ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM THỊ HỒNG LOAN NGHIÊN CỨU TÁI SINH ĐA CHỒI IN VITRO CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM THỊ HỒNG LOAN NGHIÊN CỨU TÁI SINH ĐA CHỒI IN VITRO CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L.) Ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 8.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Thái Nguyên, tháng năm 2018 Tác giả Phạm Thị Hồng Loan i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, em nhận quan tâm giúp đỡ nhiều cá nhân quan đơn vị Nay luận văn hoàn thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ em q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Trong trình nghiên cứu, em nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng Cơng nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Em xin chân thành cảm ơn thầy, giáo Bộ môn Sinh học đại Giáo dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để em thực trình nghiên cứu Em xin bày tỏ lòng biết ơn Ban chủ nhiệm khoa, thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện giúp đỡ em trình học tập thực luận văn Cuối em xin chân thành cảm ơn người thân gia đình bạn bè giúp đỡ động viên em suốt thời gian học tập Thái Nguyên, tháng năm 2018 Tác giả Phạm Thị Hồng Loan ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Diệp hạ châu 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái phân bố sinh thái Diệp hạ châu 1.1.3 Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu 1.1.4 Tác dụng số thành phần hóa học Diệp hạ châu 1.1.5 Một số thuốc dân gian từ Diệp hạ châu 1.2 Quy trình nhân giống in vitro 1.3 Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng ni cấy mơ thực vật 11 1.3.1 Auxin 12 1.3.2 Cytokinin 13 1.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy dược liệu kĩ thuật nuôi cấy in vitro 14 1.4.1 Tình hình ni cấy in vitro dược liệu giới 14 1.4.2 Tình hình ni cấy in vitro dược liệu Việt Nam 16 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu, hoá chất 19 iii 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 19 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Pha môi trường nuôi cấy 19 2.2.2 Khử trùng hạt 20 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ kết hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin auxin đến phát sinh chồi, sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 20 2.2.4 Nghiên cứu môi trường tạo rễ 21 2.2.5 Nghiên cứu giá thể đưa tự nhiên 22 2.2.6 Xử lí tính tốn số liệu 23 2.3 Điều kiện thí nghiệm 23 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết khử trùng hạt 24 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến phát sinh chồi, sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 26 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đọan thân mang mắt chồi bên 26 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 28 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP NAA, BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 30 3.3.1 Ảnh hưởng kết hợp BAP NAA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên 31 iv 3.3.2 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên 33 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA, IBA đến khả rễ chồi Diệp hạ châu ống nghiệm 34 3.4.1 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Diệp hạ châu 