BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC Biên soạn: Th.S Huỳnh Nguyễn Anh Khoa Th.S Vũ Thị Phương Mai www.hutech.edu.vn THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC Ấn 2018 Các ý kiến đóng góp tài liệu học tập này, xin gửi e-mail ban biên tập: tailieuhoctap@hutech.edu.vn Error! No text of specified style in document I MỤC LỤC MỤC LỤC I HƯỚNG DẪN IV BÀI 1: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG THỰC HÀNH VI SINH 1.1 SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 1.1.1 Các phận kính hiển vi quang học 1.1.2 Nguyên lý hoạt động kính hiển vi 1.1.3 Nguyên tắc sử dụng bảo quản kính hiển vi 10 1.1.4 Thao tác sử dụng kính hiển vi 10 1.2 KỸ THUẬT CẤY VÀ PHÂN LẬP 13 1.2.1 Cấy vi khuẩn 13 1.2.2 Phân lập vi khuẩn 13 1.2.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập 14 1.2.4 Kỹ thuật cấy phân lập 15 1.3 KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG 18 1.3.1 Phương pháp nhiệt ẩm 18 1.3.2 Phương pháp nhiệt khô 19 1.3.3 Phương pháp Tyndall 19 1.3.4 Phương pháp lọc tiệt trùng 19 1.4 THỰC HÀNH 19 BÀI 2: NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN DỰA VÀO KHẢO SÁT HÌNH THÁIError! defined Bookmark not 2.1 CÁC BƯỚC CHUNG ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN Error! Bookmark not defined 2.2 LẤY MẪU Error! Bookmark not defined 2.2.1 Nguồn cung cấp mẫu Error! Bookmark not defined 2.2.2 Làm phong phú phân lập Error! Bookmark not defined 2.2.3 Giữ gốc di chuyển Error! Bookmark not defined 2.3 PHƯƠNG PHÁP NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN Error! Bookmark not defined 2.4 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM KHUẨN LẠC (ĐẠI THỂ) Error! Bookmark not defined 2.4.1 Khảo sát môi trường đặc Error! Bookmark not defined 2.4.2 Khảo sát môi trường lỏng Error! Bookmark not defined 2.5 KHẢO SÁT TẾ BÀO VI KHUẨN (VI THỂ) Error! Bookmark not defined 2.5.1 Khảo sát tính di động vi khuẩn sống Error! Bookmark not defined 2.5.2 Khảo sát hình dạng vi khuẩn sau nhuộm Error! Bookmark not defined 2.6 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined BÀI 3: NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN DỰA VÀO KHẢO SÁT TÍNH CHẤT SINH HĨA, SINH LÝ Error! Bookmark not defined 3.1 CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA Error! Bookmark not defined 3.1.1 Khảo sát khả dụng carbohydrate Error! Bookmark not defined Error! No text of specified style in document 3.1.2 Khảo sát khả sử dụng acid amin chứa lưu huỳnhError! defined Bookmark II not 3.1.3 Môi trường KIA (KLIGLER IRON AGAR) Error! Bookmark not defined 3.1.4 Khảo sát chế lên men đường Error! Bookmark not defined 3.1.5 Khả sử dụng citrate nguồn carbon nhấtError! defined Bookmark not 3.1.6 Khảo sát khả sử dụng acid amin có nhân indol Error! Bookmark not defined 3.1.7 Khảo sát khả sử dụng protein Error! Bookmark not defined 3.1.8 Khảo sát khả sử dụng urea Error! Bookmark not defined 3.1.9 Khảo sát diện catalase Error! Bookmark not defined 3.1.10 Phản ứng sinh hóa số vi khuẩn Error! Bookmark not defined 3.2 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA