HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE (PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌC THÚ Y MÃ SỐ: 64 01 08 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà Nội, 2019 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ Người hướng dẫn khoa học 2: PSG.TS Phạm Công Hoạt Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Trường Đại Học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Hữu Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: TS Bùi Nghĩa Vượng Viện Thú y Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào hồi … … ngày… tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngành chăn ni nói chung chăn ni lợn nói riêng ngày phát triển chiếm vị trí quan trọng nông nghiệp nước ta Cùng với tiến kỹ thuật giống, thức ăn, quản lý, thú y kết hợp với biện pháp khuyến khích chăn nuôi nhà nước làm cho ngành chăn nuôi lợn phát triển với tốc độ tương đối cao, mang lại hiệu kinh tế cho người dân đồng thời góp phần vào kinh tế quốc gia Tuy nhiên, ngành chăn ni lợn có nhiều thách thức gia tăng diễn biến ngày phức tạp dịch bệnh, Hội chứng bệnh PCV2 coi nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng Tại Việt Nam, Hội chứng còi cọc lợn sau cai sữa xuất vào năm 2000 gây ảnh hưởng đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn Tuy nhiên nghiên cứu lưu hành, đặc điểm dịch tễ học đồng nhiễm PCV2 với số mầm bệnh khác đến hạn chế tập trung theo vùng, miền Xuất phát từ vấn đề nêu trên, tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm làm rõ lưu hành, hoàn thiện tranh đặc điểm dịch tễ học phân tử đồng nhiễm PCV2 với số virus điều kiện sản xuất thực tế sở chăn nuôi lợn xuyên suốt ba miền Bắc – Trung – Nam nước Kết đề tài sở khoa học quan trọng mở hướng nghiên cứu đề biện pháp phòng chống bệnh PCV2 có hiệu quả, công tác lựa chọn chủng virus phù hợp sản xuất vắc xin phòng bệnh cho đàn lợn nuôi nước 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Xác định lưu hành số đặc điểm dịch tễ học phân tử PCV2 lợn nuôi Việt Nam - Xác định đồng nhiễm PCV2 với số ADN, ARN virus lợn nuôi Việt Nam 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Mẫu thu thập từ trại nuôi lợn thuộc 14 tỉnh nghiên cứu đại diện cho ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam bao gồm: Thái Ngun, Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Ninh, Hưng n, Hải Phòng, Hải Dương, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Bình Dương, Tiền Giang Vĩnh Long Thời gian thực từ tháng năm 2015 đến tháng năm 2018 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Xác định tỷ lệ lưu hành bổ sung đầy đủ thêm tranh dịch tễ virus PCV2 lưu hành Việt Nam - Đánh giá đồng nhiễm PCV2 với số virus (PPV, TTV, PRRS, PCV3) lợn nuôi Việt Nam - Trong trình thực đề tài xác định thêm lưu hành loài virus PCV3 lợn nuôi Việt Nam 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học - Đây nghiên cứu có hệ thống lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử PCV2 đồng nhiễm PCV2 với số virus lợn nuôi Việt Nam - Đây nghiên cứu Porcine circovirus (PCV3), loài virus lưu hành đàn lợn nuôi Việt Nam - Kết nghiên cứu đề tài tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu PCV 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn - Khuyến cáo cho việc sử dụng vắc xin phòng bệnh phù hợp với nhánh virus lưu hành thực tế khu vực nghiên cứu - Kết nghiên cứu đề tài giúp chủ động đề xuất biện pháp phòng PCVAD có hiệu quả, hạn chế thiệt hại dịch bệnh gây PCV2 cho đàn lợn nuôi Việt Nam - Trên sở phát đề tài loài virus PCV3, mở hướng nghiên cứu sâu đánh giá lưu hành, vai trò gây bệnh tác động PCV3 tới sức sản xuất đàn lợn để đưa giải pháp phòng, chống có hiệu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH CHĂN NI LỢN TẠI VIỆT NAM Ngành chăn nuôi lợn Việt Nam chủ yếu chăn ni nhỏ lẻ qui