BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ■ ■ BỘ Y TẾ Dược HÀ NỘI ■ ■ LÊ THỊ MINH CHÍNH NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN BRCA1 VÀ BRCA2 CÁC BỆNH NHÂN UNG THƯ v ú VIỆT NAM ■ ■ ■ LUẬN VĂN THẠC s ĩ Dược HỌC CHUYÊN NGÀNH: Dược LÝ-DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 60.73.05 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐINH DUY KHÁNG GS TSKH ĐÁI DUY BAN HÀ NỘI 2003 L Ờ I C Ả M ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành lời cảm ơn sâu sắc tới: TS Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng Vỉ sinh vật học phân tử GS.TSKH Đái Duy BanPhòng Miễn dịch, Viện Công Nghệ Sinh học - người thầy tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ TS Phùng Hồ Bình, phụ trách Phòng Đào tạo sau đại học Trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu; PGS, TS Phạm Quang Tùng, nguyên trưởng phòng đào tạo sau đại học; Phòng Đào tạo sau đại học; thầy Bộ môn Dược lâm sàng; môn thuộc trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập làm luận văn Trong trình thu thập mẫu làm thực nghiệm phòng thí nghiệm, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình có hiệu Tôi xin chân thành cảm ơn: CN Bạch Thị Như Quỳnh, CN Trịnh Quý Bôn, CN Dương Hổng Quân bạn đồng nghiệp phòng Vi sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học - Thạc sĩ Hồng Thị Minh Châu- Phòng Miễn dịch học, Viện Cơng nghệ Sinh học - Khoa giải phẫu Bệnh viện K, Hà Nội Cuối xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến gia đình, tất anh chị đồng nghiệp bạn bè động viền, khuyến khích giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 12 năm 2003 Lê Thị Minh Chính MỤC LỤC PHẨN 1- ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 2- T ồN G QUAN Một số vấn đề ung thư ung thư vú Một số vấn đề ung thư Ung thư vú Dịch tễ học ung thư vú Các yếu tố nguy gây ung thư vú Bệnh sử tự nhiên ung thư vú Chẩn đoán ung thư vú Điều trị ung thư vú Gen BRCA trường hợp ung thư vú Kỹ thuật PCR Real-time PCR Khái quát chung Nguyên lý hoạt động Real-time PCR ứng dụng Real-time PCR Vector tách dòng Khái niệm vector tách dòng Plasmid pCR 2.1 3 4 10 11 12 15 17 17 17 20 22 22 23 PHẨN - NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 Nguyên liệu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Hoá chất, thiết bị Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tách chiết ADN Tách ADN từ sinh thiết ung thư vú Tách ADN từ máu Phương pháp xác định nồng độ độ tinh AND đo quang phổ OD 260/280 Phương pháp điện di Phương pháp PCR Phương pháp tinh chế sản phẩm PCR Phương pháp tạo dòng Gắn ADNvào plasmid 25 25 26 27 27 27 27 28 28 29 30 31 31 32 Tách chiết ADNplasmid từ vi khuẩn E.coli Phương pháp xác định trình tự ADN 32 32 PHẦN - KẾT QUẢ BÀN LUẬN VÀ THựC NGHIỆM KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Kết tách chiết ADN từ sinh thiết khối u, máu bệnh nhân ung thư vú phụ nữ huyết thống Kết tách chiết AND từ mẫu sinh thiết khối u bệnh nhân ung thư vú 36 36 36 Kết tách chiết ADN, từ mẫu máu 15 bệnh nhân ung thư vú 36 mẫu máu chị em gái ruột bệnh nhân 39 Kết thực phản ứng PCR Kết tách dòng Tinh chế đoạn ADN mang đột biến Kết biến nạp ADN Plasmid vào tế bào E.Coli chủng INVaF ’ Kết tách chiết ADN Plasmid từ vi khuẩn E.Coli Kết tinh vector tái tổ hợp Kết xác định trình tự gen 44 47 47 49 Thực phản ứng giải trình tự Kết giải trình tự đoạn ADN mang đột biến 185 delAG exon BRCA Kết giải trình tự đoạn gen mang đột biến 6174 del T exon 11 BRCA 55 57 36 50 54 55 59 Kết thực phản ứng Real time PCR 60 Thực phản ứng Real time PC Kết phát đột biến 185delAG exon BRCA1 60 64 Kết phát đột biến 6174 del T exon 11 