YẾU TỐ LÝ-HÓA Error! Bookmark not defined 3.2.1 Khảo sát tác động vật lý Error! Bookmark not defined 3.2.2 Tác động yếu tố hóa học Error! Bookmark not defined 3.3 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined BÀI 4: KHẢO SÁT VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT Error! Bookmark not defined 4.1 CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT Error! Bookmark not defined 4.2 CÁCH TRÍCH LY BỆNH PHẨM Error! Bookmark not defined 4.3 MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT Error! Bookmark not defined 4.3.1 Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar-NA) Error! Bookmark not defined 4.3.2 Môi trường phong phú Error! Bookmark not defined 4.3.3 Môi trường phân biệt Error! Bookmark not defined 4.3.4 Môi trường chọn lọc Error! Bookmark not defined 4.4 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined 4.4.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm Error! Bookmark not defined 4.4.2 Nhận định vi khuẩn gây bệnh Error! Bookmark not defined 4.4.3 Sơ đồ phân lập vi khuẩn gây bệnh đường ruột Error! Bookmark not defined BÀI 5: KHẢO SÁT VI KHUẨN GÂY BỆNH Ở CỔ HỌNG Error! Bookmark not defined 5.1 ĐẠI CƯƠNG Error! Bookmark not defined 5.2 MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT VÀ SỰ HUYẾT GIẢI Error! Bookmark not defined 5.3 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM Error! Bookmark not defined 5.3.1 Lấy bệnh phẩm Error! Bookmark not defined 5.3.2 Tìm vi khuẩn gây bệnh cổ họng Error! Bookmark not defined 5.4 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined BÀI 6: CÁC THỬ NGHIỆM VỀ KHÁNG SINH Error! Bookmark not defined 6.1 CÁC KHÁI NIỆM Error! Bookmark not defined 6.2 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU Error! Bookmark not defined 6.2.1 Định nghĩa Error! Bookmark not defined 6.2.2 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined 6.2.3 Phương pháp Error! Bookmark not defined 6.2.4 Tiến hành Error! Bookmark not defined Error! No text of specified style in document III 6.3 KHÁNG SINH ĐỒ Error! Bookmark not defined 6.3.1 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined 6.3.2 Phương pháp khuếch tán Kirby – Bauer Error! Bookmark not defined 6.3.3 Phối hợp kháng sinh Error! Bookmark not defined 6.3.4 Hậu phối hợp Error! Bookmark not defined 6.3.5 Phương pháp thăm dò phối hợp kháng sinh – phương pháp khuếch tán môi trường rắn Error! Bookmark not defined 6.4 BẢNG BIỆN GIẢI KHÁNG SINH ĐỒ Error! Bookmark not defined BÀI 7: ĐỊNH LƯỢNG MẬT ĐỘ VI SINH VẬT Error! Bookmark not defined 7.1 ĐẠI CƯƠNG Error! Bookmark not defined 7.2 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC Error! Bookmark not defined 7.2.1 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined 7.2.2 Cách thực Error! Bookmark not defined 7.3 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG TỚI HẠN Error! Bookmark not defined 7.3.1 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined 7.3.2 Cách thực Error! Bookmark not defined 7.4 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined Error! No text