mơ hộ gia đình, mơi trường chăn nuôi không đảm bảo vệ sinh thú y, phong tục tập quán người Việt Nam mang nhiều yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch bệnh lợn như: sử dụng thịt lợn tươi sống chủ yếu, giết mổ nhỏ lẻ hộ gia đình, sử dụng thịt lợn mắc bệnh, bn bán lợn nhỏ lẻ không qua kiểm dịch thú y, chăn nuôi lợn tận dụng nguồn thức ăn thừa từ nhà hàng, nên nhiều loại dịch bệnh lợn, có Hội chứng bệnh PCV2 tồn tại, lưu hành thời gian dài 2.2 BỆNH DO PCV2 GÂY RA Ở LỢN NUÔI 2.2.1 Giới thiệu PCV2 2.2.1.1 Phân loại PCV2 thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae Họ circoviridae gồm giống: Giống Anellovirus, Giống Circovirus 2.2.1.2 Hình thái, cấu trúc PCV mang gen ADN virus sợi đơn vòng chứa khoảng 1759 nucleotide (PCV1) khoảng 1767 - 1768 nucleotide (PCV2) 2.2.1.3 Sức đề kháng PCV2 có khả sống 15 phút nhiệt độ 70oC, bị bất hoạt pH= Ở nhiệt độ phòng, bị tác động 10 phút số chất sát trùng chlorhexidine, formaldehyde, iodine, vikon cồn hiệu giá virus giảm 2.2.2 Dịch tễ học bệnh PCV2 2.2.2.1 Loài cảm thụ Tất giống lợn mẫn cảm với bệnh, kể lợn nuôi lợn hoang dã 2.2.2.2 Chất chứa mầm bệnh Mầm bệnh có dịch xuất, tiết huyết thanh, virus thải qua tinh dịch, phân, nước tiểu, sữa non, sữa từ lợn nhiễm bệnh 2.2.2.3 Phương thức truyền lây Sự lây lan PCV2 từ lợn sang lợn, từ người sang lợn, từ động vật gặm nhấm sang lợn, từ ký sinh trùng sang lợn, từ môi trường chuồng trại sang lợn Mầm bệnh xâm nhập vào thể chủ yếu qua đường miệng - mũi 2.2.3 Cơ chế sinh bệnh PCV2 gây suy giảm miễn dịch dẫn tới tác động đáng kể lên sức sản xuất lợn, từ tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh khác xâm nhập gây bệnh 2.2.4 Triệu chứng bệnh tích lợn mắc PCV2 2.2.4.1 Triệu chứng lâm sàng Hiện tượng xác gầy sưng hạch lympho, còi cọc, lơng thơ, khơ xơ xác, ngồi có tỷ lệ lớn lợn có triệu chứng hơ hấp bị ỉa chảy 2.2.4.2 Bệnh tích Hiện tượng sưng xuất huyết hạch lympho; ngồi ra, tổn thương biểu số quan phổi có biểu viêm mức độ khác nhau, gan, thận, ruột, lách xuất huyết 2.2.5 Một số hội chứng lợn có liên quan đến nhiễm PCV2 Hội chứng gầy còm lợn sau cai sữa, Hội chứng viêm da viêm thận, Hội chứng rối loạn sinh sản lợn, Hội chứng rối loạn hô hấp lợn, Hội chứng viêm ruột lợn, Hiện tượng nhiễm PCV2 thể cận lâm sàng 2.2.6 Chẩn đoán Chẩn đoán lâm sàng, Chẩn đoán phân biệt, Chẩn đoán huyết học, Chẩn đốn sinh học phân tử 2.2.7 Phòng bệnh Thay đổi phương thức chăn nuôi, áp dụng biện pháp an toàn sinh học, chuồng trại đảm bảo vệ sinh thú y, lợn mua cần kiểm dịch chăm sóc ni dưỡng tốt Phòng bệnh vắc xin 2.2.8 Điều trị Bệnh virus nên khơng có thuốc điều trị đặc hiệu 2.3 HIỆN TƯỢNG ĐỒNG NHIỄM DO PCV2 GÂY RA Trong thực tế có nhiều giả thuyết đưa nhằm giải thích có nhiều nguyên kết hợp với PCV2 hội chứng còi cọc lợn sau cai sữa Trước hết, số mầm bệnh có chế sinh bệnh gây ảnh hưởng đến hệ miễn dịch thể, khiến cho lợn nhiễm PCV2 có triệu chứng PMWS (Darwich et al., 2003) Opriessnig et al (2007) cho biết hầu hết lợn đàn bị nhiễm PCV2 có khoảng – 30% lợn mẫn cảm biểu triệu chứng Có bốn yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh PCVAD nhiễm PCV2 cấu trúc độc lực virus, giống lợn, đồng nhiễm, trạng thái miễn dịch thể Thử nghiệm lâm sàng chứng minh điều kiện thực nghiệm PCV2 khơng gây bệnh mà kết hợp với số virus PRRS, PPV, TTV gây bệnh thể lâm sàng Trong hầu hết trường hợp lợn có triệu chứng lâm sàng rõ gây nhiễm đồng thời với số mầm bệnh truyền nhiễm không truyền nhiễm (Rovira et al., 2002) Do PCV2 coi điều kiện cần chưa đủ để gây thành bệnh (Tomás et al., 2008) 2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ PCV2 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới PCV2 phát năm 1991 Canada kết nghiên cứu Jacobsen et al (2009) khẳng định tồn PCV2 lợn từ năm 1962 miền Bắc nước Đức PCV2 có genotype (PCV2a, PCV2b, PCV2c