BRCA 4.2.BÀN LUẬN CHUNG PHẦN - KET LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ PHẦN - TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN - PHỤ LỤC 65 67 71 73 84 NHŨNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN ADN APS ARN ATP bp BRCA CTP DNTP Acid Desoxyribonucleic Amonium persulfate Acid Ribonucleic Adenine Triphosphat base pair Breast cancer sussepbility gene(gen ung thư vú) Cytosine Triphosphat Hỗn hợp deoxynucleotid triphosphat (dATP+dTTP+dGTP+dCTP) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethidium bromide GTP Guanine Triphosphat Kb Kilo base LB Môi trường thịt để nuôi cấy MWM Molecular weight marker (yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase để nhân đoạn ADN phòng thí nghiêm PMC Prophylactic Contratateral Mastectomy (Phương pháp cắt bỏ tuyến vú lại) PO Prophylactic Oophorectomy (Phương pháp dự phòng cắt buồng trứng) RAPD-PCR Random Amplified Polymorphic ADN(kỹ thuật phân tích ADN nhân ngẫu nhiên) RT-PCR Revers transcriptase- PCR ( phản ứng PCR ngược) SDS Dung dịch Sodium clodecyl sulfate TAE Đệm TAE (Tris-HCl, Boric acid, EDTA-pH8,5) TBE Dung dịch đệm (Tris-HCl, Boric acid, EDTA- pH 8,5) TE Dung dịch đệm TE (Tris-HCl, EDTA) TEDMED Tetramethylenethylen diamin TTP Thimine Triphosphat ƯTV Ung thư vú YAC Yeast Artificial Chromosomes (nhiễm ịỉắc thể nhân tạo nấm men) PHẦN ft ĐẶT VẤN ĐÊ Ung thư vú loại ung thư phổ biến nhiều nước giới Đày nguyên nhân gây tử vong ung thư phụ nữ Tỷ lệ tử vong thay đổi từ 2- 5/100.000 người Nhật Bản, Mêxico, Venezuela đến 25- 35/100.000 người Anh, Đan Mạch, Hà Lan, Hoa Kỳ Canada [10] Tại Việt Nam, theo điều tra ung thư Hà Nội năm 1998, tỷ lệ số người mắc ung thư vú 20,3/100.000 người, đứng đầu loại ung thư nữ Theo thống kê Bệnh viện K, Hà Nội năm 2000, tỷ lệ ung thư vú 17,4/100.000 người Ở tỉnh phía nam, tỷ lệ ung thư vú phụ nữ cao sau ung thư cổ tử cung chiếm tới 27% tất trường hợp ung thư phụ nữ [5], [10] Tỷ lệ ung thư vú giới có chiều hướng gia tăng, tỷ lệ tử vonơ lại có chiều hướng giảm chẩn đốn điều trị sớm Ngồi phương pháp chẩn đốn tế bào học, mơ học, gần phương pháp chẩn đoán sở kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng nhiều nghiên cứu chẩn đoán ung thư vú [3], [11], [17] Hai gen có liên quan mật thiết tới trình phát triển ung thư vú giới nghiên cứu nhiều BRCA1 BRCA2 Có nhiều chứng cho thấy đột biến hai gen làm cho nguy ung thư vú gia tăng [26], [35], [55], [63] Sự đột biến phức tạp, hay gặp đột biến 185 delAG thuộc exon BRCA1 6174 delT thuộc exon 11 BRCA2 [65], [73], [74] Chúng tiến hành đề tài: “N ghiên cứu đột biến gen BRC A1 BRCA2 bệnh nhân ung th vú Việt N am ” để góp phần tìm hiểu mối liên quan ung thư vú đột biến gen BRCA1, BRCA2 người Việt Nam Trong khuôn khổ đề tài tập trung nghiên cứu đột biến điểm 185 delAG thuộc exon BRCA1 6174 delT thuộc exon 11 BRCA2 Đây công trình nghiên cứu nước ta vấn đề Hy vọng kết đề tài giúp hiểu biết thêm mối liên quan số đột biến di truyền với bệnh ung thư vú người Việt Nam, để có biện pháp chẩn đốn, dự phòng gợi mở cho nghiên cứu * PHẦN TỔNG QUAN 2.1 MỘT SỐ VẤN ĐỂ VỂ UNG THƯ VÀ UNG THƯ v ú 2.1.1 Một Số vấn đề ung thư [2], [8], [13] Ung thư bệnh gây tăng sinh nhanh lộn xộn dòng (clone) tế bào bất thường, ly khỏi kiểm sốt chế điều hồ tự động tế bào Hậu tạo thể mô lạ gồm tế bào non, chuyển hố mạnh, lấn át mơ xung quanh gây biến đổi bệnh lý cho toàn thể Theo quan điểm đại, trình ung thư hố chia làm hai giai đoạn: khởi phát tiến triển Giai đoạn khởi phát (initiation) giai đoạn bị yếu tố công vào vật liệu di truyền (ADN) với ngưỡng thấp ngưỡng Giai đoạn tiến triển (promotion) giai đoạn bắt đầu có tế bào u xuất cách thầm