BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM L.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM L.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Tài TS Đỗ Quyên Nơi thực : Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu Bộ môn Dược liệu - trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi LỜI CẢM ƠN Khóa luận kết trình học tập trường Đại học Dược Hà Nội trình nghiên cứu em Viện Dược liệu Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu thầy cô môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trình học tập, nghiên cứu để hồn thành khóa luận Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tri ân đến Tiến sỹ Nguyễn Văn Tài Tiến sỹ Đỗ Quyên, dù bận nhiều công việc tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em q trình nghiên cứu đề tài hồn chỉnh khóa luận Mặc dù thân cố gắng lần nghiên cứu khoa học chắn khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp quý giá thầy cô Hà Nội, tháng năm 2013 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hiếu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L 1.2 Thành phần hóa học Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 1.3 Tổng quan acid ursolic CHƯƠNG : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 CHƯƠNG : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15 3.1 Định tính nhóm chất hữu phản ứng hóa học 15 3.2 Định tính acid ursolic cành Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) SKLM 22 3.3 Phân lập acid ursolic từ cành Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) sắc ký cột 23 3.4 Xây dựng quy trình chiết tách acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 29 BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 43 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTCT công thức cấu tạo DCM dichloromethan dd dung dịch EtOAc ethyl acetat EtOH ethanol IR Phổ hồng ngoại kl khối lượng MeOH methanol NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân MS Phổ khối Rf hệ số lưu SKLM sắc ký lớp mỏng tt thể tích TT thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 : Hàm lượng acid ursolic loài thuộc chi Ocimum L Bảng 3.1 : Kết định tính nhóm chất hữu cành, Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) phản ứng hóa học 21 Bảng 3.2 : Phổ 1H, 13C-NMR D1 acid ursolic 27 Bảng 3.3 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) chiết dung môi khác 32 Bảng 3.4 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) chiết nhiệt độ khác 34 Bảng 3.5 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) chiết với tỷ lệ dung môi/dược liệu khác 34 Bảng 3.6 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) với số lần chiết khác 35 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 : CTCT acid ursolic Hình 1.2 : CTCT acid corosolic Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic Hình 1.4 : Sơ đồ chiết xuất tinh chế acid ursolic từ Hồng (Diospyros kaki) 10 Hình 1.5 : Sơ đồ chiết xuất tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica) 11 Hình 3.1 : Sắc ký đồ cắn MeOH toàn phần với acid ursolic đối chứng hệ dung môi khai triển 22 Hình 3.2 : Tóm tắt quy trình chiết xuất phân đoạn từ cành, Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 24 Hình 3.3 : Sắc ký đồ cắn phân đoạn với acid ursolic đối chứng 25 Hình 3.4 : Sắc ký đồ acid ursolic thô sau kết tinh với chất đối chứng 31 Hình 3.5 : Sắc ký đồ acid ursolic thô mẻ chiết dung môi khác 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Hương nhu tía từ lâu sử dụng rộng rãi y học cổ truyền làm thuốc điều trị cảm nắng, cảm hàn, sốt nóng sợ rét, nhức đầu, đau bụng Dược điển Việt Nam IV có chuyên luận Hương nhu, xem hai loài Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L.) Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) sử dụng điều trị Thực tế, Hương nhu trắng nguồn nguyên liệu chiết xuất tinh dầu Hương nhu điều chế eugenol, Hương nhu tía chủ yếu dùng Y học cổ truyền Trên giới, Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) dùng nguồn nguyên liệu giàu acid ursolic, có chứa hàm lượng acid ursolic cao [19, 22] Acid ursolic saponin thuộc nhóm ursan chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng ý chống viêm, bảo vệ gan, hạ lipid máu, chống khối u [10, 15] Đặc biệt acid ursolic chất trung gian quan trọng để bán tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học cao acid corosolic (một chất ức chế glycogen phosphorylase nghiên cứu nhiều điều trị đái tháo đường) [20, 24] Xuất phát từ thực tế Hương nhu tía Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều thành