BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes VÀO CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : VŨ THỊ NGUYỆT Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 7/ 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes VÀO CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN VŨ PHONG VŨ THỊ NGUYỆT Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Cuộc sống mang cho nhiều ưu đãi, có điều tình yêu thương mà người giành cho Thưa bố mẹ kính yêu, xin cảm ơn bố mẹ sinh thành dưỡng dục đến ngày hôm nay, bên con, động viên an ủi để vững vàng bước Em cảm ơn thầy Lê Đình Đơn, Trưởng mơn Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho chúng em học tập suốt năm học tháng làm khóa luận tốt nghiệp mơn Em cảm ơn thầy hướng dẫn, thạc sĩ Nguyễn Vũ Phong, suốt thời gian thực khóa luận thầy tận tình hướng dẫn, bảo, động viên giúp em làm tốt đề tài Em cảm ơn thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, thầy cô trường dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho chúng em suốt bốn năm đại học Các anh chị Bộ môn, Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh – Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường Trường đại học Nơng Lâm TP.HCM nhiệt tình bảo em Cảm ơn bạn lớp DH06SH, đặc biệc bạn nhóm ni cấy mơ bên cạnh giúp đỡ Cầu chúc điều tốt đẹp đến với bố mẹ, thầy cô bạn, chúc người hạnh phúc Xin chân thành cảm ơn! i Vũ Thị Nguyệt TĨM TẮT Cà độc dược có khả sản xuất alkaloid tropane phận rễ, hai alkaloid chủ yếu rễ scopolamine hyoscyamine, nhiên với số lượng không đáng kể Một đường để tăng cường sản xuất hợp chất alkaloid sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes gây biến đổi di truyền, kích thích rễ tóc phát triển làm tăng sinh khối rễ Ở Việt Nam đến chưa có kết nghiên cứu chuyển gen khảo sát hàm lượng alkaloid cà độc dược Mặt khác, nhằm xây dựng quy trình chuyển gen vào thực vật vi khuẩn để ứng dụng vào loại có giá trị cao mặt kinh tế nên đề tài tiến hành để tìm phương pháp nồng độ vi khuẩn thích hợp nhằm đạt hiệu chuyển gen vi khuẩn A rhizogenes vào cà độc dược Sau 15 ngày đồng nuôi cấy mẫu với dung dịch vi khuẩn pha loãng nồng độ khác nhau, có số mẫu xuất rễ Sau 15 ngày ni đoạn thân rockwool có chứa môi trường MS lỏng, bổ sung 10 ml/l dịch vi khuẩn số lượng mẫu sống, rễ có nhiều rễ tóc Cần tiếp tục xác định có hay khơng diện gen rol, ntpII, h6h rễ tạo nhằm khẳng định tính hiệu phương pháp lây nhiễm thực ii SUMMARY Datura can produce medicinal secondary metabolites at root Transformed hairy roots cultures are one of the approaches to enhance alkaloid production This subject was carried out to find the suitable method to achieve efficient gene transfer of Agrobacterium rhizogenes highest After 15 days co - culture with different concentrations bacterial solution, some form roots appeared in the leaf discs Hairy roots were emerged at slanting cuts 15 days after infecting stem sections with bacterial solution 10 ml/l in rock wool plugs iii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chuyển gen 