lặng Những yếu tố công gây ung thư (carcinogen) rượu, thuốc lá, tia xạ ion hoá , thường tác động nhiều lần với nsưỡng định Giai đoạn nàv kéo dài hàng chục năm khối tế bào ung thư phát triển tới kích thước phát lâm sàng Thơng thường, giai đoạn muộn, thời gian sống người bệnh khơng Trong thời gian gần đây, với phát triển khoa học kỹ thuật y học, nhiều bệnh ung thư phát sớm, điều trị kịp thời kéo dài đáng kể sống người bệnh [5], [11] Năm 1976, Dominique Stehelin (Pháp) với Michael Hazold (Mỹ) tìm thấy tiền gen có khả gây ung thư (protooncogen) người Dưới ảnh hưởng số yếu tố, tiền gen chuyển thành gen gây ung thư (oncogen) Hiện nay, người ta phát 40 loại oncogen [2], [13] Tế bào invitro người bình thường cấy gen gây ung thư chuyển thành tế bào ung thư Quá trình sinh ung thư trình bày tóm tắt hình 2.1 [2] Các yếu tố môi trường độna gồm: - Các tác nhân hoá học - Các tia vật lý Thay đổi gen Các yếu tố tế bào thân di truyền - Các virus gây u H ình 2.1 Sơ đồ trình hình thành ung thư 2.1.2 Ung thư vú 2.1.2.1 Dịch tễ học ung thư vú [5], [ 8], [10] Ưng thư vú (ƯTV) loại ung thư thường thấy phụ nữ, chiếm 25% tỷ lệ tử vong ung thư nước phát triển Tại Mỹ, năm 1998 có 178.000 trường hợp mắc UTV, chiếm 30% tổng số loại ung thư nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai sau bệnh tim mạch Đâv vấn đề sức khoẻ cộng đồng quan trọng nhiều khu vực giới, đặc biệt nước phát triển Theo Parkin D.M, cs., nước phát triển ƯTV đứng hàng thứ số loại ung thư hay gặp, hàng năm có 347.900 trường hợp mắc mới, nước phát triển UTV đứng hàng thứ có 224.200 trường hợp mắc hàng năm Nhìn chung, UTV có tỷ lệ mắc cao nước châu Âu Châu Phi châu Á có tỷ lệ mắc thấp [10] T r u n g MT N a m M ĩ v C a r i b ẻ B z il P u e r t o R ico C o lo m b ia C o s t a R ica ầ c Mĩ Mĩ, d a t r ấ n g Ị B 62 38 s sa m SO.7 E Mĩ d a đ e n C a n a d a 33 Mĩ g ố c N hật Mĩ g ố c T B N C h â u Âu Icelan d P h p , S a s-R h in Italia Đ an M ạch T h ụ y Đ iể n S co tlan d Anh v ả x ứ W a le s P h ấ n Lan N a Uv Đ ông Đức Tây B an Nha Ba Lan T r u n g Đ ỏ n g v a V iễ n Đ ô n g isra e l 4 '7 ,4 Ấn Độ T rung Q u ố c N h ậ t B n ■UBHBliaUH , h â u Đại Đ ơng Niu Di Lãn ~ ỊaM B g B EB B B B B B EB B B SB aB g M 7 , 10 30 40 ÕQ 70 90 H ình 2.2 Tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi (ASR)Ì100.000 dân s ố nước 100 73 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đái Duy Ban Đinh Duy K háng, Trương Nam Hải (1996), “Xét nghiệm phương pháp gen học ứng dụng nghiên cứu chẩn đoán sớm số bệnh nhiệt đới Việt Nam”, Tạp chí Y học Việt Nam (số 210), tr 55-64 Đái Duy Ban Lữ Thị cẩ m Vàn, Đái Thị Ngân Hà, Đái Thị Hằng Nga (1998 ), Phòng bệnh ung thư, Nhà Xuất y học, Hà Nội Đái Duy Ban T rương Nam H ải, Đinh Duy K háng, Phạm Cóng H oạt, Nguvễn Văn Vũ, Đái Thị H ằng Nga, H oàng M inh C hâu, N guyễn Bích Nga, Lê K im Xuvến, Nguyễn T h an h Thuỷ, Đỗ Đức Vân, Nguyễn X uân H ùng, Nguyễn Đ ình Phúc (2003), Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán gen số bệnh ưng thư Việt Nam, Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia vấn đề NCCB Sinh học Viện Công nghệ sinh học Đái Duy B an, Lữ T hị c ẩ m V ân (1996) Cơng nghệ DNA chẩn đốn gen bệnh nhiễm trùng cli truyền, Nhà xuất y học, Hà nội N guyễn Văn Bằng (2001), Phòng, p hát sớm s ố bệnh ung thư thường gặp, Nhà xuất y học, Hà nội Lê T rầ n B ình, P han V ăn Chi, Nông Văn H ải, T rương N am H ải, Lê Q u an g H uấn (2003), Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà nội J 74 Hồ H uỳnh T huỳ Dương (1997), Sinh học phân tứ, Nhà xuất giáo dục, Hà nội Nguyễn Bá Đức (2001), Hướng dẫn thực hành chẩn đoán điều trị s/ ung thư, Nhà xuất y học, Hà nội