BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER Mã sớ: NCST 2011-05 Chủ nhiệm đề tài NCS Trần Thanh Trúc Cần Thơ, tháng 12/2011 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER Mã số: NCST 2011-05 Xác nhận trường Đại học Cần Thơ (ký, họ tên, đóng dấu) Cần Thơ, tháng 12/2011 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI NCS Trần Thanh Trúc, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ PGs Ts Nguyễn Văn Mười, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Ts Nguyễn Văn Thành, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Tấn Đạt, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa 15, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa 17, Trường Đại học Cần Thơ Vương Tố Trinh, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa 17, Trường Đại học Cần Thơ Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH HÌNH iv DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi THUẬT NGỮ vi x Chương PHẦN MỞ ĐẦU 11 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 11 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 11 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 11 1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 1.5 ĐỐI TƯỢNG & PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .12 PHẦN 13 Chương LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .13 2.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTIN METHYLESTERASE 13 2.1.1 Khái quát chung 13 2.1.2 Đặc tính sinh lý enzyme PME 13 2.1.3 Các nguồn enzyme PME tự nhiên 14 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme PME .16 2.1.5 Ứng dụng enzyme PME chế biến thực phẩm .18 2.2 CƠ SỞ CỦA VIỆC THU NHẬN ENZYME TỪ ASPERGILLUS NIGER 20 2.3 CÁC BIỆN PHÁP TINH SẠCH PECTIN METHYLESTERASE 21 2.3.1 Tinh sơ enzyme PME từ A niger phương pháp kết tủa 21 2.3.2 Ứng dụng kỹ thuật lọc màng tinh enzyme 23 2.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENZYME BẰNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI 23 2.5 ĐỘNG HỌC ENZYME 24 2.5.1 Khái niệm enzyme cấu tạo hóa học 24 2.5.2 Động học phản ứng enzyme 25 2.5.3 Phân tích động học q trình xử lý nhiệt enzyme 26 Trang i Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ 2.6 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN .30 Chương PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 33 3.1.1 Địa điểm, thời gian .33 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 33 3.1.3 Thiết bị, hoá chất 33 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 34 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 34 3.2.2 Phương pháp phân tích đo đạc kết 34 3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 35 3.3.1 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng loại hóa chất tỷ lệ sử dụng đến khả kết tủa enzyme PME từ A niger 35 3.3.2 Thí nghiệm Đánh giá khả tinh enzyme PME từ A niger phương pháp lọc màng .36 3.3.3 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 37 3.3.4 Thí nghiệm Nghiên cứu thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A niger theo nhiệt độ38 3.3.5 Thí nghiệm Động học vô hoạt nhiệt enzyme PME từ A niger 38 3.3.6 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng pH mơi trường đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 39 3.3.7 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng NaCl CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 40 3.4 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU .41 Chương KẾT QUẢ THẢO LUẬN 42 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI HÓA CHẤT VÀ TỶ LỆ SỬ DỤNG ĐẾN KHẢ NĂNG KẾT TỦA ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS NIGER .42 4.1.1 Đánh giá khả kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger (NH4)2SO4 42 4.1.2 Đánh giá khả kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger NaCl 44 4.1.3 Ảnh hưởng việc sử dụng dung môi hữu đến khả kết tủa enzyme PME từ A niger 44 4.1.4 Tinh sơ enzyme PME từ Aspergillus niger phương pháp lọc màng.47 Trang ii Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NỐNG ĐỘ PECTIN ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS NIGER .49 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER .51 4.4 ĐỘNG HỌC SỰ VÔ HOẠT NHIỆT CỦA PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER .52 