35 3.4.2 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi Diệp hạ châu 36 3.5 Kết ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng vườn ươm 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC v DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine CS : Cộng CT : Công thức ĐC : Đối chứng DNA : Deoxyribonucleic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid Kinetin : 6-furfurylaminopurine MS : Murashige Skoog, 1962 NAA : Naphthalene acetic acid iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết khử trùng hạt (sau 10 ngày) 24 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 27 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 29 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l NAA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 33 Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ (sau tuần) 35 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ (sau tuần) 37 Bảng 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng Diệp hạ châu (sau 45 ngày) 39 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Diệp hạ châu Hình 3.1 Ảnh hưởng BAP 1,0mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng kinetin 1,0mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 30 Hình 3.3 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l NAA 0,8mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 32 Hình 3.4 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l IBA 0,8mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 34 Hình 3.5 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ (sau tuần) 36 Hình 3.6 Rễ Diệp hạ châu môi trường bổ sung IBA 0.5mg/l (sau tuần) 38 Hình 3.7 Cây Diệp hạ châu chậu (45 ngày) 39 vi khác Chúng sử dụng kết hợp BAP với hai đại diện của nhóm auxin NAA IBA để kích thích hình thành chồi từ đoạn thân 3.3.1 Ảnh hưởng kết hợp BAP NAA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên NAA chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo, có tác dụng mạnh ni cấy mơ thực vật Tỉ lệ auxin/cytokin quan trọng việc hình thành hình thái hệ thống nuôi cấy in vitro Tỉ lệ auxin/cytokin nhỏ kích thích chồi phát triển [9] Vì vậy, chúng tơi kết hợp nồng độ BAP 1,0mg/l với NAA 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l Sau 4, tuần nuôi cấy thu kết bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l NAA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Nồng độ NAA (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi Chất lượng chồi Sau tuần 2,73 ± 0,13 1,77 ± 0,05 3,50 ± 0,12 +++ 0,2 2,63 ± 0,16 1,73 ± 0,08 3,40 ± 0,11 +++ 0,4 2,43 ± 0,10 1,60 ± 0,06 3,23 ± 0,08 +++ 0,6 2,03 ± 0,14 1,52 ± 0,08 3,20 ± 0,10 +++ 0,8 1,53 ± 0,11 1,38 ± 0,05 3,10 ± 0,12 ++ Sau tuần 3,00 ± 0,11 3,72 ± 0,18 6,47 ± 0,18 +++ 0,2 2.93 ± 0,17 2,93 ± 0,18 6,33 ± 0,22 +++ 0,4 2,63 ± 0,14 2,77 ± 0,17 6,03 ± 0,23 +++ 0,6 2,20 ± 0,17 2,68 ± 0,17 5,76 ± 0,20 +++ 0,8 1,70 ± 0,14 2,13 ± 0,17 5,20 ± 0,18 ++ Chú thích: +++: chồi tốt; ++: chồi trung bình 31 Bảng 3.4 cho thấy, sau tuần kết hợp BAP NAA không làm tăng hiệu phát sinh chồi Các cơng thức có bổ sung NAA cho số chồi/mẫu, chiều cao chồi, số lá/chồi thấp đối chứng Môi trường bổ sung BAP 1,0mg/l số chồi/mẫu 3,00 chồi Sau bổ sung kết hợp BAP 1,0mg/l với NAA số chồi giảm rõ rệt Kết sau tuần nuôi cấy, môi trường bổ sung NAA