Nguyễn Bá Đức (2000), Hoá chất điều trị bệnh ung thư, Nhà xuất ị/ y học, Hà nội 10 Nguyễn Bá Đức(2003), Bệnh ung thư vú, Nhà xuất y học, Hà nội ^ 11 Nguyễn Bá Đức (10/2002), “Nhữns tiến điều trị ung V thư”, Tạp chí y học thực hành, số 10 tr 28-30 12 Nguyễn Chấn Hùng, Nguyễn Văn Thiệp, Cung Thị Tuyết Anh, T rần Nguyên Hà( 10/2002), “Điều trị uns thư vú" Tạp chí y học thực v/ hành, số 10, tr 15-16 13 Hiệp hội Quốc tế chống ung thư (1995), cẩ m nang ung bướu, học lảm sàng, Nhà xuất y học, Hà nội 14 Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Phạm Thuý Hồng, Nguyễn T hanh Thuỷ, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban(1996) “Phân lập, tách dòng xác định trình tự gen kháng nsuyên bề mặt vi rút viêm gan B từ khối u bệnh nhân ung thư san” Kỷ yếu 1996, Viện Công nghệ Sinh học, tr 20-25 15 Đinh Duy Kháng, Nguyễn Văn Vũ, Đái Thị Hàng Nga, Nguyễn Thị Nga, Đái Duy Ban (12/1999) “ứng dụns kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) để phát ADN virus viêm san B khối u bệnh nhân ung thư gan”, Báo cáo khoa học Hội nghị CNSH toàn quốc, Viện khoa học Việt nam Lẻ Đình R oanh (2001), Bệnh học khối u, Nhà xuất Y học, Hà nội J 75 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Abeliovich D K ad u ri L, L erer I, W einberg N, A m ir G, Sagi M, Z lotogora J, H eching N, Peretz T (1997), “The founder mutations 185delAG ADN 5382insC in BRCA1 ADN 6174delT in BRCA2 appear in 60% of ovarian cancer ADN 30% of early-onset breast cancer patients among Ashkenazi women”, Am J Hum Genet, 60 (3), p 14 18 Apicella c , ADNrews L, Hodgson s v , Fisher SA, Lewis CM, Solomon E, Tucker K, FriedlADNer M, Bankier A, Southev MC, V enter DJ, H opper JL (2003), “Log odds of carrying an Ancestral * Mutation in BRCA1 or BRCA2 for a Defined personal ADN familv history in an Ashkenazi Jewish woman (LAMBDA)”, Breast Cancer Res 5(6), 206, p 16 19 A usubel F., R B rent, R E Kingston, D.D M oore, J.G Seidman, J A Smith, K S truhl (1995), Short Protocol in Molecular Biology, Copyright by John Wiley & Sons, Inc 20 Bansal A, C ritchfield GC, F ran k TS, Reid JE , Thom as A, Deffenbaugh AM, N euhausen SL(2000), “The predictive value of J BRCA1 and BRCA2 mutation testing”, Genet Test, 4(1) p 45 21 Beillard E, Pallisgaard N, Van Der Velden VH, Bi w , Dee R, Van Der Schoot E Delabesse E, Macintyre E, Gottardi E, Saglio G, W atzinger F, Lion T, Van Dongen J J , HoklADN p, G abert J V- (2003), “Evaluation of cADNidate control genes for diagnosis ADN residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQPCR)-Europe against cancer program”, Leukemia, Epub ahead of print 76 22 Ben David Y, C hetrit A, Hirsh-Yechezkel G, Friedm an E, Beck BD, Beller u , Ben-Baruch G, Fishm an A, Levavi H, Lubin F, M enczer J, P iu B, Struew ing JP, M odan B (2002) “Effect of V/ BRCA mutations on the length of survival in epithelial ovarian tumors” / Clin Oncol., 20(2), p 463 23 Bhattacharyya A, Ear u s , oiler BH, Weichselbaum RR, Bishop DK (2000), ‘'The breast cancer susceptibility gene BRCA1 is V required for subnuclear assembly of Rad51 and survival following treatment with the DNA cross-linkins agent cisplatin”, J Biol Chem, 275(31), p 903 24 Casey G, Plummer s , Hoeltge G, Scanlon D, Fasching c , S tan b rid g e E J (1993), “Functional evidence for a breast cancer growth suppressor gene on chromosome 17”, Hum Mol Genet, 2(11), p 97 25 C lark BA (2000), “Cancer genetics for the clinician: recommendations on screening for BRCA1 and BRCA2 m utations”, Cleve Clin J M ed, 67(6), p 408 26 C ornelisse C J, C ornells R s s, Devilee p (1996), “Genes responsible for familial breast cancer”, Pathol Res