4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA Ph ĐẾN SỰ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER .54 4.6 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NACℓ VÀ CACℓ2 ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER 55 4.6.1 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 55 4.6.2 Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A niger .56 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 KẾT LUẬN 58 ĐỀ NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC xi Trang iii Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết methyl ester pectin với xúc tác enzyme PME 13 Hình 2: Phức hợp pectate calcium 18 Hình 3: Tác dụng enzyme PME quá trình làm nước 19 Hình 4: Nấm mốc A niger .20 Hình 5: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 kết tủa protein 22 Hình 6: Hình minh họa động học theo phản ứng bậc 27 Hình 7: Hình minh họa động học theo phản ứng chuyển đổi phần 28 Hình 8: Hình minh họa ảnh hưởng nhiệt đến số tốc độ phản ứng 29 Hình 9: Thiết bị lọc màng .37 QuixStand Benchtop System 37 Hình 10: Kết điện di gel SDS–PAGE các mẫu enzyme PME từ A niger 48 Hình 11: Ảnh hưởng nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 50 Hình 12: Phương trình biểu thị vơ hoạt nhiệt enzyme PME từ A niger .53 Trang iv Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Đặc tính sinh hóa sớ enzyme PME sau tinh từ thực vật 15 Bảng 2: Thông số động học Km số enzyme 26 Bảng 3: Phương pháp phân tích đo đạc các chỉ tiêu 34 Bảng 4: Hiệu tinh enzyme PME phương pháp kết tủa với (NH4)2SO4 .42 Bảng 5: Hiệu tinh enzyme PME phương pháp kết tủa với NaCl 44 Bảng 6: Hiệu tinh enzyme PME phương pháp kết tủa với ethanol 45 Bảng 7: Hiệu tinh enzyme PME phương pháp kết tủa với aceton 45 Bảng 8: So sánh hiệu tinh enzyme PME các loại hóa chất khác 46 Bảng 9: Hiệu tinh enzyme PME từ A niger sau quá trình lọc màng .47 Bảng 10: Ảnh hưởng nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 50 Bảng 11: Sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A niger ảnh hưởng nhiệt độ 51 Bảng 12: Các thông số động học quá trình bất hoạt nhiệt enzyme PME từ A niger 53 Bảng 13: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 54 Bảng 14: Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 56 Bảng 15: Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 56 Trang v Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A niger Aspergillus niger A awamori Aspergillus awamori A aculeatus Aspergillus aculeatus Cfu Colony forming unit (số khuẩn lạc) DE Degree of esterification (độ ester hóa) PE Pectin esterase PG Polygalacturonase PL Pectat lyase PME Pectin methylesterase SSF Solid state fermentation (lên men rắn) U Đơn vị hoạt tính enzyme THUẬT NGỮ Pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger: enzyme PME thu nhận từ q trình trích ly sinh khối nấm mốc sau Aspergillus niger trình lên men rắn hay lỏng, Aspergillus niger điều kiện lên men thích hợp Trang vi Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Đơn vị: Khoa Nơng nghiệp & Sinh học Ứng dụng THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung Tên đề tài: Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất pectin methylesterase từ Aspergillus niger Mã số: NCST 2011 - 05 Chủ nhiệm đề tài: Ths Trần Thanh Trúc Tel.: 0710.3831530 (8309) E-mail: tttruc@ctu.edu.vn Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Cần Thơ Thời gian thực hiện: tháng (từ tháng 01 2011 đến tháng 31 12 2011) Mục tiêu Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ, thời gian gia nhiệt, pH, nồng độ NaCl, nồng độ CaCl2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A.niger Tính sáng tạo Pectin methylesterase (PME) là enzyme có ứng dụng quan trọng lãnh vực chế biến rau, củ, quả; đặc biệt cải thiện cấu trúc nguyên liệu Tuy nhiên, nghiên cứu ứng dụng của enzyme này Việt Nam là khái niệm mẻ, đồng thời giá nhập ngoại của enzyme này cao Việc xác định tính chất của enzyme này sau tiến trình sinh tổng hợp PME từ A niger có ý nghĩa ứng dụng cao Kết nghiên cứu Kết thí nghiệm cho thấy, kết tủa enzyme PME thô từ A niger ethanol với tỷ lệ 3:1 (v/v) là tốt nhất, thể hiện hoạt tính riêng là 10,02 U/mg protein, hiệu suất thu hồi 91,48% và độ tinh tăng gấp 7,98 lần so với mẫu enzyme thô Sau kết tủa với ethanol, tiến hành lọc