nồng độ 0,2: 0,4; 0,6; 0,8mg/l tỉ lệ chồi/mẫu tương ứng đạt 2,63; 2,43; 2,03; 1,53 Sau tuần nuôi cấy tỉ lệ đạt 2,93; 2,63; 2,20; 1,70 Qua thời điểm lấy kết cho thấy, công thức bổ sung BAP 1,0mg/l không bổ sung cho số chồi/mẫu tốt Khi bổ sung NAA tỉ lệ chồi/mẫu thấp hẳn, chứng tỏ trình tạo chồi bị ức chế kết hợp với NAA Như vậy, môi trường MS bổ sung BAP 1,0mg/l + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l, pH = 5,8 thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên A BAP 1,0mg/l B BAP 1,0mg/l, NAA 0,8mg/l Hình 3.3 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l NAA 0,8mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 32 3.3.2 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên IBA loại auxin tổng hợp nhân tạo IBA thích hợp nuôi mô tế bào thực vật, giai đoạn tạo chồi kết hợp IBA với nhóm cytokinin cho số chồi/mẫu đạt kết cao [17] Tương tự kết hợp BAP với NAA, chúng tơi thăm dò kết hợp BAP 1,0mg/l IBA nồng độ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8 mg/l Kết sau 4, tuần nuôi cấy thu bảng 3.5 Kết bảng 3.6 cho thấy, kết hợp BAP IBA làm giảm số chồi/mẫu so với đối chứng Tỉ lệ số chồi chồi/mẫu môi trường bổ sung IBA nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8mg/l cho kết sau 4, tuần tương ứng đạt 2,60; 2,40; 2,27; 1,97 2,70; 2,53; 2,37; 2,07 chồi Mặt khác, bổ sung IBA chiều cao chồi số lượng thấp đối chứng Chiều cao chồi số lá/chồi sau tuần công thức nồng độ IBA 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 mg/l 3,39; 2,98; 2,81; 2,71 chồi 6,23; 5,90; 5,63;5,30 Chất lượng chồi thí nghiệm đánh giá từ đến tốt Trong cơng thức bổ sung 0,6mg/l IBA cho chất lượng chồi trung bình, 0,8mg/l IBA cho chất lượng chồi Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Nồng độ IBA (mg/l) Số chồi/mẫu 0,2 0,4 0,6 0,8 2,73 ± 0,13 2,60 ± 0,15 2,40 ± 0,16 2,27 ± 0,16 1,97 ± 0,18 0,2 0,4 0,6 0,8 3,00 ± 0,11 2,70 ± 0,14 2,53 ± 0,17 2,37 ± 0,19 2,07 ± 0,17 Chiều cao chồi (cm) Sau tuần 1,77 ± 0,05 1,72 ± 0,05 1,66 ± 0,06 1,60 ± 0,05 1,53 ± 0,05 Sau tuần 3,72 ± 0,18 3,39 ± 0,19 2,98 ± 0,18 2,81 ± 0,17 2,71 ± 0,16 Số lá/chồi Chất lượng chồi 3,50 ± 0,12 3,40 ± 0,13 3,27 ± 0,11 3,13 ± 0,10 3,07 ± 0,09 +++ +++ +++ ++ + 6,47 ± 0,18 6,23 ± 0,20 5,90 ± 0,22 5,63 ± 0,23 5,30 ± 0,24 +++ +++ +++ ++ + Chú thích: +++: chồi tốt; ++: chồi trung bình; +: chồi 33 Vậy kết hợp BAP IBA không làm tăng hiệu phát sinh chồi Các cơng thức có bổ sung IBA cho số chồi/mẫu, chiều cao chồi, số lá/chồi thấp đối chứng Môi trường bổ sung BAP 1,0mg/l số chồi/mẫu 3,00 chồi Sau bổ sung kết hợp BAP 1,0mg/l với IBA số chồi giảm rõ rệt So sánh kết bảng 3.2, 3.4 bảng 3.5 nhận thấy, công thức tối ưu cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mang mắt chồi bên môi trường MS + BAP 1,0mg/l + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5g/l, pH = 5,8 Hình 3.4 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l IBA 0,8mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA, IBA đến khả rễ chồi Diệp hạ châu ống nghiệm Trước đưa chồi Diệp hạ châu đất trồng, chồi Diệp hạ châu phải trải qua giai đoạn tạo rễ Kích thích tạo rễ khâu cuối của q trình ni cấy in vitro Các chồi Diệp hạ châu có chiều cao - 3cm, xanh, chồi sinh trưởng phát triển bình thường chuyển sang môi trường rễ để hồn thiện q trình nhân giống in vitro