Pract, 192(7), p 93 27 Costa c , Pissard s, G irodon E, Huot D, Goossens M (2003), “A one-step real-time PCR assay for rapid prenatal diagnosis of sickle cell disease ADN detection of maternal contamination”, Mol Diagn., 7(1), p 45 28 Deforges L, Soussy CJ, Petit JC , Delchier JC , Tankovic J (2003), “Fast ADN accurate quantitative detection of Helicobacter pylori ADN identification of clarithromycin resistance mutations in H pylori v 77 isolates from gastric biopsy specimens by real-time PCR”, J Clin M ic r o b io l41(10), p 457 29 D iam andis p (1997), “Clinical applications of tumor suppressor genes and oncogences in cancer”, Clin Chim Acta, 257 (2), p 157 30 F ied m an L ,O sterm ey er E.A ,Lynch E.D ,Szabo C I, A nderson L.A,Dowd P,Lee M K ,Row ell S.E,B oydJ,K ing M c (1994), “The search for BRCA1”, Cancer Res., 54(24), p 6374-6382 31 Gil F (1996), “Hereditary breast cancer risk: factors associated with the decision to undergo BRCA testing”, Eur J.C ancer Prev 5(6), p.90 32 G oelen G, Rigo A, Bonduelle M, De G reve J (1999),”BRACA 1/2 gene mutaion testing-based cancer prevention and the moral concerns of different types of patients”, Ann N Y Acad Sci, 889, p 240 33 G oelen G, Teugels E, Bonduelle M, Neyns B, De G reve J (1999), “High frequency of BRCA1/2 germline mutations in 42 Belsian families with a small number of symptomatic subjects”, J M ed Genet, 36 (4), p 304 34 H afner c , Bataille F, M eyer s , Becker B, Roesch A, LA D N thaler M, Vogt T (2003) “Loss of EphB6 expression in metastatic melanoma”, hit J Oncol., 23(6), p 1553 35 H am el N, K o tar K, Fouikes WD (2003),“ Founder mutations in BRCA1/2 are not frequent in Canadian Ashkenazi Jewish men with prostate cancer”, BMC Med Genet., 4(1), p 36 H anfler J, K reuzer KA, L aurisch K, Rayes N, N euhaus p, Schmidt CA, O ettle H (2003), “ Quantitation of cytomegalovirus (hCMV) DNA ADN beta-actin DNA by duplex real-time fluorescence PCR in *- 78 solid organ (liver) transplant recipients”, Med Microbiol Immunol (Bed), 192(4):p 197-204 37 H iguchi R, Dolỉinger G, W alsh PS, G riffith R (2002) “Simultaneous amplification ADN detection of specific DNA J sequences”, Biotechnology ( NY) , 10(4), p 413 38 Hilbe w , Dlaska M, Duba HC, Dirnhofer s , Eisterer w , O berw asserlechner F, M ildner A, Schmid T, K uhr T, Woll E (2003), “Automated real-time PCR to determine K-ras codon 12 mutations in non-small cell luns cancer: comparis’on ^ with immunohistochemistry ADN clinico-pathological features”, hit J Oncol., 23(4), p 1121 39 H irt c , Schuler F, Dolken G (2003), “Minimal residual disease ^ (MRD) in follicular lymphoma in the era of immunotherapy with rituximab”, Semin Cancer Biol, 13(3), p 223-231 40 H ofm ann M A (2003), “ Construction of an infectious chimeric ị classical swine fever virus containing the 5'UTR of bovine viral diarrhea virus ADN its application as a universal internal positive control in real-time RT-PCR”, J Virol Methods, 114(1), p 77-90 41 H ujiun T, L c Brody, S Fan, z H uang and J P L anders (2001), J “Capillary and Microchip Electrophoresis for Rapid Detection of Known Mutations by Combining Allele-specific DNA Amplification with Heteroduplex Analysis”, Clinical Chemistry, 47, p 173-185 42 Ja L, A inpuero s, Seccia L, Bustam ante M , Blanco R, Santibanez E, Reyes JM , O jeda JM (2002), “Frequency of the 185delAG mutation in the BRCA1 gene in Chilean healthy women with family history of breast cancer”, Rev Med ClỉiI, 130(10), p 11131123 v 79 43 Ju n ttila TT, L aato M, V ahlberg T, Soderstrom KO, V isakorpi T, Isola J, Elenius K (2003), “Identification of Patients with Transitional rh