màng khoảng phân đoạn 50 kDa thu enzyme PME có hoạt tính riêng đạt 15,63 U/mg protein, độ tinh tăng 12,40 ± 0,89 lần so sánh với mẫu enzyme thơ Enzyme PME từ A niger có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa, số Michealis–Menten (Km) của enzyme PME đạt là 0,6668 ± 0,0379 g/L Hoạt tính của enzyme PME từ A niger thể hiện cao 40 oC, pH môi trường 5,0 CaCl2 và NaCl đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của enzyme PME từ Trang vii Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ Tucker G.A (1993), Introduction In: Seymorr G., J Taylor and G Tucker (edition), Biochemistry of fruit ripening, Chapman and Hall, London van Dijck P W.M., G.C.M Selten and R.A Hempenius (2003), On the safety of a new generation of DSM Aspergillus niger enzyme production strains, Regulatory Toxicology and Pharmacology 38, pp 27–35 Willats W G T., L McCartney, W Mackie & J P Knox, (2001) Pectin: cell biology and prospects for functional analysis Plant Molecular Biology, 47, pp 9–27 Willats W G T., P Knox & J D Mikkelsen, (2006) Pectin: new insights into an old polymer are starting to gel Trends in Food Science & Technology, 17, pp 97– 104 Trang 63 Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC P.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp trích ly PME Trích ly dung dịch đệm sodium acetat Để trích ly enzyme, bổ sung dung dịch đệm sodium acetat 0,05 N, pH 4,5 với tỉ lệ 40mL/100g sinh khối, khuấy gián đoạn khoảng Sau lọc hỗn hợp vải lọc, dung dịch xem là dịch chứa enzyme thơ Phương pháp xác định hoạt tính của PME Phương pháp xác định hoạt tính PME (theo Crelier et al., 1995; trích dẫn Duvetter, 2007) (i) Nguyên tắc Phương pháp dựa sở thủy phân dung dịch pectin enzyme PME Hoạt tính PME xác định cách đo lường lượng acid galacturonic giải phóng đơn vị thời gian nhiệt độ và pH khơng đổi (ii) Hóa chất – Dung dịch pectin 3,5g/L (Pectin táo DE 75%, Sigma) dung dịch NaCl 0,12M Cân khối lượng pectin và NaCl cần thiết Trộn đều NaCl và pectin (để tránh pectin vón cục), rắc từ từ hỗn hợp vào cốc nước cất đun nóng sẵn đồng thời khuấy đều máy khuấy từ Để yên nhiệt độ phòng để pectin trương nở và hòa tan, sau để khoảng 12 nhiệt độ ÷ °C Sau dung dịch làm nóng đến 20 °C và chuyển vào bình định mức có dung tích thích hợp và định mức tới vạch ngấn nước cất, lắc đều và lọc qua hai lớp vải màn có Bảo quản dung dịch nhận tủ lạnh thời gian ngày – Dung dịch NaOH 0,01N (iii) Tiến hành Chuẩn bị cốc thủy tinh nhỏ Lấy 30mL dung dịch pectin pha sẵn cho vào cốc, điều chỉnh pH dung dịch pectin đến 4,5 dung dịch NaOH 0,01N Sau bổ sung 250µL dung dịch enzyme vào cốc, cốc lại bổ sung 250µL dung dịch enzyme bị vơ hoạt (100 0C, 30 phút) làm mẫu đối chứng Trong suốt trình enzyme thủy phân pectin, pH dung dịch đuợc giữ không đổi (pH 4,5 nhiệt độ 30±1 °C) cách bổ sung NaOH 0,01N Trang xi Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ (iv) Kết quả: Hoạt tính PME là số mili đương lượng của este thủy phân phút 1g enzyme Cách pha dung dịch đệm citrate–phosphate (pH 2,2 ÷ 8,0) pH Na2HPO4 0,2M (mL) Acid citric 0,1M (mL) 2,2 0,4 19,6 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 1,24 2,18 3,17 4,11 4,94 5,7 6,44 7,1 7,71 8,28 8,82 9,35 9,86 10,3 10,72 11,15 11,6 12,09 12,63 13,22 13,85 14,55 15,45 16,47 17,39 18,17 18,73 19,15 19,45 18,76 17,82 16,83 15,89 15,06 14,3 13,56 12,9 12,29 11,72 11,18 10,65 10,14 9,7 9,28 8,85 8,4 7,91 7,37 6,78 6,15 5,45 4,55 3,53 2,61 1,83 1,27 0,85 0,55 (Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa, 2002) Xác định protein theo phương pháp Bradford Hàm lượng protein xác định với thuốc thử Coomassie Brillant Blue (CBB) G 250 theo Bradford (1976) CBB G 250 kết hợp với protein điều kiện acid tạo nên phức màu tím hấp thu ánh sáng bước sóng 595 nm Độ hấp thu tỉ lệ thuận với hàm lượng protein dung dịch Thiết lập đường chuẩn protein, Bovin serum Albumin (BSA) với nồng độ tăng dần từ 20– 300µg/ml, dựa vào đường chuẩn này suy nồng độ protein mẫu Trang xii Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ Chuẩn bị dung dịch Bradford: hòa tan 100 mg CBB G 250 50 mL ethanol 95% , thêm 100 mL acid phosphoric 85% khuấy đều, thêm nước cất dến lít Sau lọc giấy lọc Whatman No1 và trữ chai tối nhiệt độ phòng Phương pháp điện di SDS – PAGE xác định khối lượng