PCV2d) nhánh di truyền (cluster) 2A-2E 1A-1C công nhận PCV2b chủ yếu phát kể từ năm 2003 Điểm đặc biệt chế sinh bệnh PCV2 tượng đa nhiễm bội nhiễm với nhiều loại mầm bệnh khác Các nghiên cứu cho thấy yếu tố đồng nhiễm nhiễm đồng thời với tác nhân gây bệnh liên quan đến phát triển PCVAD (Hasslung et al., 2005; Opriessnig et al., 2012) 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước Bằng chứng huyết học cho thấy xuất PCV2 vào năm 2000 (Nguyễn Thị Thu Hồng cs., 2006) Từ đến nay, nghiên cứu PCV2 thực khẳng định diện nguy ngày lan rộng PCV2 quy mô chăn nuôi lợn Tuy nhiên, nghiên cứu tập trung theo vùng, miền (miền Bắc, miền Trung miền Nam), chưa có nghiên cứu thực để làm rõ lưu hành cập nhật đặc điểm dịch tễ học phân tử, đồng nhiễm PCV2 xuyên suốt miền Bắc – Trung - Nam nước Đề tài thực với mục đích làm sáng tỏ lưu hành, hoàn thiện tranh đặc điểm dịch tễ học phân tử đồng nhiễm PCV2 với số virus lợn nuôi xuyên suốt ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam Kết đề tài sở khoa học quan trọng mở hướng nghiên cứu công tác lựa chọn chủng virus phù hợp sản xuất vắc xin phòng bệnh cho đàn lợn nước PHẦN NỘI DUNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Mẫu lấy trại chăn nuôi lợn thuộc 14 tỉnh Việt Nam - Nghiên cứu tiến hành khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; với giúp đỡ Trung tâm chẩn đốn Thú y Trung ương - Giải trình tự gen thực Công ty 1st BASE, Singapore 3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tiến hành từ tháng năm 2015 đến tháng năm 2019 3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Mẫu nghiên cứu thu thập lợn ốm lợn khỏe bình thường - Các loại dụng cụ, sinh phẩm hóa chất dùng: tách chiết ADN/ARN tổng số, phản ứng PCR/ Realtime PCR giải trình tự gen 3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xác định lưu hành PCV2 lợn nuôi Việt Nam - Xác định đặc điểm dịch tễ học phân tử PCV2 lưu hành lợn nuôi Việt Nam - Xác định đồng nhiễm PCV2 với số ADN virus (TTV, PPV, PCV3) ARN virus (PRRS) lợn nuôi Việt Nam 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1 Phương pháp tính tốn dung lượng mẫu Để phát tỷ lệ lưu hành PCV2 lợn nuôi, thiết kế lấy mẫu bệnh phẩm nghiên cứu phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản, nhiều giai đoạn để thu thập mẫu bao gồm tầng/giai đoạn sau: Tính số lượng mẫu cấp độ, sử dụng công thức sau:   1    e2 Trong đó: n1: Số sở/mẫu cần lấy; P: Là tỷ lệ lưu hành ước tính (dựa vào số liệu tổng quan nghiên cứu từ năm 2000 – 2018 tổng hợp tỷ lệ lưu hành ước tính cấp độ); z = 1.96, tương đương với độ tin cậy 95%; e = Sai số tuyệt đối giá trị ước tính so với mức độ lưu hành thực tế Trong nghiên cứu này, chọn sai số (e) = 10% Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu trình bày bảng 4.1 n1  z  Bảng 4.1 Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu TT 10 11 12 13 14 Tỉnh Số xã cần lấy mẫu Bắc Ninh Hải Dương Hòa Bình Hà Nội Hải Phòng Hưng Yên Thái Nguyên Hà Tĩnh Quảng Trị Huế Quảng Nam Bình Dương Tiền Giang Vĩnh Long Tổng số (a) 5 5 5 5 5 5 5 70 Số sở cần lấy mẫu/1 xã (b) 5 5 5 5 5 5 5 70 Số mẫu cần lấy/1 sở (c) 5 5 5 5 5 5 5 70 Tổng số mẫu xét nghiệm Mẫu gộp thí nghiệm 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 1.750 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 350 Ghi chú: (a) Giai đoạn 1: lựa chọn số xã; (b) Giai đoạn 2: lựa chọn số sở ni; (c) Giai đoạn 3: tính số mẫu cần lấy Tổng số mẫu xét nghiệm = Số xã cần lấy mẫu x Số sở cần lấy mẫu/1 xã x số mẫu cần lấy/1 sở Với đặc điểm chăn nuôi lợn nhỏ lẻ chiếm đa số (trên 70%, theo số liệu thống kê tỉnh), để tăng hội phát bệnh, định xã, lấy 25 mẫu 05 sở, hộ chăn nuôi lợn, hộ tiến hành lấy 05 mẫu đủ để gộp thành 01 mẫu xét nghiệm 3.5.2 Phương pháp điều tra hồi cứu Khi giải trình tự gen phân tích phát sinh loài virus PCV2, điều