Cell Carcinoma of the Bladder Overexpressing ErbB2, ErbB3, or Specific ErbB4 Isoforms: Real-Time Reverse Transcription-PCR Analysis in Estimation of ErbB Receptor Status from Cancer Patients”, Clin Cancer Res 1, 9(14), p 5346-5357 44 Khoo US, C han KY, Cheung AN, Xue w c , Shen DH, Fung KY, Ngan HY, Choy KW , Pang CP, Poon c s , Poon AY, Ozcelik H V (2002), “ Recmrent BRCA1 and BRCA2 germline mutations in ovarian cancer: a founder mutation of BRCA1 identified in the Chinese population”, Hum Mutat, 19(3), p 307 45 Lalle p, De L atour M, Rio p, Bignon Y J (1994), “Detection of allelic losses on 17q 12-a21 chromosonmal region in benign lessions and malignant tumors occuring in a familial context”, Oncogene, (2), p 437-442 46 L aplace-M arieze V, P resn eau N (1999), “Systematic- sequencing of the BRCA-1 coding region for serm-line mutation detection in 70 French high-risk fam ilies” Int.J.Oncol 14 (5), p 971-977 47 Liede A, Karlan BY, Baldwin RL, Platt LD, Kuperstein G, Narod V SA (2002), “Cancer incidence in a population of Jewish women at risk of ovarian cancer”, J Clin Oncol., 20(6), p 1570-1577 48 L lort G, M unoz CY, T user MP, G uillerm o IB, Lluch JR , Bale AE, F ranco MA (2002), “Low frequency of recurrent BRCA1 and BRCA2 mutations in Spain”, Hum Mutat., 19(3), p 307 49 Loiez c , Herwegh s , Wallet F, ArmADN s, Guinet F, Courcol RJ (2003),” Detection of Yersinia pestis in sputum by real-time PCR”, J Clin Microbiol., 41(10), p 4873-4875 v 80 50 M arszalek B, Wisniewski SA, Wojcicki p, Kobus K, Trzeciak W H (2003), “ Novel mutation in the 5' splice site of exon of the TCOF1 gene in the patient with Treacher Collins syndrome”, Am J Mecl Genet 2003, 123A(2), p 169-171 51 M atsuzaki Y (2003), “Detection of influenza virus (RT-PCR assay ADN others”, Nippon Rinsho, 61(11), p 1909-1913 52 M ikula M, Dzwonek A, Jagusztyn-K rvnicka K, Ostrow ski J (2003), “ Quantitative detection for low levels of Helicobacter pylori infection in experimentally infected mice by real-time PCR”, J Microbiol Methods, 55(2), p 351-359 53 M uhlbauer M, Bosserhoff AK, H artm ann A, Thasler W E, Weiss TS, Herfarth H, Lock G, Scholmerich J, HellerbrADN c (2003), “A novel MCP-1 gene polymorphism is associated with hepatic MCP-1 expression ADN severity of HCV-related liver disease Gastroenterology”, 125(4), p 1085-1093 54 M ukaide M, T anaka Y, Katayose s, Tano H, M u rata M, H ikata M, Fujise K, Sakugaw a H, Suzuki K, Z aunders J, N agasawa Y, Toda G, M izokam i M (2003), “Development of real-time detection direct test for hepatitis B virus ADN comparison with two commercial tests using the WHO international standard”, J Gastroenterol Hepatol, 18(11), p 1264-1271 55 M ullineaux LG, Castellano TM, Shaw J, Axell L, Wood ME, Diab s, Klein c , S itarik M, Deffenbaugh AM, G raw SL (2003), “Identification of germline 185delAG BRCA1 mutations in nonJewish Americans of Spanish ancestry from the San Luis Valley, Colorado”, Cancer, 1, 98(3), p 597-602 >L 81 56 M ullis K, Faloona F, S charf s, Saiki R, H orn G, E rlich H (1986) “Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction: Cold Spring Harb Svmp Quant Biol, 51((1), p 263273 57 O rm isto n w (1996), “Hereditary breast cancer”, Eur.J.Cancer Care, (1), p 13-20 58 Poon LL, C han KH, W ong OK, Yam w c , Yuen KY, G uan Y, Lo YM, Peiris JS (2003), “Early diagnosis of SARS Coronavirus infection bv real time RT-PCR”, J Clin Virol, 28(3), p 233-8 59 Rasm ussen TB, U ttenthal A, de Strieker K, Belak s , S to rg aard T(2003), “Development of a novel quantitative real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection of all serotvpes of