BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÙI MẠNH HÙNG XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA HAI PROTEIN AtMYB77 VÀ AtMPK3 TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, NĂM 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÙI MẠNH HÙNG XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA HAI PROTEIN AtMPK3 VÀ AtMYB77 TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN XUÂN CẢNH HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Bùi Mạnh Hùng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn, Trước hết tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh – Trưởng Bộ môn Công Nghệ Vi Sinh – Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Cuối cùng, xin gửi tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Học viên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1Tổn g 1.1 Điề u 1.1 Vai trò 1.1 Cơ chế 1.1 Ph ân 1.2Gi ới 1.2 Đặ c 1.2 Gi 11 ới 1.3Ch 13 uỗi 1.3 Vai 13 trò 1.3 Cơ 13 chế 1.4Cá 14 c 1.4 Ph 14 ân 1.4 Mộ 15 t số 1.4 MP 19 K3 1.4 Cá 20 c Ch 22 ươ V 2.1Vật 22 liệ 2.2Hó 24 a 2.3Ph 25 ươ 2.3 Ph 25 ươ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2.3.2 Tinh sản phẩm PCR sản phẩm cắt enzym giới hạn phương pháp gel 26 2.3.3 Phương pháp gắn hai đoạn DNA enzym ligase (Ligation) 26 2.3.4 Biến nạp vector vào vi khuẩn E coli phương pháp sốc nhiệt 26 2.3.5 Phương pháp tách chiết tinh plasmid từ vi khuẩn E coli 27 2.3.6 27 Phương pháp kiểm tra biểu protein tái tổ hợp E coli 2.3.7 Phương pháp thu nhận tinh protein tái tổ hợp 28 2.3.8 Phương pháp thử phản ứng phosphoryl hóa điều kiện in vitro 29 2.3.9 Kiểm tra tương tác 02 protein phương pháp pull-down 29 2.3.10 Phân tích khối phổ để xác định điểm phosphoryl hóa 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Khuếch đại gen mã hóa protein AtMYB77 từ Arabidopsis 31 3.2 Tách dòng gen mã hóa protein AtMYB77 32 3.3 Chuyển gen mã hóa protein AtMYB77 vào vector biểu pGEX-5X 33 3.4 Kiểm tra lại có mặt gen mã hóa protein AtMYB77 AtMPK3 vector biểu 34 3.5 36 Kiểm tra biểu protein AtMPK3 vi khuẩn E coli chủng M15 3.6 37 Kiểm tra biểu protein AtMYB77 vi khuẩn E coli chủng BL21 3.7 Xác định tương tác protein AtMYB77 AtMPK3 kỹ 3.8 C H 4.1 Kế 4.2 Ki TÀ I thuật pull-down 39 Xác định điểm tương tác protein AtMYB77 40 44 44 44 45 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate bp Base pair ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria – Bertani MAPK Mitogen activated protein kinase MYB Myeloblastosis PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris – acetate – EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page DANH MỤC HÌNH ST T T ng n h 1.1 1.2 M 1.3 ot H 1.4 ọD ẫ n 1.5 H o 2.1 C 2.2 ấS 2.3 Đ o n 2.4 tr C 3.1 ấK 2 2 3 3.2 hK i 3.3 ể m 3.4 t 3.5 rK 3.6 iể K iể m 3.7 tr a s 3.8 Đ 3.9 ặK iể m 3.1 tr ac 4 4 h Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page MỞ ĐẦU Trong nhiều năm gần đây, nghiên cứu điều hòa biểu gen diễn mạnh mẽ khắp phòng thí nghiệm tồn cầu để đáp ứng nhu cầu hiểu biết q trình điều hòa biểu gen ứng dụng thực tiễn to lớn mà đem lại Điều hồ hoạt động gen q trình điều hồ lượng sản phẩm gen tạo qua trình phiên mã dịch mã tế bào đảm bảo cho hoạt động sống tế bào phù hợp với điều môi trường với phát triển bình thường thể Điều hồ hoạt động gen q trình có tham gia nhiều yếu tố tham gia Những nhân tố trực tiếp tham gia vào điều hòa hoạt động gen sinh vật nhân chuẩn nhân tố phiên mã (Transcription factor - TF), có chất protein Các nhân tố hoạt động riêng lẻ kết hợp thành phức hợp để điều hòa hoạt động gen mức độ khác Tuy nhiên để thực vai trò nhân tố phiên mã cần kích hoạt nhiều loại tín hiệu khác tế bào Tham gia vào trình tiếp nhận dẫn truyền tín hiệu bao gồm nhiều thành phần khác nhau, đóng vai trò chủ đạo protein kinase (PK) Trong protein kinase thuộc nhóm mitogen- activated protein kinase (MPKs cascade) biết đến với vai trò trung tâm Những protein nhóm tham gia vào hầu hết hoạt động sống phân hóa, biệt hóa sinh trưởng phát triển tế bào, dẫn truyền tín hiệu tế bào nhằm thích nghi với tác động môi trường MPKs cascades gồm ba