phần acid ursolic, thực đề tài : "Nghiên cứu thành phần hóa học Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)" với nội dung sau : - Định tính nhóm chất hữu cành, Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) - Chiết xuất, phân lập acid ursolic từ cành Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) - Xây dựng quy trình chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) - Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng acid ursolic chiết từ dược liệu Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L 1.1.1 Vị trí phân loại chi Ocimum L Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987, chi Ocimum L thuộc : • Giới thực vật (Plantae) • Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) • Lớp Ngọc lan (Magnoliidae) • Phân lớp Bạc hà (Lamidae) • Bộ Bạc hà (Lamiales) • Họ Bạc hà (Lamiaceae) • Chi Ocimum L [4] 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Ocimum L Chi Ocimum L thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae), tên gọi bắt nguồn từ ozo, ozein nghĩa toát mùi thơm, liên quan đến mùi thơm phảng phất thuộc chi này; chữ okimon, okys nghĩa nhanh, cấp tốc mọc nhanh Tên khác chi : Hương nhu, Húng, É Cỏ hay bụi nhỏ, sống năm hay sống nhiều năm Thân thường vuông, nhẵn hay có lơng Lá mọc đối, mép ngun hay xẻ cưa, có lơng hay nhẵn, thường có điểm tuyến tròn phiến Cụm hoa dạng chùy hay hình tháp, gồm xim bó tạo thành vòng giả, vòng thường có hoa Lá bắc tồn hay sớm rụng Đài hình chng, thường có lơng điểm tuyến phía ngồi, mơi; mơi có thùy lớn nhiều men xuống ống; mơi thùy, với thùy bên nhọn ngắn, thùy nhọn, dài Tràng có ống thò khỏi đài, nhẵn hay có lơng, mơi : mơi thùy ngắn; môi thùy dài lớn mơi trên, cong lõm hình thuyền Nhị 4, hướng xuống mơi dưới, nhị nhiều thò khỏi ống tràng, bao phấn hình trứng hay hình thận, ô Bầu nhẵn, vòi nhụy xẻ thùy đỉnh Đĩa mật 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau q trình thực khóa luận, chúng tơi thu số kết : - Xác định cành Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) có nhóm chất : saponin triterpenoid, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, phytosterol, tinh dầu phương pháp không thấy có mặt alcaloid, tanin, anthranoid, acid amin, đường khử, chất béo carotenoid - Xác định có mặt acid ursolic Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) SKLM khai triển với hệ dung mơi : • CHCl3 : MeOH = 9:1 (tt/tt) • ether dầu hỏa : EtOAc = : (tt/tt) màu thuốc thử màu : H2SO4 10%/EtOH, hơ nóng bếp điện - Đã phân lập acid ursolic sắc ký cột từ phân đoạn DCM - Đã nhận dạng chất phân lập acid ursolic phương pháp phổ, kết hợp với liệu phổ acid ursolic công bố - Đã khảo sát số yếu tố rút điều kiện chiết xuất cho hiệu suất chiết acid ursolic thô cao với 50 g dược liệu sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/EtOAc tỷ lệ 1:1; tỷ lệ dung môi/dược liệu lần chiết 8/6/6 Các lần chiết tiến hành nhiệt độ 65 0C bếp cách thủy thời gian Với điều kiện chiết thu lượng acid ursolic thô 0,32% khối lượng dược liệu khơ Đề xuất - Nâng cấp quy trình lên quy mô lớn - Xây dựng phương pháp định lượng acid ursolic Hương nhu tía sản phẩm thô Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ môn Dược liệu (2004), Bài giảng dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, tập I Bộ môn Dược liệu (2006), Thực tập dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, phần hóa học Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học Bộ Y tế (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr 321 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 1808 - 1810 Nguyễn Thị Ngọc Lan (2012), Nghiên cứu phân lập số hoạt chất làm chất đối chiếu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa kiểm tra chất lượng dược liệu, Viện Dược liệu, tr.3-12 Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 1027 - 1029 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Baricevic D., Sosa S., Della Loggia R., Tubaro A., Simonovska B., Krasna A., Zupancic A (2001), "Topical anti-inflammatory activity of Salvia officinalis L leaves: the relevance of ursolic acid", J Ethnopharmacol, 75(23), pp 125-32 Frighetto Rosa T S., Welendorf Rodolfo M., Nigro Eduardo N., Frighetto Nélson, Siani Antonio C (2008), "Isolation of ursolic acid from apple peels by high speed counter-current chromatography", Food Chemistry, 106(2), pp 767-771 10 Gautam R., Jachak S M (2009), "Recent developments in anti-inflammatory natural products", Med Res Rev, 29(5), pp 767-820 41 11 Hirota M., Mori, T., Yoshio, M and Iriye, R (1990), "Suppression of