tra ngược lại mẫu xét nghiệm phòng thí nghiệm 3.5.3 Phương pháp thu thập mẫu Sử dung phương pháp thu thập mẫu huyết thanh, mẫu dịch hầu họng mẫu phủ tạng 3.5.4 Phương pháp chiết tách ADN/ARN Sử dụng kit TacoTM DNA/RNA Extraction Kit, máy chiết tách nucleic acid tự động TacoTM theo hướng dẫn nhà sản xuất 3.5.5 Phương pháp Realtime PCR Áp dụng theo phương pháp Realtime PCR Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương công nhận ISO/IEC 17025:2005 3.5.6 Phương pháp PCR Sử dụng kít PCR thương mại (i-StarMaster) theo hướng dẫn nhà sản xuất Đối với sản phẩm PCR phục vụ giải trình tự gen (nhân lên cặp mồi CV1/CV2, CV3/CV4), sản phẩm PCR tinh sạch QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) 3.5.7 Phương pháp giải trình tự hồn thiện trình tự gen Thực công ty 1st BASE (Singapore) 3.5.8 Phương pháp phân tích trình tự gen Sử dụng Chương trình MEGA để dựng phát sinh chủng loại 3.5.9 Xây dựng phát sinh chủng loại Sử dụng phần mềm MEGA6 để xây dựng phả hệ dựa trình tự gen mã hóa capsid protein (gen ORF2) 3.5.10 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian - thời gian Sử dụng phần mềm Quantum GIS, phần mềm BEAST, SpreaD3 3.5.11 Phương pháp đo lường tính đa dạng di truyền Sử dụng phương pháp Principal Coordinate Analysis (PCoA) 3.5.12 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý phần mềm MS Excel 2010; so sánh sai khác yếu tố phép thử χ2 (phần mềm Minitab 14.0) phép thử Fisher Exact Test (phần mềm SAS 9.1) PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 SỰ LƯU HÀNH PCV2 Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM 4.1.1 Kết nghiên cứu lưu hành PCV2 theo địa phương Nghiên cứu lấy mẫu để nghiên cứu lưu hành PCV2 đồng thời ba miền Bắc - Trung - Nam khoảng thời gian từ 2015-2018 trình bày hình 4.1 bảng 4.1 vẻ khác lớn kiểm định χ2 cho biết phương diện thống kê, tỷ lệ khơng khác trị số p = 0,4085 > 0,05 4.1.3 Kết xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 đàn lợn thuộc lứa tuổi Kết xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 lợn lứa tuổi khác trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Kết xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 lứa tuổi lợn Tỷ lệ (%) dương tính Tổng số mẫu Số mẫu TT Nguồn gốc mẫu kiểm tra dương tính (95%CI) 96 38 39,58 (29,75 – 50,08) Lợn theo mẹ Lợn thịt 186 84 45,16 (37,87 – 52,61) Lợn nái 68 22 32,35 (21,51 – 44,79) 144 41,14 Tổng hợp 350 Mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PCV2 nhóm tuổi nào, tỷ lệ dương tính thấp lợn nái đạt 32,35%; thấp so với hai lứa tuổi lợn theo mẹ lợn thịt 39,58% 45,16% Tuy tỷ lệ dương tính với PCV2 lứa tuổi lợn khác lớn kiểm định χ2 cho biết phương diện thống kê, tỷ lệ khơng khác trị số p = 0,4704 > 0,05 4.1.4 Kết nghiên cứu lưu hành bệnh PCV2 gây Kết theo dõi triệu chứng lâm sàng số lợn nghi mắc PMWS trình thu mẫu địa phương còi cọc, chậm lớn, lơng thơ, triệu chứng hơ hấp, tiêu chảy viêm da ghi nhận Trong trình thu mẫu, số lợn nghi mắc PMWS mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể Kết cho thấy nhìn chung tượng sưng to phân thùy hạch lympho (đặc biệt hạch bẹn nơng hạch màng treo ruột) phổ biến Ngồi ra, tổn thương biểu số quan phổi có biểu viêm mức độ khác nhau, gan, thận, ruột, lách xuất huyết 4.2 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PCV2 Đến thời điểm tại, nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử PCV2 Việt Nam tập trung theo vùng miền định Nhằm có kết luận cách tồn diện đặc điểm di truyền đặc điểm dịch tễ học phân tử PCV2 lưu hành lãnh thổ Việt Nam, nghiên cứu tiến hành giải trình tự gen PCV2 miền Bắc- Trung- Nam Kết nghiên cứu cung cấp sở khoa học cho việc lựa chọn chủng PCV2 nghiên cứu vắc 11 xin đánh giá hiệu vắc xin phòng chống PMWS lợn 4.2.1 Kết giải trình tự gen PCV2 Kết 14 trình tự gen xác định công bố Genbank