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 2.2 Giới thiệu cà độc dược 2.2.1 Vị trí phân loại 2.2.2 Đặc điểm sinh học 2.2.3 Hợp chất thứ cấp 2.3 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 2.3.1 Vị trí phân loại 2.3.2 Đặc điểm chung 2.3.3 Ri plasmid T-DNA vủa vi khuẩn 2.3.3 Gen rol kích thích tạo rễ 2.3.4 Quá trình chuyển T – DNA vào tế bào thực vật 10 2.4 Phương pháp xác định gen ngoại lai 12 2.5 Một số nghiên cứu chuyển gen vi khuẩn A rhizogenes 12 iv 2.5.1 Phương pháp đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn 13 2.5.2 Phương pháp tiêm vi khuẩn vào nốt mầm 14 2.5.3 Phương pháp nuôi đoạn chồi dịch vi khuẩn 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 16 3.2 Vật liệu 16 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 16 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 17 3.2.2.1 Nuôi cấy in vitro lây nhiễm mẫu cà độc dược với vi khuẩn 17 3.2.3 Môi trường nuôi cấy 17 3.2.3.1 Môi trường 17 3.2.3.2 Môi trường dùng để nuôi vi khuẩn 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 18 3.3.1.1 Chuẩn bị vật liệu 18 3.3.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn 19 3.3.1.3 Đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn 19 3.3.1.4 Loại bỏ vi khuẩn 20 3.3.2 Nuôi đoạn thân rock wool có chứa dịch vi khuẩn 20 3.3.2.1 Chuẩn bị vật liệu lây nhiễm 20 3.3.2.2 Chuẩn bị vi khuẩn 20 3.3.2.3 Lây nhiễm vi khuẩn vào đoạn thân 20 3.3.3 Tiêm vi khuẩn vào cà độc dược 20 3.3.3.1 Chuẩn bị vật liệu lây nhiễm 21 3.3.3.2 Chuẩn bị vi khuẩn 21 3.3.3.3 Tiêm vi khuẩn 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 22 4.2 Nuôi đoạn thân rock wool có chứa dịch vi khuẩn 24 v 4.3 Tiêm vi khuẩn vào cà độc dược 27 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 5.1 Kết luận 29 5.2 Đề nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ach : Acetycholin A rhizogenes : Agrobacterium rhizogenes A tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens Chv : Chromosomal virulence Ctv : Cộng tác viên DNA : Deoxyribonucleotic acid D arborea : Datura arborea D sanguinea : Datura sanguinea LB : Left border MS : Murashige & Skoog OD : Optical density (độ hấp thu quang phổ) ORF : Open reading frame PCR : Polymerase Chain Reaction RB : Right border Ri plasmid : Root inducing plasmid Rol : Resistance to osmotic lysis Ti plasmid : Tumor inducing plasmid TL-DNA : Transferred left DNA TR-DNA : Transferred right DNA TSS : Transport stimulation system T – DNA : Transfer - DNA Vir : Virulence YMB : Yeast Mannitol Broth vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu sống sau lây nhiễm mẫu với vi khuẩn 22 Bảng 4.2 Tỉ lệ mẫu rễ sau 17 ngày lây nhiễm 24 Bảng4.3 Kết thu nuôi đoạn thân rock wool 25 Bảng 4.4 Số liệu sau thu nhận xử lí 25 Bảng 4.5 Kết thí nghiệm tiêm trực tiếp vi khuẩn vào non 28 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hoa cà độc dược .4 Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium .6 Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Hình 2.4 Sự tương tác Agrobacterium chế chuyển T-DNA .11 Hình 2.7 Rễ tóc mọc ngẫu nhiên cà rốt 14 Hình 2.8 Tiêm vi khuẩn vào đậu 15 Hình 2.9 Ni đoạn thân rock wool 15 Hình 3.1 Plasmid pLAL21 16 Hình 4.1 Mẫu lây nhiễm vi khuẩn 23 Hình 4.2 Mẫu sau 15 ngày lây nhiễm 23 Hình 4.3 Đoạn thân dùng để nuôi rock wool 26 Hình 4.4 Rễ đoạn thân ni rock wool kính hiển vi 27 Hình 4.5 Rễ đoạn thân ni rock wool kính hiển vi 10X 27 viii Sắt EDTA Vitamin Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Myo-Inositol 100 Thiamin(B1) 0,1 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine Đường 30 g/l, agar g/l môi trường, pH = 5,8 ± 0,1 Hấp khử trùng 1210C, 1atm 25 phút Môi trường dùng để tiền nuôi cấy mẫu lây nhiễm không bổ sung đường Môi trường nuôi cấy mẫu sau lây nhiễm có bổ sung thêm kháng sinh cefotaxime hàm lượng g/l để diệt bớt lượng vi khuẩn dư 3.2.3.2 Mơi trường dùng để ni vi khuẩn Môi trường YMB (Yeast Mannitol Broth) với thành phần nồng độ sau: Thành phần Nồng độ (g/l) MgSO4 0,2 KH2SO4 0,5 NaCl 0,1 Yeast extract 0,4 Mannitol 10 Agar 15 pH Hấp khử trùng 1210C, 1atm, 25 phút, có bổ sung 100 mg/l rifampicin 25 mg/l kanamycin vào môi trường 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 3.3.1.1 Chuẩn bị vật liệu Cắt đoạn thân chứa chồi từ cà độc dược vườn, rửa lại thật vòi nước máy, ngâm dung dịch xà 1% 15 phút, rửa lại nước máy cho 18 dung dịch xà bơng, cho mẫu vào bình tam giác sạch, đậy lại chuyển vào tủ cấy vô trùng Mẫu rửa lại nước cất vơ trùng chuyển sang bình tam giác hấp khử trùng Tiến hành khử trùng mẫu cồn 700 phút, rửa lại mẫu nước cất vô trùng lần Sau khử trùng mẫu ba lần dung dịch javel (sodium hypochloride sodium hydroxide) tỉ lệ javel : nước 1:3, : 2, : 1, 10 phút, rửa lại với nước cất vô trùng ba lần Cuối chuyễn mẫu khử trùng sang bình tam giác vơ trùng Cắt hai đầu mẫu thân, mẫu chứa chồi cấy môi trường MS Mẫu sau cấy môi trường MS đặt phòng thí nghiệm, từ chồi hình thành lên cà độc dược in vitro Khoảng 30 ngày sau cắt mẫu cà độc dược in vitro cấy mơi trường MS có bổ sung mg/l BA 0,5 mg/l NAA để nhân nhanh cà độc dược in vitro tạo số lượng lớn làm vật liệu lây nhiễm Sau chồi chuyển sang môi trường MS 30 ngày, ta sử dụng để tiến hành lây nhiễm với vi khuẩn Mẫu cắt hai đầu cấy hai ngày môi trường MS trước lây nhiễm với vi khuẩn 3.3.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes dòng LBA9402 ni cấy mơi trường YMB rắn có bổ sung 100 mg/l rifampicin 25 mg/l kanamycin Chọn khuẩn lạc đặc trưng tròn, bóng, màu trắng tăng sinh mơi trường YMB lỏng có bổ sung hai kháng sinh có nồng độ trên, lắc 16 – 18 với 150 vòng/phút Li tâm 4000 vòng 10 phút, lấy phần lắng hòa tan lượng MS lỏng với thể tích dịch vi khuẩn trước li tâm Sau có dung dịch vi khuẩn đồng nhất, hút ml dịch khuẩn pha loãng với MS lỏng với nồng độ khác nhau: 10 lần, 20 lần, 30 lần 3.3.1.3 Đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn Mẫu sau nuôi cấy hai ngày, tiến hành lây nhiễm với vi khuẩn Ngâm mẫu vào dung dịch vi khuẩn pha loãng (10, 20, 30 lần) 20 phút Tiếp đến mẫu thấm khô giấy thấm vô trùng đặt vào đĩa petri có chứa 20 ml mơi trường MS không đường Các đĩa petri đặt