of specified style in document IV HƯỚNG DẪN MÔ TẢ MƠN HỌC Giáo trình “Thực hành vi sinh vật học” dành cho sinh viên năm thứ ngành Dược, trường Đại học Công Nghệ TP.HCM Cùng với môn Vi sinh – Ký sinh, phần quan trọng toàn khối kiến thức sở ngành, giúp sinh viên có hội thực hành trình, thao tác làm việc với vi sinh vật, ứng dụng vào nghiên cứu kiểm nghiệm vi sinh Qua đó, giúp cho sinh viên hiểu sâu lý thuyết học NỘI DUNG MÔN HỌC Bài 1: Các kỹ thuật phòng thí nghiệm vi sinh Bài 2: Nhận định vi khuẩn dựa vào khảo sát hình thái Bài 3: Nhận định vi khuẩn dựa vào khảo sát tính chất sinh hóa, sinh lý Bài 4: Khảo sát vi khuẩn gây bệnh đường ruột Bài 5: Khảo sát vi khuẩn gây bệnh cổ họng Bài 6: Các thử nghiệm kháng sinh Bài 7: Định lượng mật độ vi sinh vật KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ Môn học thực hành vi sinh vật học yêu cầu sinh viên học môn lý thuyết Vi sinh vật học, làm quen với cách sử dụng dụng cụ phòng thí nghiệm U CẦU MÔN HỌC Người học phải dự học đầy đủ buổi lên lớp làm báo cáo thực hành CÁCH TIẾP NHẬN NỘI DUNG MÔN HỌC Để học tốt môn này, người học cần đọc trước thực hành nhà để nắm kỹ phần lý thuyết thao tác thực hành Trong học, người học phải quan sát, ghi nhận mô tả tượng xảy tiến hành thí nghiệm Người học cần phải tập tính tỉ Error! No text of specified style in document V mĩ, chu đáo có khả dự trù trước diễn biến xảy mẫu vi sinh vật, để chuẩn bị cho thí nghiệm tiến hành cách sn sẻ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ MƠN HỌC Hình thức nội dung đánh giá môn học môn định, phù hợp với quy chế đào tạo tình hình thực tế nơi tổ chức học tập YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN Để làm thí nghiệm tốt, sinh viên phải chuẩn bị nhà: tính tốn số liệu cần thiết làm thí nghiệm, xem lại phần lý thuyết tài liệu tham khảo có liên quan, xếp cách khoa học kế hoạch tiến hành thí nghiệm buổi thực hành Khi làm việc phòng thí nghiệm phải tn thủ nghiêm nội quy phòng thí nghiệm Tuyệt đối khơng ăn, uống phòng thí nghiệm Hạn chế đeo trang sức (đồng hồ, vòng đeo tay…) phải thường xuyên sát trùng tay cồn Trong trình làm việc, bị thương phải nhanh chóng sát trùng vết thương băng bó cẩn thận trước tiếp xúc trở lại với vi sinh vật nhằm tránh nhiễm trùng Khi thí nghiệm xong, dọn dẹp dụng cụ, mẫu vật xử lý theo quy trình hướng dẫn Các mẫu có chứa vi sinh vật sống phải hấp bỏ theo quy trình trước rửa Rửa tay xà phòng trước rời khỏi phòng thí nghiệm Error! No text of specified style in document VI KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG THỰC HÀNH VI SINH Sau học xong này, sinh viên có thể: - Biết sử dụng kính hiển vi cho mục đích khác - Biết cách chuẩn bị dụng cụ để thực hành vi sinh Tiến hành kỹ thuật cấy phân lập - Trình bày nguyên tắc, cách vận hành thiết bị phạm vi áp dụng số phương pháp tiệt trùng hay dùng SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI Sử dụng kính hiển vi để: Khảo sát di động vi khuẩn Quan sát hình dạng, cách xếp, kích thước tế bào vi khuẩn Quan sát phận tế bào vi khuẩn: màng, tiêm mao, bào tử… Các phận kính hiển vi quang học Phần quang học