ký hiệu: MH470219, MH470220, MH470221, MH470222, MH470223, MH470224, MH470225, MH470226, MH470227, MH470228, MH470229, MH470230, MH470231, MH470233 4.2.2 Phân loại genotype PCV2 lưu hành Việt Nam Để có sở đối chiếu so sánh, nghiên cứu thu thập phân tích trình tự gen PCV2 Việt Nam công bố trước đây, sử dụng trình tự gen 20 tỉnh, thành phố đại diện cho ba miền Bắc – Trung – Nam, gồm trình tự gen xác định nghiên cứu (hình 4.3) Việt Nam 2016 2013 2011, 2012, 2014, 2016 2009, 2011, 2016 PCV2b: 1A/1B PCV2b: CRF B 100% 2004, 2008, 2009, 2010, 2011,2013 82,94% 2012, 2014, 2015, 2016, 2017 PCV2d 2011, 2013, 2015 2008 99,98% 99,98% PCV2a: 2A-2E PCV2c PCV1 A (A) Để dễ quan sát, vị trí có chủng PCV2 phân lập Việt Nam đánh dấu màu xanh, kèm năm phân lập.Giá trị bootstrap nút (node) hiển thị cho cách phân nhánh Trình tự gen ORF2 PCV1 dùng làm outgroup (B) Sơ đồ đính kèm đánh dấu 20 tỉnh (màu vàng cam) có mẫu phân tích Hình 4.3 Cây phát sinh chủng loại chủng PCV2 phân lập Việt Nam 12 4.2.3 Tính đa dạng di truyền PCV2 lưu hành Việt Nam Đa dạng di truyền thể trực quan phân tích PCoA (hình 4.4) Trên trục tọa độ hình chiếu (coordinate 1), PCV2b: CRF đánh giá gần gũi mặt di truyền với PCV2d khác biệt rõ với PCV2b: 1A/1B Trên trục tọa độ hình chiếu (coordinate 2), PCV2d đánh giá gần gũi mặt di truyền với PCV2b: 1A/1B khác biệt rõ với PCV2b: CRF Phân tích PCoA cho thấy chủng PCV2 lưu hành Việt Nam từ 2004 đến 2017, 20 tỉnh/ thành phố phân chia thành nhóm tách rời (giới hạn đường nét đứt) Tuy nhiên, điểm tọa độ biểu thị cho chủng phân lập nhóm (các điểm giới hạn đường nét đứt) phân bố phân tán Đặc biệt, có chủng phân lập nằm tách rời khỏi phân nhóm 1, Kết phản ánh đa dạng di truyền genotype/ cluster PCV2 Việt Nam KM042410_2008 JX099786_2008 Trục hình chiếu (Coordinate 2) KM042412_2009 KM042405_2011 JQ181588_2011 JQ181595-2011 Trục hình chiếu (Coordinate 1) PCV2b: 1A/1B PCV2b: CRF PCV2d Hình 4.4 Hệ tọa độ chiều biểu diễn mối quan hệ gen chủng PCV2 phân lập Việt Nam 4.2.4 Sự lưu hành genotype PCV2 theo không gian thời gian Kết hình 4.5 cho thấy, số tỉnh có lưu hành nhóm di truyền khác Ví dụ, từ năm 2009-2016 phát PCV2 nhóm 1A/1B, CRF PCV2d lưu hành đàn lợn nuôi Hà Nội Về mặt thời gian, nhóm tái tổ hợp CRF có mặt Việt Nam từ năm 2004 2013, genotype PCV2d xuất từ 2008 (năm 2017) 13 2004 2009 14 2008 2011 2010 2013 2012 2015 2014 2016 Hình 4.5 Phân bố nhóm di truyền PCV2 Việt Nam theo không gian thời gian 14 (Năm) 2017 4.2.5 Đặc điểm dịch tễ học phân tử genotype PCV2b lưu hành Việt Nam Đặc điểm dịch tễ học phân tử genotype PCV2b mơ tả hình 4.6 Trung Qu?c Pháp Nhánh Nhánh Ghi chú: Cây phát sinh chủng loại với nhánh đánh dấu màu tương ứng với quốc gia dự đoán Các chủng Việt Nam đánh dấu màu xanh Hình 4.6 Nguồn gốc, phát tán theo không gian thời gian genotype PCV2b lưu hành Việt Nam Kết phân tích trình bày hình 4.6 dự đốn PCV2b lưu hành Pháp nguồn gốc tiên phát chủng virus thuộc nhóm giới, chủng PCV2b lưu hành Trung Quốc (nhánh màu tím, hình 4.6) nguồn gốc trực tiếp PCV2b lưu hành nhiều quốc gia giới (trong 15 có Việt Nam) Đối với chủng PCV2b lưu hành Việt Nam, phần lớn chủng (34/39 chủng) dự đoán bắt nguồn từ virus lưu hành Trung Quốc PCV2b thuộc nhánh nhóm di truyền có nhiều chủng PCV2 thực địa lưu hành Việt Nam nhiều Các chủng dự đoán bắt nguồn trực tiếp từ chủng virus lưu hành Trung Quốc (hình 4.7) Trong đó, kết phân tích dự đốn có đợt xâm nhập vào nước ta: đợt vào khoảng năm 1992 đợt vào khoảng năm 2002 (hình 4.7) Các chủng sau xâm nhập vào nước ta tiếp tục lưu hành và tạo thành nhánh riêng biệt Việt Nam lây lan tiếp tỉnh khác (đánh dấu đường màu đen) Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc hi chú: Các chủng Việt Nam đánh dấu màu xanh Hình 4.7 Sự phát tán theo khơng gian thời gian chủng PCV2b nhánh xâm nhập vào Việt Nam Ngoài