phân tử và điểm đẳng điện Mẫu SDS–PAGE thực hiện theo phương pháp Laemmli (1970, trích dẫn Đặng Thị Thu & Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b), hệ thống điện di mini protein II (Bio–Rad), với nồng độ gel tập trung là 4% và gel phân tích là 10% Điện di tiến hành với cường độ dòng điện 20 mA và điện thế 40V, Gel nhuộm dung dịch Coomassie Blue G 250 và giải nhuộm dung dịch methanol: acid acetic: nước (25:10:75) Hiệu suất trích ly P = S1 / So Trong đó: S1 : hoạt tính riêng của PME sau tinh So : hoạt tính riêng của PME trước tinh Bảng tra nồng độ ḿi (NH4)2SO4 bão hòa (Nguồn: Scopes, 1994) Trang xiii Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường P.2 Trường Đại học Cần Thơ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Ảnh hưởng (NH4)2SO4 đến khả kết tủa enzyme PME từ A niger 1.1 Ảnh hưởng tỷ lệ (NH4)2SO4 sử dụng đến hoạt tính riêng enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hoat tinh rieng PME – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le ammoniumsul 64.9364 10.8227 163.42 0.0000 RESIDUAL 0.927163 14 0.066226 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 65.8636 20 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng PME by Ty le ammoniumsulfat –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.23013 X 35-45 1.87009 X 45-55 3.08454 X 85-95 3.59636 X 75-85 4.49899 X 65-75 5.06633 X 55-65 6.75081 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ (NH4)2SO4 sử dụng đến hiệu suất thu hồi enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hieu suat thu hoi – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le amoniumsul 13818.1 2303.01 895.74 0.0000 RESIDUAL 35.9951 14 2.57108 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 13854.0 20 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le ammoniumsulfat –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 85-95 18.6846 X 75-85 27.6532 X 35-45 32.287 X 65-75 34.5291 X 45-55 38.3408 X 55-65 61.5097 X 100.0 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Trang xiv Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ 1.3 Ảnh hưởng tỷ lệ (NH4)2SO4 sử dụng đến độ tinh enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Do tinh sach – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le ammoniumsul 43.0229 7.17048 130.95 0.0000 RESIDUAL 0.766611 14 0.0547579 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 43.7895 20 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le ammoniumsulfat –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.0 X 35-45 1.52836 X 45-55 2.53865 X 85-95 2.92842 X 75-85 3.66338 X 65-75 4.13406 X 55-65 5.49864 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Ảnh hưởng NaCl đến khả kết tủa enzyme PME từ A niger 2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ NaCl sử dụng đến hoạt tính riêng enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hoat tinh tieng PME – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le natri chlo 129.498 25.8997 624.78 0.0000 RESIDUAL 0.49745 12 0.0414542 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 129.996 17 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh tieng PME by Ty le natri chloride –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.16449 X 0-0.15 1.99029 X 0.15-0.2 4.23667 X 0.2-0.25 6.02516 X 0.3-0.35 7.56056 X 0.25-0.3 8.35859 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Trang xv Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ NaCl sử dụng đến hiệu suất thu hồi enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hieu suat thu hoi – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le natri chlo 9931.32 1986.26 474.75 0.0000 RESIDUAL 50.2054 12 4.18379 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 9981.52 17 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le natri chloride –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 0-0.15 33.7818 X 0.15-0.2 51.42 X 0.2-0.25 78.849 X 0.3-0.35 84.7534 X 0.25-0.3 93.1988 X 100.0 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ NaCl sử dụng đến độ tinh enzyme PME từ niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Do tinh sach – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le natri chlo 82.0925 16.4185 87.11 0.0000 RESIDUAL 2.26188 12 0.18849 