foot-ADNmouth disease vims”, Arch Virol, 148(10), p 2005-2021 60 Rindi L, Bianchi L, Tortoli E, Lari N, Bonanni D, Garzelli c (2003) “A real-time PCR assay for detection of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates”, J Microbiol M ethod, 55(3) p 797-800 61 Ryu c , Lee K, Yoo c , Seong W K, Oh HB (2003), “Sensitive ADN rapid quantitative detection of anthrax spores isolated from soil samples bv real-time PCR”, Microbiol Immunol, 47(10), p 693-699 62 Sanger F.; Niclen s.; ADN A R Coulson (1977), “DNA sequencing with chain terminating inhibitors”, Proc Natl Acad Sci 74, p 5463 63 S charg D, K untz K M , G arb er JE , W eeks JC (2000), “Life expectancy gains from cancer prevention strategies for women with breast cancer and BRCA1 or BRCA2 m utations”, JAM A, 283 (5), p 617-624 a 82 64 S ch u b ert, Lee M K , M efford, A rgonza RH , M orrow JE , H ull J, D ann JL , K ing MC (1997), “ BRCA2 in American families with four or more cases of breast or ovarian cancer: recurrent and novel mutations, variable expression, penetrance, and the possibility of fam ilies whose cancer is not attributable to BRCA1 or BRCA2”, Am.J Hum Genet, 60 (5), p 1031-40 65 Sibille-Hoang c , Froment o , Joos de ter Beerst A, Lepiece V, H uberlant G, Blauwaert G, Vindevoghel A, Canon JL , Gillerot Y (1998), “BRCAl and BRCA2 mutations in Belgian families with a history of breast and/or ovarian cancer”, Eur J Cancer Prev 7, Suppl 1, p 3-5 66 Solom on J.S., B ru n icard i CF, F riedm an JD (2000), “Evaluation V and treatment of BRCA-positive patients”, Plast Reconstr.Surg, 105(2) p 714-719 67 Stathopoulou A, Gizi A, P erraki M, Apostolaki s , M alam os N, M avroudis D, Georgoulias y , Lianidou ES (2Q03),” Real-Time ** Quantification of CK-19 mRNA-Positive Cells in Peripheral Blood of Breast Cancer Patients Using the Lightcycler System”, Clin Cancer Res 1,9 (14)p 5145-5151 68 Steffensen R, H offm ann K, V anning K (2003), “Rapid genotypins ^ of MBL2 sene mutations using real-time PCR with fluorescent hybridisation probes”, J Immunol Methods, 278(1-2), p 191-199 69 T aylor ER, M organ IM (2003), “A novel technique with enhanced detection ADN quantitation of HPV-16 E l- ADN E2-mediated DNA replication”, Virology, 10;315(1), p 103-109 70 W agner TM, M oslinger R, L an g b au er G, A hner R, F leischm ann E, Auterith A, Friedmann A, Helbich T, Zielinski c , Pittermann K 83 E, S eifert M , O efner p (1997), “Attitude towards prophylactic surgery and effects of genettic counselling in families with BRCA mutations Austrian Hereditary Breast and Ovarian Cancer Group”, Br J Cancer, 82 (7) p 1249-53 71 Wald A, H uang ML, C arrell D, Selke s, Corey L (2003), ^ “Polymerase Chain Reaction for Detection of Herpes Simplex Virus (HSV) DNA on Mucosal Surfaces: Comparison with HSV Isolation in Cell Culture”, JIn fect Dis 188(9), p 1345-1351 Epub2003 72 W ilhelm J, Pingoud A (2003), “Real-time polymerase chain v/ reaction”, Chembiochem, 4(11), p 1120-1128 73 W ooster R, Bignell G ,L an caster J, Swift s , Seal s , M angion J, Collins N, Gregory s , Gumbs c , Micklem G, Barfoot R, Hamoudi R, Patel s , Rice c , Biggs p, Hashim Y, Smith A, Connor F, Arason A, Gudmundsson J, Ficenec D, Kelsell D, Ford D, Tonin p, Bishop D.T, Spurr N.K, Ponder B.A.J, Eeles R, Peto J, Devilee p, Cornelisse c , Lynch H, Narod s , Lenoir G, Egilsson V, Barkadottir R.B, Easton F.F, Bentley D.R, Futreal P.A., A shw orth A, S tra tto n M R (1995), “Identification of the breast cancer susceptibiliy gene BRCA2”; Nature, 378, p 789-792 74 Yazici H, Bitisk o , Akisik E, Cabioglu N, Saip p, M uslumanoglu M, G endon G, Bengisu E, Ozbilen