chủng PCV2 thuộc nhánh 1, quan sát số chủng virus lưu hành Việt Nam thuộc nhánh lại 16 Trung Quốc Hàn Quốc Ghi chú: Các chủng Việt Nam đánh dấu màu xanh Hình 4.8 Sự phát tán theo khơng gian thời gian chủng PCV2b nhánh xâm nhập vào Việt Nam Kết phân tích dự đoán Trung Quốc nguồn gốc chủng virus Việt Nam (hình 4.8) Tuy nhiên, có chủng PCV2 phân lập năm 2009 dự đốn có nguồn gốc từ Hàn Quốc 4.2.6 Đặc điểm dịch tễ học phân tử genotype PCV2d lưu hành Việt Nam Đến thời điểm tại, có hai chuyển dịch genotype PCV2 (genotypic shift) biết: (i) PCV2a sang PCV2b diễn phạm vi toàn cầu từ năm 2003 (Cortey et al., 2011, Dupont et al., 2008), (ii) từ 2012 trở lại có chuyển dịch genotype lưu hành phổ biến sang PCV2d (Xiao et al., 2015) Ở 17 Việt Nam chưa có nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử genotype PCV2d lưu hành Việt Nam A B Trung Quốc (A) Cây phát sinh chủng loại với nhánh đánh dấu màu tương ứng với quốc gia dự đoán chiều dài chỉnh tương ứng với trục thời gian dự đoán (B) Những đường phát tán PCV2d với mức tin cậy cao (Bayes Factor > 150) Hình 4.9 Kết phân tích phát tán theo khơng gian thời gian PCV2d Nghiên cứu dự đoán nhanh xác nhánh phát sinh chủng loại (với nút đánh màu đỏ, hình 4.9) có nguồn gốc từ Trung Quốc Trong đó, mức tin cậy cao (Bayes factor > 150) đường phát tán từ Trung Quốc tới nước/ vùng lãnh thổ như: Braxin, Đức, Italy, Đài Loan Việt Nam Nhận xét nguồn gốc genotype PCV2d Trung Quốc phù hợp với số công bố trước (Guo et al., 2010, Franzo et al., 2015) Đặc điểm dịch tễ học phân tử genotype PCV2d Việt Nam làm rõ hình 4.10 18 Việt Nam Trung Quốc Việt Nam ~2010 ~2013 ~2008 2014 2014 -2017 2012 ~1998 2011, 2013 ~2005 2015 ~2010 2008 - 2011, 2013 ~2002 ~1978 ~2005 2004 Ghi chú: Các nhánh phát sinh chủng loại dự đốn có nguồn gốc từ Trung Quốc đánh màu đỏ, nhánh dẫn tới chủng lưu hành Việt Nam đánh màu đen Hình tứ giác đánh dấu nút mà xảy q trình chuyển tiếp chủng có nguồn gốc từ Trung Quốc sang Việt Nam, kèm năm dự đoán xảy chuyển tiếp Để dễ quan sát, nhánh dẫn tới chủng PCV2 lưu hành nước khác (trừ Việt Nam) làm mờ Hình 4.10 Nguồn gốc, phát tán theo không gian thời gian genotype PCV2d lưu hành Việt Nam Tồn 54 trình tự PCV2d thu thập Việt Nam từ 2004 - 2017 dự đốn có nguồn gốc từ Trung Quốc (mô tả đường chuyển tiếp từ màu đỏ sang màu đen, hình 4.10) Tuy vậy, chủng nằm nhánh khác phát sinh chủng loại Thời gian xâm nhập tổ tiên gần (most recent common ancestor) chủng PCV2d phân lập Việt Nam ước lượng xảy vào khoảng năm: 1998, 2002, 2005, 2008, 2010 2013 Kết phân tích cho biết có nhiều đợt xâm nhập genotype PCV2d vào Việt Nam Như vậy, với kết nêu lần khẳng định, thời điểm tại, Việt Nam có lưu hành đồng thời nhiều nhóm di truyền 19 PCV2 Trong nhóm virus nhóm tái tổ hợp, genotype PCV2d xác định lưu hành phổ biến PCV2d chiếm ưu 4.3 SỰ ĐỒNG NHIỄM PCV2 VỚI MỘT SỐ VIRUS Trong điều kiện thực nghiệm, lợn mắc bệnh thể lâm sàng PCV2 gây gây nhiễm kết hợp với số virus Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (PRRSV), Porcine parvovirus (PPV), Torque teno virus (TTV) (Krakowka et al., 2002; Ellis et al., 2008) Vì vậy, tượng đồng nhiễm đặc điểm quan trọng nghiên cứu lưu hành bệnh PCV2 gây Trong khuôn khổ nghiên cứu này, nghiên cứu tượng đồng nhiễm PCV2 với số virus chứng minh đóng vai trò cộng hưởng chế sinh bệnh PCV2 (PRRSV, PPV, TTV) loại virus (Porcine circovirus 3, PCV3) có liên quan tới hội chứng viêm da – thận sảy thai (Palinski et al., 2016) 4.3.1 Kết xác định có mặt số virus đồng nhiễm Tiến hành phân tích từ 144 mẫu dương tính với PCV2, chúng tơi xác định có mặt số virus bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết xác định có mặt virus PRRSV_NA type HP-PRRSV PPV1 PPV2 PPV3 PPV4 14 54 25 15 Tỷ lệ mẫu dương tính (%) (95%CI) 5,56 (2,43 – 10,65) 9,72 (5,42 – 15,77) 6,25 (2,90 – 11,53) 