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 84.3544 17 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le natri chloride –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.0 X 0-0.15 1.61665 X 0.15-0.2 3.44589 X 0.2-0.25 4.93658 X 0.3-0.35 5.87234 X 0.25-0.3 6.82998 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Trang xvi Trang A Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ Ảnh hưởng ethnol đến khả kết tủa enzyme PME từ A niger 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ ethnol sử dụng đến hoạt tính riêng enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hoat tinh rieng PME – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le ethanol 215.41 35.9017 924.17 0.0000 RESIDUAL 0.543864 14 0.0388474 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 215.954 20 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng PME by Ty le ethanol –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Ty le ethanol Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.23013 X 1.5 1.66063 X 2.9039 X 3.19575 X 2.5 5.02759 X 3.5 8.7617 X 3 10.0323 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ ethnol sử dụng đến hiệu suất thu hồi enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hieu suat thu hoi – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le ethanol 12208.7 2034.78 727.10 0.0000 RESIDUAL 39.179 14 2.7985 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 12247.8 20 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le ethanol –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Ty le ethanol Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.5 32.5859 X 41.4051 X 51.42 X 2.5 76.6816 X 3.5 80.568 X 3 92.003 X 100.0 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Trang xvii Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ ethnol sử dụng đến độ tinh enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Do tinh sach – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le ethanol 133.649 22.2748 98.81 0.0000 RESIDUAL 3.15612 14 0.225437 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 136.805 20 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le ethanol –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Ty le ethanol Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.0 X 1.5 1.35651 X 2.38915 X 2.61569 X 2.5 4.09846 X 3.5 7.1759 X 3 7.78306 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Ảnh hưởng aceton đến khả kết tủa enzyme PME từ A niger 4.1 Ảnh hưởng tỷ lệ aceton sử dụng đến hoạt tính riêng enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hoat tinh rieng – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le aceton 17.9001 4.47503 35.22 0.0000 RESIDUAL 1.27052 10 0.127052 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 19.1706 14 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng by Ty le aceton –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Ty le aceton Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.23013 X 1.24864 X 2,5 1.90947 X 2.46907 X 1,5 4.19114 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Trang xviii Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ 4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ aceton sử dụng đến hiệu suất thu hồi enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hieu suat thu hoi – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le aceton 16061.9 4015.48 3571.56 0.0000 RESIDUAL 11.2429 10 1.12429 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 16073.2 14 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le aceton –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Ty le aceton Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 2,5 13.4155 X 15.0747 X 18.6547 X 1,5 32.9671 X 100.0 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ aceton sử dụng đến độ tinh enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Do tinh sach – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Ty le aceton 11.66 2.91499 171.70 0.0000 RESIDUAL 0.169776 10 0.0169776 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 11.8297 14 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le aceton –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Ty le aceton Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 