Trên mơi trường MS, chất kích thích sinh trưởng cảm ứng rễ sử dụng IBA NAA 34 3.4.1 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Diệp hạ châu NAA chất kích sinh trưởng thuộc nhóm auxin NAA đưa vào mơi trường nuôi cấy thúc đẩy sinh trưởng giãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ [17] Đây giai đoạn quan trọng, định thành cơng q trình ni cấy in vitro Chồi Diệp hạ châu phải có rễ có khả tự hút chất dinh dưỡng để sinh trưởng phát triển môi trường tự nhiên Chồi Diệp hạ châu nuôi cấy môi trường bổ sung kích thích sinh trưởng NAA nồng độ 0,1mg/l; 0,3mg/l, 0,5mg/l; 0,7mg/l sau tuần nuôi cấy thu kết bảng 3.6 Qua bảng 3.6 cho thấy, mơi trường bổ sung NAA có tỉ lệ chồi rễ số rễ/chồi tăng so với công thức đối chứng Số lượng rễ/chồi sau tuần tuổi môi trường bổ sung NAA 0,1mg/l; 0,3mg/l, 0,5mg/l; 0,7mg/l tương ứng 2,70; 3,50; 5,00; 3,67, chiều dài rễ: 1,64; 2,21; 1,97; 1,86; 1,83cm Công thức cho số lượng rễ nhiều NAA 0,5mg/l đạt 5,00 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 3,91cm Khi bổ sung NAA 0,1mg/l; 0,3mg/l, 0,5mg/l; 0,7mg/l cảm ứng tạo rễ 55,56; 70,00; 86,67; 61,11%, môi trường đối chứng tỉ lệ rễ 32,22% Tại nồng độ NAA 0,5mg/l tỉ lệ phần trăm rễ cao đạt 86,67%, Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ (sau tuần) Nồng độ NAA (mg/l) Tỉ lệ chồi rễ (%) 32,22 ± 1,11 Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) Chất lượng rễ 1,60 ± 0,32 1,02 ± 0,18 RK 0,1 55,56 ± 1,11 2,70 ± 0,31 2.67 ± 0,26 RTB 0,3 70,00 ± 1,92 3,50 ± 0,33 3.06 ± 0,22 RT 0,5 86,67 ± 1,93 5,00 ± 0,37 3.91 ± 0,29 RT 0,7 61.11 ± 0,11 3,67 ± 0,32 2.46 ± 0,27 RTB Chú thích: RK: Rễ Kém; RTB: Rễ trung bình 35 Chất lượng rễ thí nghiệm đánh giá từ mức đến mức tốt Khi bổ sung NAA 0,3mg/l; 0,5mg/l chất lượng rễ tốt Khi bổ sung NAA 0,7mg/l chất lượng rễ xuống trung bình cơng thức đối chứng Kết hợp tỉ lệ chồi rễ, số rễ/chồi, chiều dài rễ chất lượng rễ đến kết luận: Cơng thức có bổ sung NAA 0,5mg/l vào môi trường MS : đường 30mg/l+ agar 8,5mg/l, pH = 5,8 thích hợp thí nghiệm A NAA 0mg/l B NAA 0,5mg/l Hình 3.5 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ (sau tuần) 3.4.2 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi Diệp hạ châu IBA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin IBA có tác dụng tạo rễ nuôi cấy in vitro nhiều đối tượng thực vật [17] Chồi dừa Diệp hạ châu có kích thước - 3cm cấy chuyển sang môi trường rễ, môi trường bổ sung IBA với nồng độ khác Sau tuần, kết cụ thể bảng 3.7 Kết bảng 3.7 cho thấy, tỉ lệ rễ nồng độ IBA 0,1; 0,3; 0,5; 0,7mg/l 44,44; 54,44; 74,45; 56,67% Tỉ lệ % rễ cao nồng độ IBA 0,5mg/l đạt 74,45% Tỉ lệ % rễ giảm dần nồng độ IBA tiếp tục tăng 36 Chỉ tiêu quan trọng đánh giá mơi trường tạo rễ thích hợp số rễ/chồi Trên môi trường IBA 0,1; 0,3; 0,5; 0,7mg/l số rễ/chồi tương ứng là: 2,33; 3,23; 3,97; 3,30 Số lượng rễ/chồi cao đạt 3,97 môi trường bổ sung IBA 0,5mg/l chiều dài rễ 3,46cm Tỉ lệ giảm nồng độ IBA tăng lên 0,7 mg/l Bảng 3.7 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ (sau tuần) Nồng độ Tỉ lệ chồi rễ Số Chiều dài rễ IBA (mg/l) (%) rễ/chồi (cm) 32,22 ± 1,11 1,60 ± 0,32 1,02 ± 0,18 RK 0,1 44,44 ± 2,93 2,33 ± 0,30 2,13 ± 0,24 RTB 0,3 54,44 ± 1,11 3,23 ± 0,31 2,82 ± 0,23 RTB 0,5 74,45 ± 2,22 3,97 ± 0,36 3,46 ± 0,26 RTB 0,7 56,67 ± 1,93 3,30 ± 0,30 2,28 ± 0,28 