37,50 (29,58 – 45,95) 17,36 (11,56 – 24,55) 10,42 (5,95 – 16,60) TTV1 TTV2 14 46 9,72 (5,42 – 15,77) 31,94 (24,43 – 40,22) PCV3 4,17 (1,54 – 8,85) Virus Số mẫu dương tính Sử dụng cặp mồi đặc hiệu với virus nêu phát diện ADN virus (PPV, TTV, PCV3) ARN virus (PRRSV) mẫu bệnh phẩm Kết cho thấy ngồi dương tính với PCV2 mẫu đồng thời dương tính với virus khác, điều lần khẳng định mẫu bệnh phẩm lợn nuôi điều kiện thực địa tỉnh nghiên cứu có tồn mầm bệnh khác Đối với ADN virus, tỷ lệ 20 phát mẫu dương tính với PPV2, PPV3, PPV4, PPV1 theo thứ tự 37,5%, 17,36%, 10,42%, 6,25%); tiếp đến TTV1 9,72%, TTV2 31,94%), thấp PCV3 (4,17%) Đối với ARN virus tỷ lệ mẫu dương tính với PRRSV thấp, đặc biệt chủng virus PRRS phát gồm hai cluster PRRSV_NA (nhóm chủng virus có nguồn gốc Bắc Mỹ) HPPRRSV (nhóm chủng virus có nguồn gốc Trung Quốc) với tỷ lệ 5,56% 9,72% Từ mẫu dương tính với PCV2, kết phát TTV PPV lưu hành tất tỉnh nghiên cứu, PCV3 xuất tỉnh phía Bắc Hà Nội Hưng Yên, PRRSV xuất tỉnh Hà Tĩnh, Quảng Trị, Tiền Giang A B C D A: Các tỉnh có mẫu dương tính với TTV; B: Các tỉnh có mẫu dương tính với PPV; C: Các tỉnh có mẫu dương tính với PCV3; D: Các tỉnh có mẫu dương tính với PRRS Hình 4.11 Các tỉnh có mẫu dương tính với virus đồng nhiễm 4.3.2 Kết nghiên cứu đồng nhiễm PCV2 với số virus Mặc dù chế sinh bệnh virus sử dụng nghiên cứu chưa thực sáng tỏ điều nhiều nhà khoa học khẳng định tượng đồng nhiễm chúng gây thành bệnh/hội chứng liên quan lợn Kết phân tích tượng đồng nhiễm PCV2 với virus nghiên cứu từ mẫu dương tính với PCV2 trình bày bảng 4.5 Kết mẫu đồng nhiễm 02 loại virus 63,19%; số mẫu đồng nhiễm 03 virus 34,03%, số mẫu đồng nhiễm 04 virus 2,78%, khơng có mẫu đồng nhiễm virus, đặc biệt khơng có mẫu dương tính với riêng PCV2 Kết tiếng chuông cảnh báo cho người làm công tác chăn nuôi thú y lưu ý giải pháp phòng chống bệnh hiệu 21 Bảng 4.5 Kết xác định đồng nhiễm virus mẫu bệnh phẩm Đồng nhiễm PCV2-PPV-TTV-PRRS PCV2-PPV-TTV PCV2-PPV-PCV3 PCV2-PPV-PRRS PCV2-TTV-PRRS PCV2-PPV PCV2-TTV PCV2-PRRS PCV2* Số lượng virus Số mẫu dương tính Tổng hợp Tỷ lệ mẫu dương tính (%) 4 36 6 51 19 11 10 2,78 49 34,03 91 63,19 Ghi chú: (*) kết hợp với tác nhân khác 4.3.3 Đặc điểm sinh học phân tử loài virus đồng nhiễm với PCV2 Từ năm 2015, loài virus với tên gọi Porcine circovirus (PCV3) phát lợn mắc hội chứng viêm da - thận hội chứng rối loạn sinh sản Hiện PCV3 phát nhiều nước chăn nuôi lợn giới (Palinski et al., 2017) Kết đánh giá đồng nhiễm cho thấy phát mẫu dương tính Hà Nội Hưng Yên 5/6 chủng PCV3 giải trình tự thành cơng có chiều dài gen ORF2 642 bazơ Kết xây dựng phát sinh chủng loại cho thấy chủng PCV3 Việt Nam thuộc nhóm di truyền PCV3a, với 4/5 chủng xếp chung nhóm với chủng PCV3 có nguồn gốc từ Trung Quốc 4.3.3.1 Kết phân tích trình tự gen mã hóa capsid protein Giống với trình tự ORF2 chủng PCV3 công bố Genbank, chủng PCV3 Việt Nam so với chủng tham chiếu GD2016-1 (KY421347) cho thấy chủng PCV3 Việt Nam có 39 vị trí xuất đột biến điểm thay đổi nucleotide Trong đó, có vị trí đột biến làm thay đổi amino acid mã hóa Có chủng thực địa thu thập năm 2016 2017 (L16-2931, L16-2932, L17-297 L17-307) mang đặc trưng kiểu gen V-K-S-I amino acid 24, 27, 77 150 nhóm PCV3-a1 có chủng thực địa (L11-181) mang đặc trưng nhóm PCV3-b1 (A-R-S-I amino acid 24, 27, 77 150) Có thể thấy gen ORF2 PCV3 Việt Nam có tính bảo thủ tương đối cao phù hợp với số nghiên cứu công bố giới (Stadejek et al., 2017) 22 4.3.3.2 Kết phân loại PCV3 dựa vào trình tự gen ORF2 Cây phát sinh chủng loại PCV3 dựa vào trình tự gen mã hóa capsid protein trình bày hình 4.12 SH-like support value 3b 3a Hai nhóm di truyền (genetic cluster) PCV3a, PCV3b phân chia theo nghiên cứu Ku cs (2017) Các nhánh dẫn tới chủng PCV3 Việt Nam đánh dấu màu đỏ Giá trị SH-like support nút (node) biểu diễn dạng chấm