1.0 X 1.0151 X 2,5 1.55969 X 2.004 X 1,5 3.39104 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Trang xix Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ So sánh hiệu tinh sơ enzyme PME từ A niger các loại hoá chất các tỷ lệ tối ưu 5.1 Ảnh hưởng loại hoá chất tỷ lệ tối ưu đến hoạt tính riêng enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hoat tinh rieng – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Hoa chat 94.785 23.6963 118481.30 0.0000 RESIDUAL 0.001 0.0002 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 94.786 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng by Hoa chat –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Hoa chat Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Enzyme tho 1.26 X Aceton 1,5:1 4.4 X Amoniumsulphat 6.87 X Sodiumcloride 32 8.37 X Ethanol 3:1 10.02 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 5.2 Ảnh hưởng loại hoá chất tỷ lệ tối ưu đến hiệu suất thu hồi enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Hoa chat 6167.3 1541.83 9636407.52 0.0000 RESIDUAL 0.0008 0.00016 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 6167.3 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Hoa chat –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Hoa chat Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Aceton 1,5:1 33.54 X Amoniumsulphat 62.23 X Ethanol 3:1 91.48 X Sodiumcloride 32 92.6 X Enzyme tho 100.0 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Trang xx Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ 5.3 Ảnh hưởng loại hoá chất tỷ lệ tối ưu đến độ tinh enzyme PME từ A niger sau kết tủa Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Do tinh sach – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Hoa chat 60.3514 15.0879 94299.12 0.0000 RESIDUAL 0.0008 0.00016 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 60.3522 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Do tinh sach by Hoa chat –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Hoa chat Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Enzyme tho 1.0 X Aceton 1,5:1 3.47 X Amoniumsulphat 5.45 X Sodiumcloride 32 6.67 X Ethanol 3:1 7.98 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Ảnh hưởng nồng độ pectin (g/L) đến hoạt tính enzyme PME từ A niger Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Hoat tinh PME – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Nong pectin 8289.83 921.093 6181.83 0.0000 RESIDUAL 2.98 20 0.149 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 8292.81 29 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh PME by Nong pectin –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Nong pectin Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 0.0 X 0.25 14.4667 X 0.5 22.3667 X 33.4333 X 42.4 X 3.5 46.3 X 47.3667 X 49.1333 X 49.4 X 10 49.6333 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Trang xxi Trang Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ Giá trị tính toán Km Vmax cho PME từ A.niger Approx Parameter vmax Estimate Std Error 54.1105 0.6660 52.5746 55.6463 0.6668 0.0379 0.5793 0.7542 Km Approximate 95% Confidence Limits Approximate Correlation Matrix vmax vmax Km 1.0000000 0.7726469 Km 0.7726469 1.0000000 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme PME từ A niger Bảng phân tích phương sai Analysis of Variance for Muc thay doi hoat tinh – Type III Sums of Squares –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– MAIN EFFECTS A:Nhiet 10.9464 1.8244 21284.67 0.0000 RESIDUAL 0.0012 14 0.0000857143 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– TOTAL (CORRECTED) 10.9476 20 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Muc thay doi hoat tinh by Nhiet –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count LS Mean Homogeneous Groups –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 60 0.49 X 30 1.0 X 55 1.18 X 35 1.64 X 50 1.83 X 45 2.16 X 40 2.83 X –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Tham số động học vô hoạt nhiệt enzyme PME từ A niger 8.1 Ở 50 oC Source Model Error Uncorrected Total Parameter Ffinal k Estimate 2.2905 0.1350 DF 11 Sum of Squares 1.4305 0.000367 1.4309 Std Error 0.1316 0.00193 Mean Square 0.7153 0.000041 F Value 17540.7 Approx Pr > F F F