RTB Chất lượng rễ Chú thích: RK: Rễ kém; RTB: Rễ trung bình Chất lượng rễ thí nghiệm đánh giá từ mức đến mức trung bình Ở mơi trường có bổ sung IBA 0,1; 0,3; 0,5; 0,7mg/l chất lượng rễ trung bình rễ công thức đối chứng Kết hợp tỉ lệ chồi rễ, số rễ/chồi, chiều dài rễ chất lượng rễ đến kết luận, phạm vi thí nghiệm mơi trường MS có bổ sung IBA 0,5mg/l; đường 30mg/l; agar 8,5mg/l thích hợp cho chồi Diệp hạ châu tạo rễ So sánh bảng 3.6 3.7, môi trường bổ sung IBA 0,5mg/l cho kết thấp môi trường bổ sung NAA 0,5mg/l tỉ lệ chồi rễ, số lượng rễ, chiều dài rễ chất lượng rễ Ở môi trường bổ sung NAA 0,5mg/l số rễ chồi 5,00 126% so với môi trường bổ sung IBA 0,5mg/l (3,97 rễ/chồi) Sự khác có ý nghĩa (Fa (4,02) > Fcrit (4,00) Như phạm vi nghiên cứu, môi trường thích hợp tạo rễ chồi Diệp hạ châu môi trường MS bổ sung NAA 0,5mg/l + đường 30g/l + agar 8,5g/l, pH = 5,8 cho tỉ lệ chồi rễ đạt 86,67%, số rễ/chồi 5, chiều dài rễ đạt 3,91 cm, chất lượng rễ tốt 37 Hình 3.6 Rễ Diệp hạ châu mơi trường bổ sung IBA 0.5mg/l (sau tuần) 3.5 Kết ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng vườn ươm Chọn Diệp hạ châu sau ni cấy in vitro có rễ dài, khỏe, xanh, thời kì sung sức để đưa môi trường tự nhiên Tiêu chuẩn con: kích thước khoảng 5- 6cm, rễ dài khoảng - 4,5cm, số đạt - 10 Để đưa ni cấy ngồi mơi trường tự nhiên việc lựa chọn giá thể quan trọng Giá thể cho tỉ lệ sống cao, sinh trưởng, phát triển tốt giá thể phù hợp tạo điều kiện cho phát triển sau Chúng thử nghiệm loại giá thể đánh giá kết tỉ lệ sống sinh trưởng sau 45 ngày Kết bảng 3.8 cho thấy, với môi trường đất thịt tỉ lệ sống trung bình đạt 62,78%, chiều cao ban đầu mang trồng trung bình đạt khoảng -6cm, sau 45 ngày chiều cao khoảng 8,43 cm Đối với đất pha cát tỉ lệ sống cao đạt 85,00%, tăng trưởng nhanh sau 45 ngày chiều đạt 14,11cm Khi loại đất hỗn hợp đất thịt, phù sa, pha cát, loại đất tơi xốp, sinh trưởng nhanh, tỉ lệ sống đạt 72,22% Chiều cao sau 45 ngày đạt 11,46cm 38 Khi kiểm tra hàm hàm Anova: Single Factor với mức sai số 0,05 thuộc phần mềm Data analysis để xử lý số liệu cho thấy kết chiều cao thu thực khác độ tin cậy 95%: FA = 61,89 , Fcrit = 3,10 (FA > F crit) Bảng 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng Diệp hạ châu (sau 45 ngày) Công thức Tỉ lệ sống Chiều cao Giá thể (%) (cm) Đất thịt trung bình 62,78 ± 3,09 8,43 ± 0,19 Đất thịt trung bình + Cát (2:1) 85,00 ± 1,67 14,11 ± 0,37 Đất thịt + phù sa +cát 72,22 ± 2,22 11,46 ± 0,47 1(ĐC) Trong phạm vi thí nghiệm, giá thích hợp đưa ngồi vườn ươm đất thịt trung bình pha cát (2:1) cho tỉ lệ sống cao khả sinh trưởng phát triển tốt A Đất thịt trung bình B Đất thịt trung bình + Cát (2:1) Hình 3.7 Cây Diệp hạ châu chậu (45 ngày) 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Khử trùng hạt Diệp hạ châu dung dịch javen (60%) thời gian 10 phút cho hiệu cao Mơi trường thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l; agar 8,5g/l; BAP 1mg/; pH = 5,8 Mơi trường thích hợp cho tạo hồn chỉnh mơi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l; agar 8,5g/l; NAA 0,5mg/l; pH = 5,8 Giá thể thích hợp cho Diệp hạ châu sinh trưởng giai đoạn vườn ươm đất thịt trung bình pha cát (2:1) Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình tái sinh đa chồi in vitro Diệp hạ châu để ứng dụng chuyển gen nâng cao hàm lượng