a Bộ phận chiếu sáng Nguồn sáng: Các kính hiển vi quang học đại có nguồn sáng đèn Halogen đèn LED Các kính hiển vi loại cũ khơng có đèn chiếu sáng riêng nên trang bị gương lấy sáng để đưa nguồn sáng bên ngồi cung cấp cho kính Error! No text of specified style in document VII Tụ quang: Tụ quang hệ thấu kính có nhiệm vụ hội tụ tia sáng từ nguồn sáng vào vị trí tiêu cần quan sát Trong tụ quang có chắn sáng điều chỉnh mức độ đóng/mở để điều chỉnh lượng ánh sáng chiếu vào tiêu b Vật kính Vật kính phận quan trọng kính hiển vi Vật kính cấu tạo từ hệ thấu kính, thấu kính ngồi quan trọng nhất, định độ phóng đại kính, thấu kính lại có nhiệm vụ loại trừ quang sai giúp cho hình ảnh quan sát rõ nét Độ phóng đại vật kính ln ghi thân vật kính (Ví dụ: 40X nghĩa độ phóng đại 40 lần) Một kính hiển vi quang học thơng thường thường có vật kính: Vật kính 4X, 10X: thường dùng để quan sát tổng thể định vị vị trí quan sát Vật kính 40X: thường dùng để quan sát hình dạng vi khuẩn, quan sát di động vi khuẩn Vật kính 100X: thường dùng để quan sát phận tế bào vi khuẩn Để hình ảnh quan sát rõ, sử dụng, vật kính 100X phải nhúng chìm dầu cèdre Dầu cèdre có chiết suất lớn so với khơng khí, có tác dụng hạn chế tia sáng bị lạc hướng khỏi vật kính c Thị kính Thị kính hệ thống thấu kính giúp phóng đại lần hình ảnh vật kính cung cấp Thị kính thường có độ phóng đại 5X, 10X, 20X Độ phóng đại ghi thân thị kính Ngồi ra, thị kính giúp điều chỉnh tiêu cự phù hợp với người có tật khúc xạ mắt (cận thị, viễn thị) Phần học Gồm có: Thân kính, đế kính, bàn kính ốc điều chỉnh a Thân kính Error! No text of specified style in document VII I Thân kính mang tồn hệ thống quang học kính, phận giúp cầm nắm di chuyển kính Trên thân kính có bàn xoay để lắp vật kính, có vị trí lắp thị kính, vị trí gắn bàn kính ốc điều chỉnh b Bàn kính Bàn kính nơi đặt vật cần quan sát Trên bàn kính có phận kẹp giữ tiêu Bàn kính di chuyển lên - xuống, qua trái – qua phải tới – lui để đưa vật vào vị trí quan sát c Đế kính Nối liền với thân kính giúp nâng đỡ tồn kính Đế kính có vị trí lắp nguồn sáng d Ốc điều chỉnh Ốc điều chỉnh cường độ ánh sáng (có kính dùng nguồn sáng đèn): thường nằm đế kính, dùng để điều chỉnh công suất đèn chiếu sáng Ốc điều chỉnh cao độ bàn kính: gồm có ốc sơ cấp (nâng hạ bàn kính khoảng cách lớn) ốc vi cấp (nâng hạ bàn kính khoảng cách nhỏ) Ốc điều chỉnh vị trí bàn kính theo phương ngang: Gồm ốc điều chỉnh qua trái – qua phải ốc điều chỉnh tới – lui Ốc điều chỉnh vị trí tụ quang: thường gắn liền với tụ quang, giúp nâng hạ cao độ tụ quang Ốc bảo vệ: Gồm có ốc bảo vệ vật kính (giúp giới hạn cao độ bàn kính để ngăn cản bàn kính làm hỏng vật kính) ốc bảo vệ thị kính (cố định vị trí thị kính, giúp thị kính khơng bị xoay quan sát) Error! No text of specified style in document IX Các phận kính hiển vi Nguyên lý hoạt động kính hiển vi Thực chất, kính hiển vi hệ thấu kính giúp phóng đại vật quan sát Độ phóng đại kính hiển vi tích số độ phóng đại vật kính độ phóng đại thị kính Độ rõ nét ảnh quan sát định suất phân ly Kính có suất phân ly lớn phân biệt điểm có khoảng cách gần cho ảnh