lớp; protein thuộc nhóm MAPK kinase kinase (MPKKK, MEKK, MAP3K), protein thuộc nhóm MAPK kinase (MAPKK, MEK, MKK, MAP2K) protein thuộc nhóm MAPK (MPK) Việc dẫn truyền tín hiệu thơng qua MPKs cascades tương đối bảo thủ, protein kinase lớp hoạt hóa protein lớp thơng qua q trình phosphoryl hóa (phosphorylation) Sau hoạt hóa MPKKs, MPKs tiếp tục phosphoryl hóa chất Nhóm chất MPKs đa dạng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page bao gồm nhiều loại protein khác có nhân tố phiên mã (transcription factor) Arabidopsis thaliana biết đến mơ hình để thực Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page TÀI LIỆU THAM KHẢO Andreasson E, Jenkins T, Brodersen P, Thorgrimsen S, Petersen NH, Zhu S, Qiu JL, Micheelsen P, Rocher A, Petersen M, Newman MA, Bjorn Nielsen H, Hirt H, Somssich I, Mattsson O, Mundy J (2005) The MAP kinase substrate MKS1 is a regulator of plant defense responses EMBO J 24: 2579-2589 Bethke G, Unthan T, Uhrig JF, Poschl Y, Gust AA, Scheel D, Lee J (2009) Flg22 regulates the release of an ethylene response factor substrate from MAP kinase in Arabidopsis thaliana via ethylene signaling Proc Natl Acad Sci U S A 106: 80678072 Caspersen MB, Qiu JL, Zhang X, Andreasson E, Naested H, Mundy J, Svensson B (2007) Phosphorylation sites of Arabidopsis MAP kinase substrate (MKS1) Biochim Biophys Acta 1774: 1156-1163 Chin-Min Hwa X-CY (2008) The AtMKK3 pathway mediates ABA and salts signaling in Arabidopsis Act Physiol Plant 30: 277-286 Colcombet J, Hirt H (2008) Arabidopsis MAPKs: a complex signalling network involved in multiple biological processes Biochem J 413: 217-226 Djamei A, Pitzschke A, Nakagami H, Rajh I, Hirt H (2007) Trojan horse strategy in Agrobacterium transformation: abusing MAPK defense signaling Science 318: 453-456 Feilner T, Hultschig C, Lee J, Meyer S, Immink RG, Koenig A, Possling A, Seitz H, Beveridge A, Scheel D, Cahill DJ, Lehrach H, Kreutzberger J, Kersten B (2005) High throughput identification of potential Arabidopsis mitogen-activated protein kinases substrates Mol Cell Proteomics 4: 1558-1568 Gudesblat GE, Iusem ND, Morris PC (2007) Guard cell-specific inhibition of Arabidopsis MPK3 expression causes abnormal stomatal responses to abscisic acid and hydrogen peroxide New Phytol 173: 713-721 Jonak C, Okresz L, Bogre L, Hirt H (2002) Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signalling Curr Opin Plant Biol 5: 415-424 10 Jung C, Seo JS, Han SW, Koo YJ, Kim CH, Song SI, Nahm BH, Choi YD, Cheong JJ (2008) Overexpression of AtMYB44 enhances stomatal closure to confer abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis Plant Physiol 146: 623-635 11 Jung C, Shim JS, Seo JS, Lee HY, Kim CH, Choi YD, Cheong JJ (2010) Non-specific phytohormonal induction of AtMYB44 and suppression of jasmonate-responsive gene activation in Arabidopsis thaliana Mol Cells 29: 71-76 12 Larsen MR, Thingholm TE, Jensen ON, Roepstorff P, Jorgensen TJ (2005) Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns Mol Cell Proteomics 4: 873-886 13 Lee JS, Wang S, Sritubtim S, Chen JG, Ellis BE (2009) Arabidopsis mitogen-activated protein kinase MPK12 interacts with the MAPK phosphatase IBR5 and regulates auxin signaling Plant J 57: 975-985 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 14 Link V, Sinha AK, Vashista P, Hofmann MG, Proels RK, Ehness R, Roitsch T (2002) A heat-activated MAP kinase in tomato: a possible regulator of the heat stress response FEBS Lett 531: 179-183 15 Liu L, White MJ, MacRae TH (1999) Transcription factors and their genes in higher plants functional domains, evolution and regulation Eur J Biochem, 262, 247-257 16 Liu XM, Kim KE, Kim KC, Nguyen XC, Han HJ, Jung MS, Kim HS, Kim SH, Park HC, Yun DJ, Chung WS (2010) Cadmium activates Arabidopsis MPK3 and MPK6 via accumulation of reactive oxygen species Phytochemistry 71: 614-618 17 Liu Y, Zhang S (2004) Phosphorylation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase by MPK6, a stress-responsive mitogen-activated protein kinase, induces ethylene biosynthesis in Arabidopsis Plant