dược chất 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngơ Xn Bình, Bùi Bảo Hồn, Nguyễn Thị Thúy Hà (2003), Giáo trình Cơng Nghệ Sinh học, Nxb Nơng Nghiệp Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học Võ Văn Chi (2000), Cây thuốc trị bệnh thông dụng, Nxb Thanh Hóa Nguyễn Việt Cường, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Hà Thị Mỹ Ngân, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2013), “Nghiên cứu ảnh hưởng số chất hữu bạc nitrat (AgNO3) lên sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha ET Grushv.) nuôi cấy in vitro”, Báo cáo khoa học – Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, tr 727-731 Bùi Xuân Dương (2004), Sống với người bị viêm gan, Nhà xuất Trẻ Bùi Thị Hà (2018), “Nghiên cứu tăng cường biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G Don)”, Đại học sư phạm Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam Vũ Thị Lan, Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành (2011), “Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng nước dừa đến sinh khối mơ sẹo trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, 82(06), tr 65-69 Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình cơng nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 10 Vũ Thanh Sắc, Nguyễn Thị Hạnh, Nguyễn Thị Thu Huyền (2012), “Nhân nhanh in vitro Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) qua giai đoạn mơ sẹo”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, 96(08), tr 125-129 41 11 Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang (2008), “Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống vơ tính Lơ hội phương pháp ni cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 6(6), tr 514-521 12 Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện (2012), “Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống loài Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quý”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Đại học Nơng nghiệp Hà Nội, 10(4), tr 597 – 603 13 Huỳnh bảo Tuân, Hồ Phượng Hoàng,Trần Thị Cảm, Nguyễn Ngọc Kiều Chinh (2013),”Nghiên cứu chuỗi giá trị dược liệu – Diệp hạ châu”, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, tập 16, số Q2-2013, tr 37 14 Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro Ba kích (Morinda officinalis how)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 5(40), tr 191-196 15 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nxb Y học 16 Nguyễn Văn Vinh (2010), “Khảo sát số hợp chất alkaloid có hoạt tính sinh học dừa cạn (Catharanthus roseus)”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Số 1, tr 81- 86 17 Đỗ Năng Vịnh, Ngô Xuân Bình (2008), Giáo trình cơng nghệ sinh học đại cương, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 18 Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 19 Agnieszka Pietrosiuk, Mirosława Furmanowa, Barbara Łata (2007), “Catharanthus roseus: micropropagation and in vitro techniques”, Phytochemistry Reviews, vol 6(2-3), pp 459-473 20 Bo Shen, Jun Ju, Shiyan Wang, Chu Eagle S H, Wong V.W.S, Xin Zhou, Ge Lin, Sung Joseph, Chan Henry (2008) “Phyllanthus urinaria ameliorates the severity of nutritional steatohepatitis both in vitro and in vivo”, Hepatology, 47, pp.473-483 42 21 Chia – Chuan Chang, Yu – Chin Lien, Karin