rõ nét Độ tương phản khả phân biệt vật cần quan sát môi trường chứa vật quan sát Đa số tế bào gần suốt nên quan sát cường độ ánh sáng cao khơng nhìn thấy rõ tế bào Lúc này, cần giảm công suất đèn giảm độ mở chắn sáng để làm tăng độ tương phản Error! No text of specified style in document X Nguyên tắc sử dụng bảo quản kính hiển vi Cầm di chuyển kính hai tay Chú ý cầm gọn dây nguồn cấp điện, không để vướng vật khác di chuyển Đặt kính mặt phẳng tĩnh, khơng bị rung động, khơng để kính bị ngã Chú ý khơng để gần kính vật dễ gây hư tổn kính như: đèn cồn, hóa chất có tính ăn mòn cao… Tối thiểu hóa thời gian bật đèn nguồn (tắt đèn nguồn khơng sử dụng) Chỉnh cao độ bàn kính mức thấp đặt vào lấy tiêu khỏi bàn kính (tránh va chạm với vật kính) Phải thận trọng điều chỉnh ốc sơ cấp sử dụng vật kính 40X 100X, khơng để tiêu chạm vào làm hỏng vật kính Khi chuyển từ vật kính 40X sang vật kính 100X, chỉnh ốc vi cấp, không chỉnh ốc sơ cấp Chỉ dùng vải chuyên dụng để lau vật kính thị kính (Sinh viên khơng tự ý lau vật kính thị kính) Thao tác sử dụng kính hiển vi a Sử dụng vật kính X4 X10 Thực bước theo thứ tự sau: Cắm điện, kiểm tra nguồn sáng Hạ bàn kính cao độ thấp Xoay mâm gắn vật kính vị trí vật kính 4X 10X Đặt tiêu vào bàn kính, điều chỉnh kẹp tiêu cho chắn Nhìn vào tiêu điều chỉnh vị trí bàn kính cho đốm sáng chiếu vào vị trí có mẫu vật Error! No text of specified style in document XI Nhìn vào thị kính, điều chỉnh khoảng cách hai ống thị kính cho thị trường nhập lại với Chú ý: phải nhìn mắt Vừa nhìn vào thị kính, vừa xoay ốc sơ cấp để điều chỉnh cao độ bàn kính đến thị trường thống xuất ảnh mẫu vật dừng lại Điều chỉnh ốc vi cấp để thấy rõ nét ảnh mẫu vật Sau quan sát xong, hạ bàn kính xuống vị trí thấp nhất, lấy mẫu vật Nếu khơng sử dụng tắt nguồn sáng b Sử dụng vật kính X40 Thực bước theo thứ tự sau: Thực thao tác để thấy ảnh rõ nét vật kính 10X Giữ nguyên vị trí bàn kính, xoay mâm gắn vật kính vị trí vật kính 40X Vừa nhìn vào thị kính, dùng tay xoay từ từ ống sơ cấp (xoay nấc) cho thoáng thấy ảnh mẫu vật Chú ý: Lúc bàn kính sát vật kính, khơng cẩn thận làm cho tiêu cấn vào vật kính, làm bể tiêu hư hỏng vật kính Khi thống thấy ảnh mẫu vật dừng lại điều chỉnh ốc vi cấp để nhìn rõ mẫu vật Sau quan sát xong, hạ bàn kính xuống vị trí thấp nhất, lấy mẫu vật Nếu khơng sử dụng tắt nguồn sáng c Sử dụng vật kính X100 Thực bước theo thứ tự sau: Thực thao tác để thấy ảnh rõ nét vật kính 40X Giữ nguyên vị trí bàn kính, xoay mâm gắn vật kính đến vị trí vật kính 40X vật kính 100X (lúc phía mẫu vật khoảng trống) Nhỏ giọt dầu cèdre lên phía mẫu vật Error! No text of specified style in document XII Khi dầu đọng thành giọt, nhanh chóng xoay mâm gắn vật kính vị trí vật kính 100X Lúc này, đầu chóp vật kính 100X nhúng ngập giọt dầu Vừa nhìn vào thị kính điều chỉnh ốc vi cấp cho thấy ảnh rõ nét (thông thường, cần điều chỉnh ốc vi cấp 1-2 vòng theo hướng hạ bàn kính xuống thấp thấy rõ ảnh) Lưu ý: Sau nhỏ dầu lên mẫu vật khơng dùng lại vật kính 40X để tránh vật kính 40X bị dính dầu Sau quan sát xong, xoay mâm gắn vật kính vị trí vật kính 4X (để tránh