s , Dicer M, T u rk m en s , A n d ru lis IL , Dalay N, Ozcelik H (2000), “BRCAl and BRCA2 mutations in Turkish breast/ovarian families and young breast cancer patients”, Br J Cancer, 83 (6), p 737-742 V PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN LÂY BỆNH PHAM Họ tên STT Tuổi (4) (3) (2) (1) Địa Chẩn Kích đốn thước (5) (6) (7) Số h SƠ Hoàng Thị H 63 Kỳ sơn - Hà Tĩnh K vú trái cm 4712-03 Nguyễn Thị V 47 29 Hàng Đường-HN K vú phải cm 4747-03 Nguyễn Thị X 40 Vĩnh phúc K vú phải 2,5 cm 4732-03 Lẩu Thị D 66 Xn Mai - Hồ Bình K vú phải 1,5 cm 4815-03 Ngô Thị K 48 Sóc sơn- Hà nội K vú trái 25 cm 4691-03 Lê Thị T 40 Nam Hoà- Hà Tinh K vú trái Nguyễn Thị N 40 Mộc Châu- Sơn La K vú phải 2,5 cm 4888-03 Loan Thị D 46 Lạc Sơn - Hồ Bình K vú trái 2,5 cm 4837-03 Nguyễn Thị Kim 54 HNĐT: 8518082 cm 4889-03 1.1* T 10 Nguyễn Kim A 25 1.2* 11 Nguyễn Hoàng 17 1.3* 3.2* K Trần Thị Bích L 26 13 Nguyễn Thị T 51 HNĐT: 5587394 3.1* 14 Lê Thị Minh c 52 HNĐT: 8633184 2.1* 15 Trương Xuân L 52 16 Trương Xuân D 59 17 Nguyễn 27 Hổng N Thị -£■ to•X- 12 HNĐT: 8361284 4.1* 2.2* 18 Lê Thị Vân H 29 19 Đoàn Tường V 54 20 Nguyễn Kim N 41 6.3* 21 Đoàn Tuyết L 50 5.3* 22 Phạm Khánh H 69 6.2* 23 Hoàng Khánh H 39 24 Đoàn Hồng c 40 25 Nguyễn Thị T 48 T K vú trái 26 Đỗ Thị c 27 H 44 K vú trái 28 Phan Thị H 36 29 M 49 30 D 45 31 Sil 32 N 47 33 M (Em) 42 34 Nguyễn Thị L 45 35 p 50 36 L 53 37 Phan Thị M 45 38 Nguyễn Thị N 39 Nguyễn Thị N 40 Vũ Thị T 55 41 Đinh Thị H 50 Hoa Lư-Ninh Bình K vú trái cm 5379-03 42 Vũ Thị T 50 Thị xã Hưng Yên K vú trái cm 818-00 43 Trần Thị X 53 Nam Định K vú phải cm 5182- 03 5.2* HNĐT: 8261697 5.1* HNĐT: 7220666 6.1* 5.4* K vú phải K vú phải K vú trái 44 Nguyễn Thị L 48 Thái Bình K vú trái 45 Bùi Thị s 50 Hà Tày K vú trái 46 Bùi Thị N 40 Móng K vú phải cm 47 Lê Thị T 67 Xuân Đỉnh- Hà Nội K vú trái 2,5cm 5276- 03 48 Đinh Thị H 52 Bắc Giang K vú trái cm 5079- 03 49 Phạm Thị V 74 Hưng Yên K vú trái cm 5330- 03 50 Đinh Thị L 56 Quảng Ninh K vú trái cm 5258- 03 51 Nguyễn Thị H 55 Thái Bình K vú phải 52 Đặng Lan H 33 53 Đỗ Thị p 59 54 Đỗ Thanh T 23 7.2* 55 VũQuỳnh H 14 6.4* 56 Vũ Quỳnh H 09 6.5* 57 Nguyễn Thị Thu 20 12.2* cm 5293-03 3,5 cm 5291-03 5245- 03 3,5 cm 5296-03 4.3* HNĐT: 7184698 7.1* T 58 Lê Thị Thuý N 26 9.5* 59 Trịnh Trang N 23 9.4* 60 Lê Thị Thuý H 48 9.3* 61 Trần Thu H 23 9.2* 62 Lê Thị Thuý H 41 9.6* 63 Lê Thị Thuý H 50 Thanh hoá: 037.855765 9.1* 64 Nguyễn Thị Kim 43 HNĐT: 8646953 8.1* HNĐT: 9323218 10.1* L Đỗ Thị H 50 66 Phạm Thị N 40 67 Phạm Thị Hải Y 33 -XCN OÕ 65 10.2* 68 Đào Thị T 48 69 Đỗ Phương A 24 70 ĐỖ Tú A 23 71 Vũ Thị Tuyết M 64 72 Đinh Vũ Phương 30 HNĐT: 8260058 HNĐT: 8347342 A 73 Lê Thị T 45 ĐT: 0912128030 74 Hồng Thị M 56 0321.916088 75 Ngơ Thị M 26 76 Ngô Thị L 34 033.871611 Ghi chú: • S ố “ * “ biểu thị người cung cấp máu xét nghiệm (bệnh nhân vò người huyết thống) • Có 15 gia đình bệnh nhân tham gia lấy máu xét nghiệm đánh s ố tì đến 15 • Từ 1.1 đến 15.1 bệnh nhân ung thư Còn lại người huyê\ thống với bệnh nhân ung thư ... kinh [10 ] Bảng 2 .1 Tỷ lệ mắc ung thư vú nữ Hà Nội giai đoạn ỉ 996 - 19 99 [10 ] Nhóm < 20 20 -29 30-39 40-49 50-59 60-69 70 -79 > 80 0 ,2 4,3 21 , 1 11 9,7 14 2 ,1 1 12 ,5 11 0,3 24 ,7 tuổi Tỷ lệ mắc 2 .1. 2. 2... BRCA2 Hiếm Cao 13 q 12 -13 Vú nữ, nam, buồng trứng P53 Hiếm Cao 17 p 13 .1 Cowden Hiếm Cao 10 q 22- 23 Vú AR Hiếm Chưa rõ X ql 1. 2 - 12 Vú nam TA Thư n 2 ặp Thấp 1lq 22- 23 Tăng sinh lympho Sarcom vú, thư ng... dòng Plasmid pCR 2 .1 3 4 10 11 12 15 17 17 17 20 22 22 23 PHẨN - NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 Nguyên liệu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Hoá chất,