C.S Chen Liu and Shoei – Sheng Lee (2003), “Ligans from Phyllanthus urinaria”, Phytochemistry, 63, pp 825-833 22 Choudhary R, Chaudhury R, Malik SK, Sharma KC, “ An efficient regeneration and rapid micropropagation protocol for Almond using dormant axillary buds as explants”, PMID: 26245032 23 Nakasha JJ, Sinniah UR, Kemat N, Mallappa KS (2016), “Induction, Subculture Cycle, and Regeneration of Callus in Safed Musli (Chlorophytum borivilianum) using Different Types of Phytohormones”, PMID:27761075 24 Shinde S, Sebastian JK, Jain JK, Hanaman thagouda MS, Murthy HN (2016), “Efficient in vitro propagation of Artemisia nilagirica var nilagirica (Indian wormwood) and assessment of genetic fidelity of micropropagated plants”, PMID: 27924132 25 Wang CL, Dong X, Ding MQ, Tang YX, Zhu XM, Wu YM, Zhou ML, Shao JR (2016), “Plantlet Regeneration of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn.) in Vitro Tissue Cultures”, PMID: 26972974 Tài liệu trang web 26 http://www.cpv.org.vn/cpv/Modules/News/NewsDetail.aspx Khơi dậy tiềm lớn từ dược liệu Việt Nam, tác giả: Vũ Trang 27 http://vietroselle.com/chi-tiet-cay-thuoc/cay-diep-ha-chau-va-cac-congdung-chua-benh-f43.html Cây diệp hạ châu công dụng chữa bệnh Tác giả: TS Nguyễn Phương Dung (Khoa Y học Cổ truyền – Đại học Y Dược TP.HCM) 28 http://vienquany.com/387/bang-chung-khoa-hoc-diep-ha-chau-co-tac-dungtrong-viec-phong-va-dieu-tri-benh-gan.html Bằng chứng khoa học diệp hạ châu có tác dụng việc phòng điều trị bệnh gan Tác giả: ThS Nguyễn Du 43 29 http://caydiephachau.com/cam-nang-suc-khoe/bai-thuoc/chiet-xuat-diepha-chau Chiết xuất Diệp hạ châu 30 http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=2597 Nghiên cứu sử dụng diệp hạ châu đắng hoạt chất chữa bệnh-TS Võ Thị Trà An, khoa Chăn Nuôi Thú Y, Đai học Nông Lâm TP HCM, nguồn UV-Việt Nam 31.http://suckhoedoisong.vn/10-tac-dung-khong-ngo-cua-diep-ha-chaun131149.html 10 tác dụng không không ngờ Diệp hạ châu 32 https://www.dieutri.vn/caythuocmanngua/diep-ha-chau-cho-de-rang-cua/ 33.https://www.haiduongdost.gov.vn/nongnghiep/?menu=news&catid=1&item id=3871&lang=vn&expand=news,Sở Khoa học công nghệ Hải Dương, 16/10/2012 44 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường MS STT Thành phần Nồng độ( mg/l) MS1 440 CaCl-2.2H2O MS2 170 1900 370 1650 KH2PO4 KNO3 NH4NO3 MgSO4.7H2O MS3 10 11 6,2 8.6 22,3 0,025 0,83 0,025 0,25 H3BO3 ZnSO4.7H2O MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O KI CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O MS4 12 13 27,8 37,3 FeSO4.7H2O Na2EDTA MS5 14 15 16 17 18 Pirydoxine Thiamin HCl Nicotinic acid(P.P) Myo-inositol glycine 0,5 0,1 0,5 100 ... tái sinh phù hợp Xuất phát từ l trên, l a chọn đề tài luận văn: Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L. ) Mục tiêu nghiên cứu Tối ưu môi trường tái sinh đa. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM THỊ HỒNG LOAN NGHIÊN CỨU TÁI SINH ĐA CHỒI IN VITRO CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L. ) Ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 8.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng... học Diệp hạ châu Các hợp chất có hoạt tính Diệp hạ châu ligan (phyllanthin, hypophyllanthin, nirurin niranthin, phytetralin, niranthine ), flavonoids, amariinn, furosin, amariinn acid, amarulone,