việc nâng hạ bàn kính làm va chạm vật kính 100X), hạ bàn kính xuống vị trí thấp nhất, lấy mẫu vật Nếu khơng sử dụng tắt nguồn sáng Trong trường hợp cần quan sát lại tiêu nhỏ dầu, tiến hành theo bước: Đảm bảo mâm gắn vật kính vị trí 4X, bàn kính vị trí thấp Đặt tiêu (đang có giọt dầu) vào bàn kính, điều chỉnh kẹp tiêu cho chắn Nếu giọt dầu đọng lại q ít, khơng đủ để nhúng ngập vật kính phải bổ sung thêm dầu Xoay mâm vật kính vị trí 100X Chú ý: nên xoay theo chiều từ vật kính 4X sang 100X, tránh trường hợp xoay ngang qua vật kính 40X làm dính dầu vào vật kính 40X Nhìn vào khoảng cách tiêu vật kính 100X, dùng hai tay, từ từ điều chỉnh ốc sơ cấp theo chiều nâng bàn kính lên đến đầu vật kính chuẩn bị chạm vào tiêu bản, đồng thời, vật kính nhúng ngập giọt dầu Chú ý: thao tác phải thực cách cẩn thận, làm cấn bể tiêu hỏng vật kính Nhìn vào thị kính, điều chỉnh ốc vi cấp để thấy hình ảnh rõ nét Chú ý: Khi xoay ốc vi cấp theo hướng nâng bàn kính lên phải cẩn thận làm bể tiêu gây hỏng vật kính Error! No text of specified style in document XII I KỸ THUẬT CẤY VÀ PHÂN LẬP Cấy vi khuẩn Cấy vi khuẩn chuyển vi khuẩn từ môi trường sang mơi trường khác Cây vi khuẩn nhằm mục đích: Chuyển gốc vi khuẩn chủng từ môi trường cũ sang môi trường để giữ giống, gọi cấy chuyền Cấy chuyền thường tiến hành định kỳ, thời gian dài ngắn tùy theo chủng Cấy vi khuẩn cần khảo sát lên môi trường nhằm để khảo sát hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa Cấy vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy để thu hoạch số lượng lớn vi khuẩn Phân lập vi khuẩn a Khái niệm vi khuẩn chủng Vi khuẩn chủng (giống chủng, chủng thuần): tập hợp vi khuẩn phát triển từ tế bào vi khuẩn ban đầu Như vậy, vi khuẩn chủng tập hợp vi khuẩn giống đặc điểm sinh lý sinh hóa Trong nghiên cứu thực hành sinh sinh vật, người ta tiến hành vi sinh vật chủng b Phân lập vi khuẩn Phân lập vi khuẩn kỹ thuật sử dụng để thu giống chủng từ hỗn hợp vi khuẩn ban đầu Nguyên tắc thực hiện: Trải vi khuẩn môi trường để làm cho mật độ vi khuẩn giảm dần đến tế bào hỗn hợp ban đầu tách rời khỏi thành tế bào riêng lẻ nằm xa Sau thời gian ủ, tế bào vi khuẩn rời rạc phát triển thành khuẩn lạc vi khuẩn (còn gọi khóm), Error! No text of specified style in document XIV vi khuẩn chủng Khi đó, cấy chuyền khuẩn lạc vi khuẩn sang môi trường khác để lưu giữ chủng vi khuẩn chủng Môi trường nuôi cấy, phân lập a Môi trường nuôi cấy, phân lập Môi trường nuôi cấy xem “phương tiện” để cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn sinh sống phát triển Môi trường thường pha chế thành thể rắn lỏng Môi trường lỏng thường dùng để nuôi thu hoạch số lượng lớn vi khuẩn (ví dụ: trình nhân giống, hoạt hóa giống…), khảo sát khả lên men,… Môi trường rắn pha chế cách bổ sung chất làm đông vào môi trường lỏng Agar chất làm đông thông dụng Môi trường rắn dùng để phân lập, giữ giống, khảo sát tính chất sinh hóa…Tùy vào dụng cụ chứa hình dạng khối môi trường sau đông lại mà môi trường rắn gọi tên khác thạch nghiêng, thạch đĩa, thạch đứng… Trường hợp cần thiết, giảm nồng độ chất làm đông để tạo thành dạng mơi trường có tính mềm, trung gian dạng rắn dạng lỏng, thường dùng khảo sát khả di động vi khuẩn Tùy vào thành phần môi trường, chủng vi khuẩn cấy mơi trường khác có loại môi trường: Môi trường bản: phần lớn chủng sinh sản phát triển mơi trường Ví dụ: Mơi trường canh thang dinh dưỡng Môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient (Nutrient Broth) chứa: Pepton 5g; Agar) chứa: Pepton 5g; Cao thịt bò 3g; Cao thịt bò 3g; Nước cất vừa đủ Agar 18g; Nước cất vừa đủ lít lít Error! No text of specified style in document XV Môi trường chọn lọc: cho loại vi khuẩn cần phân lập sinh sản phát triển Ví dụ mơi trường có chứa kháng sinh, môi trường Desoxycholat Citrat Agar (DCA), môi trường Salmonella-Shigella (SS), môi trường Bismuth Sulfite Agar (BSA) Môi trường phong phú: cho phép vi khuẩn cần nghiên cứu phát triển mạnh Ví dụ mơi trường selenit F Mơi trường phân biệt: cho phép nhiều chủng vi khuẩn phát triển chủng cho biểu khác Ví dụ: mơi trường Mac Conkey, mơi trường TCBS Kỹ thuật cấy phân lập a Kỹ thuật cấy chuyền Tiến hành theo bước sau: Đốt nóng đầu que cấy sau để nguội tự nhiên Cầm ống nghiệm giống vi khuẩn, mở nắp, hơ miệng ống nghiệm lửa Giữ khoảng cách miệng ống nghiệm bán kính cm xung quanh lửa Dùng đầu dây cấy lấy vi khuẩn Chú ý thao tác, tránh đưa đầu dây cấy vào lửa vi khuẩn sau lấy Thao tác cầy chuyền Error! No text of specified style in document XVI Đậy nắp ống nghiệm chứa giống, đặt xuống giá Cầm ống nghiệm chứa môi trường (cần cấy vào), mở nắp, hơ miệng ống nghiệm lửa Từ từ đưa đầu que cấy có chứa vi khuẩn vào ống nghiệm, trải vi khuẩn (nếu môi trường thạch) lắc nhẹ đầu que cấy (nếu môi trường lỏng) để chuyển vi khuẩn từ đầu que cấy vào môi trường Lấy que cấy khỏi ống nghiệm Hơ miệng ống nghiệm lửa đậy nắp Tiệt trùng đầu que cấy b Kỹ thuật cấy ria (cấy rạch, cấy phân lập) Tiến hành sau: Đốt dây cấy, để nguội, lấy vi khuẩn lên vòng cấy (lượng vi khuẩn cần lấy phụ thuộc mật độ ban đầu chủng gốc) Trải vi khuẩn lên đoạn A-B (khoảng cm) đĩa thạch (chú ý: mặt phẳng vòng dây cấy gần song song với đĩa thạch để tránh làm thủng bề mặt thạch) Đốt bỏ vi khuẩn thừa dây cấy làm nguội Trải vi khuẩn theo chiều từ B sang C Lưu ý: đường cấy phải rời khoảng 1-2 mm theo chiều Tại vị trí B, đầu dây cấy phải chạm vào vị trí có vi khuẩn trải Đốt bỏ vi khuẩn thừa dây cấy làm nguội Trải vi khuẩn theo chiều từ C sang D Lưu ý: đường cấy phải rời khoảng 2-3 mm theo chiều Tại vị trí C, đầu dây cấy phải chạm vào vị trí có vi khuẩn trải Không đốt bỏ vi khuẩn Tiếp tục trải vi khuẩn theo chiều từ D sang E Lưu ý: đường cấy phải rời khoảng 3-4 mm theo chiều Tại vị trí D, đầu dây cấy phải chạm vào vị trí có vi khuẩn trải Error! No text of specified style in document XVI I Trải vi khuẩn theo đường zig-zag từ E phần trống đĩa thạch Lưu ý: không để dây cấy chạm vào đường trải trước Đốt tiệt trùng dây cấy để hồn tất Đường đầu dây cấy trải thay đổi theo kỹ thuật mô tả hình sau Đường đầu dây cấy số kỹ thuật phân lập Những điều cần lưu ý cấy: Thao tác nhanh gọn, chậm làm tăng nguy nhiễm Phải tiệt trùng kỹ dây cấy Error! No text of specified