Cell 16: 3386-3399 18 MAPK-Group (2002) Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature TRENDS in Plant Science 7: 19 Menke FL, Kang HG, Chen Z, Park JM, Kumar D, Klessig DF (2005) Tobacco transcription factor WRKY1 is phosphorylated by the MAP kinase SIPK and mediates HR-like cell death in tobacco Mol Plant Microbe Interact 18: 1027-1034 20 Merkouropoulos G, Andreasson E, Hess D, Boller T, Peck SC (2008) An Arabidopsis protein phosphorylated in response to microbial elicitation, AtPHOS32, is a substrate of MAP kinases and J Biol Chem 283: 10493-10499 21 Mitsuda N, Ohme-Takagi M (2009) Functional analysis of transcription factors in Arabidopsis Plant Cell Physiol, 50, 1232-1248 22 Mizoguchi T, Ichimura K, Shinozaki K (1997) Environmental stress response in plants: the role of mitogen-activated protein kinases Trends Biotechnol 15: 15-19 23 Nguyen XC, Kim SH, Lee K, Kim KE, Liu X-M, Han HJ, Hoang MHT, Lee S-W, Hong JC, Moon YH, Chung WS (2012) Identification of a C2H2-type zinc finger transcription factor (ZAT10) from Arabidopsis as a substrate of MAP kinase Plant Cell Reports 31(4):737-45 24 Ortiz-Masia D, Perez-Amador MA, Carbonell J, Marcote MJ (2007) Diverse stress signals activate the C1 subgroup MAP kinases of Arabidopsis FEBS Lett 581: 1834-1840 25 Popescu SC, Popescu GV, Bachan S, Zhang Z, Gerstein M, Snyder M, Dinesh-Kumar SP (2009) MAPK target networks in Arabidopsis thaliana revealed using functional protein microarrays Genes Dev 23: 80-92 26 Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang C, Keddie J, Adam L, Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR (2000) Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes Science, 290, 2105-2110 27 Riechmann JL, Ratcliffe OJ (2000) A genomic perspective on plant transcription factors Curr Opin Plant Biol, 3, 423-434 28 Rodriguez MC, Petersen M, Mundy J (2010) Mitogen-activated protein kinase signaling in plants Annu Rev Plant Biol 61: 621-649 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 29 Romero I, Fuertes A, Benito MJ, Malpica JM, Leyva A, Paz-Ares J (1998) More than 80R2R3-MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana Plant J, 14, 273-284 30 Sharrocks AD, Yang SH, Galanis A (2000) Docking domains and substrate-specificity determination for MAP kinases Trends Biochem Sci 25: 448-453 31 Shin R, Burch AY, Huppert KA, Tiwari SB, Murphy AS, Guilfoyle TJ, Schachtman DP (2007) The Arabidopsis transcription factor MYB77 modulates auxin signal transduction Plant Cell, 19, 2440-2453 32 Stracke R, Werber M, Weisshaar B (2001) The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana Curr Opin Plant Biol 4: 447-456 33 Takahashi F, Yoshida R, Ichimura K, Mizoguchi T, Seo S, Yonezawa M, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2007) The mitogen-activated protein kinase cascade MKK3-MPK6 is an important part of the jasmonate signal transduction pathway in Arabidopsis Plant Cell 19: 805-818 34 Urao T, Yamaguchi-Shinozaki K, Urao S, Shinozaki K (1993) An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence Plant Cell 5: 1529-1539 35 Xing Y, Jia W, Zhang J (2008) AtMKK1 mediates ABA-induced CAT1 expression and H2O2 production via AtMPK6-coupled signaling in Arabidopsis Plant J 54: 440451 36 Yoo SD, Cho YH, Tena G, Xiong Y, Sheen J (2008) Dual control of nuclear EIN3 by bifurcate MAPK cascades in C2H4 signalling Nature 451: 789-795 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 ... Biểu hai protein tái tổ hợp AtMYB77 AtMPK3 vi khuẩn E coli Kiểm tra tương tác hai protein AtMYB77 AtMPK3 điều kiện in vitro Xác định chế tương tác hai protein thông qua việc xác định điểm tương tác. .. cứu mối quan hệ hai protein AtMYB77 AtMPK3 từ kiểm tra xác định xem hai protein có tương tác với điều kiện in vitro hay không Nội dung nghiên cứu Tách dòng gen mã hóa protein AtMYB77 Arabidopsis... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÙI MẠNH HÙNG XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA HAI PROTEIN AtMPK3 VÀ AtMYB77 TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH