CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Lĩnh Toàn PGS.TS Hồ Anh Sơn Phản biện 1: PGS TS Vũ Văn Khiên Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Văn Ba Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Thanh Thúy Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Học viện Quân y Vào hồi: ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y năm 2019 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên tăng bất thường tế bào có khả xâm lấn hay lan rộng vào phận khác thể Là trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu từ tích lũy tăng dần đột biến gen, đột biến gen bất thường đường tín hiệu nội bào Wnt Số bệnh nhân bị CRC số ca tử vong CRC tăng theo thời gian Liệu pháp sử dụng virus ly giải tế bào u để điều trị ung thư phương thức biến chép virus thành vũ khí tiêu diệt tế bào ung thư không ảnh hưởng đến tế bào lành Các chủng virus vaccin sởi (MeV) quai bị (MuV) chứng minh có hiệu điều trị ung thư người Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu kháng ung thư đại tràng người phối hợp MeV MuV Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người virus vaccine sởi quai bị thực nghiệm” với mục tiêu sau: Mục tiêu: Đánh giá khả gây độc tế bào chết tế bào theo chương trình phối hợp virus vaccine sởi quai bị dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro Đánh giá hiệu kháng u phối hợp virus vaccine sởi quai bị mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 Tính cấp thiết: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người phối hợp virus vaccine sởi (MeV) quai bị (MuV) in vitro mơ hình cấy ghép chuột thiếu hụt miễn dịch, làm tiền đề cho nghiên cứu đánh giá tính an toàn, chế tác dụng phối hợp MeV MuV kháng ung thư, tiến tới thử nghiệm lâm sàng giai đoạn khác sử dụng phối hợp virus vaccine điều trị bệnh nhân ung thư Đóng góp luận án: Hồn thiện quy trình ni cấy tế bào ung thư đại tràng người HT29 in vitro ghép u đùi chuột nude Đánh giá tác dụng kháng ung thư đại tràng người dòng tế bào HT29 phối hợp MeV MuV in vitro mô hình cấy ghép chuột thiếu hụt miễn dịch Từ làm sở cho nghiên cứu tiến tới thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư Bố cục luận án: Luận án có 140 trang, bao gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1: Tổng quan (36 trang), Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (28 trang), Chương 3: Kết (32 trang), Chương 4: Bàn luận (37 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang) Luận án có 142 tài liệu tham khảo (tiếng Anh: 142) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ung thư đại trực tràng 1.1 Tình hình ung thư đại trực tràng Trên giới, loại ung thư phổ biến thứ ba nam giới phổ biến thứ hai nữ giới, nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong liên quan đến ung thư Trong năm 2017, ước tính có khoảng 95.520 trường hợp ung thư đại tràng 39.910 trường hợp ung thư trực tràng chẩn đoán Mỹ Tỉ lệ mắc CRC đa dạng tuổi, chủng tộc, sắc tộc kiểu mắc CRC có xu hướng trẻ hóa người mắc (dưới 50 tuổi) 1.2 Nguyên nhân ung thư đại trực tràng 1.2.1 Đột biến gen di truyền Bệnh đa polyp tuyến hội chứng Gardner: đột biến di chuyền gen coli gây polyp tuyến (APC), gen ức chế khối u Hội chứng Lynch: biến đổi gen hỗ trợ sửa chữa DNA, làm cho DNA bắt cặp sai, dẫn đến phát triển ung thư Hội chứng Peutz-Jeghers: biến đổi di truyền gen ức chế khối u, 1.2.2 Các đột biến gen mắc phải Đột biến gen xảy thời gian sống không truyền qua hệ, chúng có tế bào sinh từ tế bào gốc bị đột biến CRC đột biến gen mắc phải gây nhiều so với đột biến gen di truyền 1.3 Cơ chế bệnh sinh ung thư đại trực tràng 1.3.1 Gen, vi môi trường di truyền ngoại gen (epigenetic) Đột biến gen gây CRC: Bộ gen CRC có khoảng 13.000 gen đột biến, có khoảng 69 đột biến gen điều khiển đề xuất đột biến có vai trò hình thành CRC Các đột biến gen APC kéo theo đột biến xảy gen KRAS TP53, hoạt hóa đường tín hiệu Wnt làm khởi phát polyp tiến triển thành CRC Đột biến gen đường tín hiệu yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (TGFβ), gen thụ cảm thể TGFβ loại II, gen SMAD2, SMAD4, RUNX3 TSP1 Ít gặp đột biến gen MSH2, MSH6, MLH1 PMS2 có vai trò hình thành CRC microRNA phân tử điều hòa di truyền ngoại gen CRC: có số microRNA tăng lên tế bào CRC so với tế bào đại trực tràng bình thường như: miRNA-31, miRNA-183, miRNA-17-5, miRNA-18a, miRNA-20a miRNA-92, miRNA-143 miRNA-145 lại thấp đáng so với tế bào bình thường Các microRNA ức chế khối u microRNA gây ung thư: miRNA135a miRNA-135b ảnh hưởng trực tiếp gen ức chế khối u APC kích hoạt tín hiệu đường Wnt tạo CRC miRNA-122a chất ức chế khối u làm tăng biểu gen APC miRNA-21 tăng tế bào giai đoạn sớm CRC, miRNA-21 chất gây ung thư miRNA-143 miRNA-145 chất ức chế khối u 1.3.2 Tăng methyl hóa DNA ung thư đại trực tràng Methyl hóa DNA phản ứng cộng thêm nhóm methyl vào vị trí 5' cytosine xúc tác enzyme DNA methyltransferase để tạo thành 5-methyl cytosine Tăng methyl hóa làm bất hoạt gen, giảm trình tế bào chết theo chương trình, sửa chữa DNA kiểm sốt chu trình tế bào 1.3.3 Giảm methyl hóa DNA tế bào CRC Giảm methyl hóa DNA làm ổn định hệ gen, điển hình yếu tố nhân kích thước dài rải rác (LINE-1) hình thành CRC 1.3.4 Thay đổi Histone tế bào CRC Thể nhân đơn vị nhiễm sắc thể, bao gồm octamer tạo bốn histone lõi (H3, H4, H2A, H2B) xung quanh có 147 cặp base DNA phủ bên ngồi, lõi histone chủ yếu hình cầu ngoại trừ “các đi” N- tận Có loại thay đổi histone: acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa, ubiquityl hóa, sumoyl hóa, hóa ADP-ribose hóa, proline isomerise hóa citrulline hóa Trong đó, acetyl hóa methyl hóa loại phổ biến gây CRC 1.4 Liệu pháp MeV MuV điều trị CRC 1.4.1 Sinh học MeV MuV MeV MuV virus thuộc thành viên họ Paramyxoviridae, có đường kính khoảng 100-300nm, với lõi nucleocapsid xoắn chứa sợi RNA đơn (-) Hai protein màng: protein fusion (F) có vai trò hợp màng virus với màng tế bào đích huyết tán; protein hemagglutinin (H) hay hemagglutinin neuraminidase (HN) chịu trách nhiệm việc virus xâm nhập vào tế bào 1.4.2 MeV MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng 1.4.2.1 Tế bào CRC có thụ cảm thể đặc hiệu với MeV MuV MuV chủng Urabe sử dụng sialoglycoprotein có chứa acid sialic bề mặt tế bào ung thư thụ cảm thể đặc hiệu MeV chủng Edmonston sử dụng thụ cảm thể đặc hiệu CD46, Nectin-4 bề mặt tế bào CRC 1.4.2.2 MeV, MuV ly giải tế bào CRC nhờ enzyme protease Các protease có nhiều tế bào ung thư phân cắt glycoprotein virus, tạo điều kiện để virus xâm nhập vào tế bào, đại diện matrix metalloproteinase 1.4.2.3 MeV, MuV tận dụng khiếm khuyết gen tế bào CRC Các khiếm khuyết di truyền tế bào ung thư làm cho tế bào ung thư dễ bị nhiễm virus tạo điều kiện cho virus nhân lên tốt mà khơng có tế bào bình thường 1.4.3 Cơ chế MeV, MuV ly giải tế bào ung thư đại trực tràng 1.4.3.1 MeV MuV ly giải trực tiếp tế bào CRC qua hình thành hợp bào MeV MuV ly giải tế bào ung thư cách hòa màng tế bào nhiễm virus tế bào bình thường lân cận tạo thành hợp bào (tế bào khổng lồ có nhiều nhân) Một tế bào nhiễm virus hợp 50100 tế bào lân cận tạo thành hợp bào 1.4.3.2 MeV, MuV ly giải tế bào CRC qua trung gian miễn dịch đặc