tròn với đường kính tỷ lệ thuận với giá trị từ 0% đến 100% Chiều dài nhánh biểu diễn tỷ lệ với khoảng cách di truyền (đường nằm ngang) Hình 4.12 Cây phát sinh chủng loại chủng PCV3 lưu hành Việt Nam số quốc gia giới Kết cho thấy phần lớn chủng PCV3 (74/ 86 chủng) thuộc nhóm di truyền PCV3a, có chủng PCV3 Việt Nam (đường màu đỏ, hình 4.12) Ngoại trừ chủng L11-181 (từ mẫu hồi cứu năm 2011), chủng PCV3 từ mẫu thực địa năm 2016- 2017 (L16-2931, L16-2932, L17-297, L17-307) xếp chung nhóm với chủng PCV3 có nguồn gốc từ Trung Quốc 4.3.3.3 Mối quan hệ di truyền PCV2 PCV3 Để làm rõ mối quan hệ di truyền chủng thực địa PCV2 PCV3 Việt Nam, phát sinh chủng loại xây dựng dựa vào gen mã hóa capsid protein Kết phân tích sử dụng chủng PCV2 đại diện qua năm (2004-2017) PCV3 phát Việt Nam (2011, 2016, 2017) cho thấy PCV2 PCV3 tách biệt hồn tồn thành nhóm độc lập Nói cách khác, 23 hai loại virus có quan hệ họ hàng xa Kết phù hợp với nhiều công bố giới (Li et al., 2018, Palinski et al., 2016) PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Sự lưu hành PCV2 lợn nuôi Việt Nam (i) Tỷ lệ lưu hành PCV2 Việt Nam 41,14% Tỷ lệ lưu hành PCV2 14 tỉnh dao động từ 16% đến 88%; (ii) Ở đàn lợn ni có quy mơ khác tỷ lệ dương tính với PCV2 khác nhau, cụ thể tỷ lệ lưu hành PCV2 cao trại có mức quy mơ đàn >500 (47,5%), thấp trại có quy mơ đàn từ 100 – 300 (27,42%) (iii) Ở nhóm tuổi lợn phát mẫu dương tính với PCV2, tỷ lệ lưu hành PCV2 lợn thịt cao (45,16%), lợn theo mẹ lợn nái tương ứng 39,58% 32,35% 2) Đặc điểm dịch tễ học phân tử PCV2 lưu hành Việt Nam Ở Việt Nam, có lưu hành genotype PCV2b bao gồm nhánh 1A/1B, nhóm tái tổ hợp genotype PCV2d Ở miền Bắc - Trung - Nam, thấy diện đồng thời nhiều nhóm di truyền PCV2 tỉnh, khoảng thời gian Các chủng phân lập Việt Nam thuộc genotype PCV2b có nguồn gốc từ Trung Quốc Hàn Quốc, chủng thuộc genotype PCV2d từ 2004 - 2017 có nguồn gốc từ Trung Quốc, nằm nhánh khác phát sinh chủng loại 3) Sự đồng nhiễm PCV2 với số ADN/ARN virus PCV2 đồng nhiễm với 04 virus (PPV, TTV, PCV3, PRRS), cụ thể đồng nhiễm PCV2/PPV cao (35,42%), PCV2/TTV (13,19%), PCV2/PRRS (7,64%) phát lưu hành PCV3 với tỷ lệ 4,17% chủng PCV3 thuộc nhóm di truyền PCV3a 5.2 ĐỀ NGHỊ Từ kết nghiên cứu đề tài, lựa chọn chủng virus PCV2 phù hợp để sản xuất vắc xin đơn giá, đa giá; đồng thời, lựa chọn vắc xin sử dụng cho đàn lợn nuôi vùng, miền Việt Nam tiếp tục nghiên cứu với tác nhân đồng nhiễm gây bệnh khác ảnh hưởng tới sức sản xuất đàn lợn để có biện pháp phòng, chống bệnh PCV2 có hiệu 24 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phạm Hồng Quân, Phạm Công Hoạt Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2017) Đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian thời gian Porcine circovirus genotype 2d (PCV2d) lưu hành Việt Nam Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, Tập 15, số 5, tr 553-564 Phạm Hồng Quân, Nguyễn Văn Giáp, Nguyễn Thị Thanh Thúy, Phạm Công Hoạt Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2017) Nghiên cứu lưu hành loài virus (Porcine circovirus – PCV3) đàn lợn nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, Tập 15, số 11, tr 1520-1528 ... MH47 022 3, MH47 022 4, MH47 022 5, MH47 022 6, MH47 022 7, MH47 022 8, MH47 022 9, MH47 023 0, MH47 023 1, MH47 023 3 4 .2. 2 Phân loại genotype PCV2 lưu hành Việt Nam Để có sở đối chiếu so sánh, nghiên cứu thu thập phân. .. 20 14, 20 16 20 09, 20 11, 20 16 PCV2b: 1A/1B PCV2b: CRF B 100% 20 04, 20 08, 20 09, 20 10, 20 11 ,20 13 82, 94% 20 12, 20 14, 20 15, 20 16, 20 17 PCV2d 20 11, 20 13, 20 15 20 08 99,98% 99,98% PCV2a: 2A-2E PCV2c PCV1... lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử PCV2 đồng nhiễm PCV2 với số virus lợn nuôi Việt Nam - Đây nghiên cứu Porcine circovirus (PCV3), loài virus lưu hành đàn lợn nuôi Việt Nam - Kết nghiên cứu