tumor promoter-induced inflammation of mouse ear by ursolic acid and 4,4dimethylcholestane derivatives.", Agricutural and Biological Chemistry, 54, pp 1073-1075 12 Huang M T., Ho C T., Wang Z Y., Ferraro T., Lou Y R., Stauber K., Ma W., Georgiadis C., Laskin J D., Conney A H (1994), "Inhibition of skin tumorigenesis by rosemary and its constituents carnosol and ursolic acid", Cancer Res, 54(3), pp 701-8 13 Jachak S M (2006), "Cyclooxygenase inhibitory natural products: current status", Curr Med Chem, 13(6), pp 659-78 14 Kosuge T., Yokota M., Sugiyama K., Mure T., Yamazawa H., Yamamoto T (1985), "Studies on bioactive substances in crude drugs used for arthritic diseases in traditional Chinese medicine III Isolation and identification of anti-inflammatory and analgesic principles from the whole herb of Pyrola rotundifolia L", Chem Pharm Bull (Tokyo), 33(12), pp 5355-7 15 Liu J (1995), "Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid", J Ethnopharmacol, 49(2), pp 57-68 16 Liu J., Liu Y., Mao Q., Klaassen C D (1994), "The effects of 10 triterpenoid compounds on experimental liver injury in mice", Fundam Appl Toxicol, 22(1), pp 34-40 17 Liu Y., Tian W., Ma X., Ding W (2010), "Evaluation of inhibition of fatty acid synthase by ursolic acid: positive cooperation mechanism", Biochem Biophys Res Commun, 392(3), pp 386-90 18 Shukla B., Viser, S., Patnaik, G.K., Tripathi, S.C., Srimal,, R.C Day, S and Dobhal, P.C (1992), "Hepatoprotective activity in the rat of ursolic acid isolated from Eucalyptus hybrid", Phytotherapy Research, 6, pp 19 Silva M G., Vieira I G., Mendes F N., Albuquerque I L., dos Santos R N., Silva F O., Morais S M (2008), "Variation of ursolic acid content in eight Ocimum species from northeastern Brazil", Molecules, 13(10), pp 2482-7 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 42 20 Stohs S J., Miller H., Kaats G R (2012), "A review of the efficacy and safety of banaba (Lagerstroemia speciosa L.) and corosolic acid", Phytother Res, 26(3), pp 317-24 21 Vasilenko Iu K., Lisevitskaia L I., Frolova L M., Parfent'eva E P., Skul'te I V (1982), "Hypolipidemic properties of triterpenoids", Farmakol Toksikol, 45(5), pp 66-70 22 Vetal Mangesh D., Lade Vikesh G., Rathod Virendra K (2013), "Extraction of ursolic acid from Ocimum sanctum by ultrasound: Process intensification and kinetic studies", Chemical Engineering and Processing: Process Intensification 23 Wen X., Sun H., Liu J., Cheng K., Zhang P., Zhang L., Hao J., Zhang L., Ni P., Zographos S E., Leonidas D D., Alexacou K M., Gimisis T., Hayes J M., Oikonomakos N G (2008), "Naturally occurring pentacyclic triterpenes as inhibitors of glycogen phosphorylase: synthesis, structure-activity relationships, and X-ray crystallographic studies", J Med Chem, 51(12), pp 3540-54 24 Wen X., Xia J., Cheng K., Zhang L., Zhang P., Liu J., Zhang L., Ni P., Sun H (2007), "Pentacyclic triterpenes Part 5: synthesis and SAR study of corosolic acid derivatives as inhibitors of glycogen phosphorylases", Bioorg Med Chem Lett, 17(21), pp 5777-82 25 Young H S., Chung H Y., Lee C K., Park K Y., Yokozawa T., Oura H (1994), "Ursolic acid inhibits aflatoxin B1-induced mutagenicity in a Salmonella assay system", Biol Pharm Bull, 17(7), pp 990-2 TRANG WEB 26 http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=64945#x291 43 PHỤ LỤC PHỤ LỤC : GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 44 PHỤ LỤC : PHỔ HỒNG NGOẠI (IR) CỦA D1 45 PHỤ LỤC : PHỔ KHỐI (ESI-MS) CỦA D1 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 46 PHỤ LỤC : PHỔ 13C-NMR CỦA D1 47 PHỤ LỤC : PHỔ 13C-NMR CỦA D1 (TIẾP) Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 48 PHỤ LỤC : PHỔ 13C-NMR CỦA D1 (TIẾP) 49 PHỤ LỤC : PHỔ 1H-NMR CỦA D1 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 50 PHỤ LỤC : PHỔ 1H-NMR CỦA D1 (TIẾP) 51 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 52 PHỤ LỤC : PHỔ 1H-NMR CỦA D1 (TIẾP) 53 ... β-caryophylen [7] Thành phần hóa học khác : - Hương nhu tía chứa hợp chất thuộc nhóm flavonoid apigenin, luteolin, apigenin-7-glucuronid, luteolin-7-glucuronid, orientin nhóm polyphenol : acid galic,... ursolic l n acid oleanolic indomethacin, cụ thể giá trị ID50 acid ursolic, acid oleanolic indomethacin 0,14/0,36/0,26 μmol/cm2, điều cho thấy acid ursolic có tác dụng chống viêm mạnh gần l n... nghiệm in vitro sinh tổng hợp prostaglandin (có xúc tác COX-2) Acid ursolic thể tác dụng chống viêm đáng kể COX-2 với tỷ l chọn l c COX2/COX-1 0,6 [13] Trong thử nghiệm in vivo, tác dụng chống