style in document XVI II Đốt miệng ống nghiệm sau mở nút đóng nút Trường hợp khơng dùng tủ cấy, dây cấy miệng ống nghiệm phải để vùng an tồn lửa (cách lửa khơng 2cm) không để ống nghiệm lửa cấy Đốt bỏ phần vi khuẩn thừa dây cấy trước đặt dây cấy xuống KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG Phương pháp nhiệt ẩm Sử dụng nước nhiệt độ 121oC (áp suất dư atm) để tiệt trùng Để tạo nước nhiệt độ phải sử dụng nồi hấp (autoclave) Tác dụng diệt khuẩn phương pháp nhiệt độ áp suất Thời gian tiệt trùng thơng thường 15 phút Tùy theo thể tích môi trường tùy theo mức độ ô nhiễm (mật độ vi khuẩn có mơi trường trước hấp) mà thời gian hấp tăng giảm Dung tích mơi trường Thời gian hấp 121oC Dưới 100 ml 15 phút Từ 500ml đến 1000 ml 20 phút Từ 1000 ml đến 2000 ml 25 phút Từ 2000 ml Trên 35 phút Phạm vi áp dụng: Dụng cụ, băng, áo quần, môi trường, hóa chất chịu nhiệt độ Hạn chế: Các đồ vật không chịu nhiệt nhựa dẻo, túi nilon,…sẽ bị biến dạng; thành phần môi trường không chịu nhiệt độ vitamin, protein,…sẽ bị biến tính Error! No text of specified style in document XIX Phương pháp nhiệt khơ Dùng khơng khí nóng 165 - 200 oC để sấy dụng cụ thủy tinh, hóa chất chịu nhiệt (dầu béo,…) khoảng Hạn chế: dùng để tiệt trùng dụng cụ đa số mơi trường nuôi cấy không chịu nhiệt độ Phương pháp Tyndall Tiệt trùng ngày liên tiếp, ngày nhiệt độ 70oC Sau lần gia nhiệt, để mơi trường nguội nhiệt độ phòng Nhiệt độ 70oC diệt dạng tế bào dạng phát triển (dạng dinh dưỡng), không diệt bào tử Khi để nhiệt độ thường, bào tử phát triển thành dạng dinh dưỡng bị tiêu diệt lần gia nhiệt Phương pháp dùng để tiệt trùng môi trường không chịu nhiệt độ cao Dụng cụ chứa môi trường thường tiệt trùng trước phương pháp nhiệt ẩm nhiệt khô Phương pháp lọc tiệt trùng Các thành phần nhạy cảm với nhiệt độ thường tiệt trùng riêng phương pháp lọc sau bổ sung vào mơi trường Trong phòng thí nghiệm, thường dùng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 m tiệt trùng sẵn, dùng lần Dịch cần lọc bơm qua màng lọc xylanh vào bình chứa vơ trùng Q trình phối trộn dịch sau lọc vào môi trường nuôi cấy phải thực điều kiện vô trùng THỰC HÀNH Mỗi sinh viên tiến hành: Quan sát tiêu vi khuẩn mẫu kính hiển vi quang học (dùng vật kính 10X, 40X, 100X) Error! No text of specified style in document Cấy vi khuẩn môi trường Phân lập vi khuẩn Chuẩn bị dụng cụ, mơi trường cho nhóm thực tập sau Báo cáo: theo mẫu quy định XX Error! No text of specified style in document XXI ... sát vi khuẩn gây bệnh cổ họng Bài 6: Các thử nghiệm kháng sinh Bài 7: Định lượng mật độ vi sinh vật KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ Môn học thực hành vi sinh vật học yêu cầu sinh vi n học môn lý thuyết Vi sinh. .. THUẬT CƠ BẢN TRONG THỰC HÀNH VI SINH Sau học xong này, sinh vi n có thể: - Biết sử dụng kính hiển vi cho mục đích khác - Biết cách chuẩn bị dụng cụ để thực hành vi sinh Tiến hành kỹ thuật cấy... điểm sinh lý sinh hóa Trong nghiên cứu thực hành sinh sinh vật, người ta tiến hành vi sinh vật chủng b Phân lập vi khuẩn Phân lập vi khuẩn kỹ thuật sử dụng để thu giống chủng từ hỗn hợp vi khuẩn