chất) , xác định cấu trúc định lượng chất r Các phận detector khối phổ Hình 1.8 Các phận detector khối phổ. .. nội dung luận văn gồm phần: Xây dựng chương trình sắc kỷ lỏng khối ph ổ kết hợp chiết pha rắn (SPE) đế định tính, định lượng amphetamin methamphetamin Á p dụng quy trình phương pháp để phân tích