hiệu MeV, MuV tạo loại tín hiệu nguy hiểm tín hiệu nguy hiểm nội sinh (DAMP), tín hiệu nguy hiểm ngoại sinh (PAMP), chúng kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu góp phần quan trọng ly giải tế bào u như: sản xuất IFN, cytokine, hoạt hóa tế bào NK, đại thực bào, tế bào DC, tế bào lympho T Protein Hemagglutinin neuraminidase có vai trò sialidase, loại bỏ axit sialic khỏi bề mặt tế bào ung thư, bộc lộ kháng nguyên ung thư, kích hoạt miễn dịch đặc hiệu tiêu diệt tế bào ung thư 1.5 Các nghiên cứu lâm sàng MeV MuV Bảng 1.1 Các thử nghiệm lâm sàng MeV MuV Chủng virus Cách điều trị Liều, thời gian điều trị Bệnh N.C lâm sàng, bệnh nhân (n) Kết lâm sàng Năm 1/5 bệnh nhân thối triển hồn tồn u tiêm, 3/5 bệnh nhân thoái triển phần u tiêm, 2/3 bệnh nhân có thối triển phần u xa 2005 Virus sởi (MeV) MeVEZ Tiêm nội u 102–103 TCID50 MeVCEA Tiêm màng bụng 103–103 TCID50 (4 tuần/lần, tháng) MeVCEA Tiêm nội u U lympho T da Giai đoạn (n = 5) 14/21 bệnh nhân có đáp ứng: thời gian Ung thư Giai đoạn sống trung bình năm; bệnh nhân buồng trứng (n = 21) có thời gian sống 3,2 năm U nguyên bào Giai đoạn đệm đa dạng Tiến triển 2010 MeVNIS Truyền tĩnh mạch Đa u tủy 108–109 TCID50 (4tuần/lần, tháng) Giai đoạn (n=2) MeVNIS Tiêm màng bụng MeVNIS Tiêm màng bụng MeVNIS Tiêm nội u MeVNIS Tiêm nội u U thần kinh Giai đoạn ngoại biên (n=30) MeVNIS MeVCEA Tiêm nội u MeVNIS Tiêm nội u U nguyên bào Giai đoạn đa dạng (n=16) U biểu mô Giai đoạn buồng trứng, (n=37) màng bụng U biểu mô Giai đoạn buồng trứng (n=54) Ung thư Giai đoạn buồng trứng (n=16) Quan sát thấy MV-NIS nhân lên chọn lọc khối u, thối triển hồn tồn u ác di 1/2 số bệnh nhân Thời gian sống trung bình bệnh nhân 26,5 tháng U trung biểu Giai đoạn mô màng phổi Ung thư biểu Giai đoạn mô tế bào vảy (n=12) đầu cổ, vú Tiêm nội u 2014 2015 Đang thực 20122018 Đang thực 20132018 Đang thực 20172021 Đang thực 20152019 Đang thực 20122018 Đang thực 20142021 Giai đoạn (n = 90) 79/90 bệnh nhân đáp ứng với điều trị 37/79 bệnh nhân có thối biến khối u đáng kể hay hoàn toàn 1974 Virus quai bị (MuV) Chủng Urabe Tiêm nội u, tĩnh mạch, khí dung Chủng Urabe Chủng Urabe giảm độc lực Tiên da, màng bụng, nội ngực u 105–107 TCID50 Ung thư tiến triển 108–109 PFU Ung thư tiến triển Giai đoạn (n=200) 26/200 bệnh nhân có thối biến khối u; đa số bệnh nhân có triệu chứng khách quan nhẹ 1978 108–109 PFU Ung thư phụ khoa Giai đoạn (n = 22) 5/7 bệnh nhân hoàn toàn cổ trướng tràn dịch màng phổi; bệnh nhân có khối u lớn khơng đáp ứng Bệnh nhân tràn dịch màng bụng màng phổi có đáp ứng 1988 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Động vật chất liệu nghiên cứu Chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c Virus vaccine sởi chủng Edmonton quai bị chủng Urabe Dòng tế bào Vero ung thư đại tràng người HT-29 Mơi trường ni cấy DMEM có thêm 10% FBS (Foetal Bovine Serum) 1% kháng sinh (penicillin streptomycin), hóa chất khác… Bộ kit MTT đánh giá tỉ lệ tế bào sống; kit FITC Annexin V Apoptosis Detection kit (BD) đáng giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis; kháng thể gắn chất phát huỳnh quang phát tế bào miễn dịch lách chuột 2.1.2 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu Thước kẹp đo u, máy camera, máy đo quang (OD), kính hiển vi quang học, tủ ấm 370 C 5% CO2, máy ly tâm, hệ thống flow cytometry, kính hiển vi điện tử truyền qua dụng cụ tiêu hao phòng thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp ni cấy tăng sinh dòng tế bào Tế bào HT-29 Vero lấy từ nguồnbảo quản âm sâu (-800C), rã đông thật nhanh (50%) – (%CPE nồng độ có %CPE