tối 260C Đối chứng tiến hành tương tự ngâm dung dịch MS không chứa vi khuẩn Các nghiệm thức lặp lại lần 19 3.3.1.4 Loại bỏ vi khuẩn Sau đồng nuôi cấy với vi khuẩn hai ngày, mẫu rửa để loại bỏ vi khuẩn Mẫu rửa nước cất ba lần, tiếp đến rửa nước cất có bổ sung kháng sinh cefotaxime nồng độ g/l lần phút, cuối rửa lại nước cất vô trùng ba lần để loại bỏ kháng sinh Mẫu thấm khô giấy thấm vơ trùng cấy mơi trường MS có bổ sung g/l cefotaxime, đặt phòng tăng trưởng Tiến hành rửa lại mẫu bước thấy vi khuẩn phát triển nhiều xung quanh mẫu mơi trường 3.3.2 Ni đoạn thân rock wool có chứa dịch vi khuẩn 3.3.2.1 Chuẩn bị vật liệu lây nhiễm Cây cà độc dược in vitro chuẩn bị phương pháp trên, sau đoạn thân dài khoảng cm sử dụng để lây nhiễm vi khuẩn Rock wool cắt miếng tròn có bán kính khoảng cm đặt hộp nhựa tròn hấp khử trùng 3.3.2.2 Chuẩn bị vi khuẩn Vi khuẩn tăng sinh mơi trường YMB lỏng có bổ sung 100 mg/l rifampicine 25 mg/l kanamycin, lắc 16 – 18 với 150 vòng/phút 3.3.2.3 Lây nhiễm vi khuẩn vào đoạn thân Quá trình lây nhiễm thực mơi trường vơ trùng Cắt đoạn thân góc 450 để tăng diện tích tiếp xúc mẫu với vi khuẩn Đặt phần cắt đoạn thân dung dịch vi khuẩn pha lỗng với MS lỏng khơng đường với tỉ lệ 10 ml/l; 20 ml/l; 30 ml/l 20 phút Dùng đầu típ pipette tạo lỗ khoảng ¾ bề dày miếng rock wool hút 1ml dịch vi khuẩn pha loãng bơm vào lỗ Đặt đoạn thân vào lỗ bơm dịch vi khuẩn, phần dung dịch thừa bổ sung lên bề mặt rock wool cho ẩm miếng rock wool Để hộp phòng tăng trưởng nhiệt độ 260C chiếu sáng 16 giờ/ngày Đối chứng tiến hành tương tự với mơi trường MS lỗng khơng chứa vi khuẩn Thí nghiệm lặp lại ba lần với nghiệm thức 3.3.3 Tiêm vi khuẩn vào cà độc dược 20 3.3.3.1 Chuẩn bị vật liệu lây nhiễm Hạt cà độc dược khử trùng theo bước: Ngâm dung dịch xà 1% 15 phút, rửa lại thật vòi nước mạnh; cho hạt vào cồn 960 lắc nhẹ phút, rửa lại nước cất vô trùng ba lần; tiếp đến khử trùng hạt dung dịch javel:nước : 2, lắc nhẹ 20 phút Rửa lại hạt nước cất ba lần Ủ hạt hộp có chứa bơng gòn ẩm Sau hai tuần hạt nảy mầm dài khoảng 1cm sử dụng làm vật liệu xâm nhiễm 3.3.3.2 Chuẩn bị vi khuẩn Vi khuẩn tăng sinh mơi trường YMB lỏng có bổ sung 100 mg/l rifampicine 25 mg/l kanamycin, lắc 16 - 18h với 150 vòng/phút Sử dụng trực tiếp dung dịch vi khuẩn tăng sinh 3.3.3.3 Tiêm vi khuẩn Sau hạt nảy mầm đoạn thân dài cm, dùng kim tiêm hút dung dịch tiêm vào vị trí hai mầm Mẫu giữ phòng tăng trưởng 260C Đối chứng tiến hành tương tự dung dịch tiêm vào thân dung dịch YMB lỏng không chứa vi khuẩn Theo dõi ghi nhận kết 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Sau đồng nuôi cấy với vi khuẩn hai ngày, toàn mẫu sống, vi khuẩn phát triển mơi trường Bảng 4.1: Tỉ lệ mẫu sống sau lây nhiễm mẫu với vi khuẩn Mẫu Tỉ lệ mẫu sống sau lây nhiễm (%) 15 ngày 30 ngày Đối chứng 100 100 100 100 NT1.1 100 50 0 NT1.2 100 50 0 NT1.3 100 100 25 NT2.1 100 100 75 NT2.2 100 100 25 NT2.3 100 100 50 NT3.1 100 100 100 NT3.2 100 100 100 NT3.3 100 100 75 Đối chứng mẫu lây nhiễm với MS lỏng NT1.1, NT1.2, NT1.3 : dung dịch vi khuẩn pha loãng 10 lần, lặp lại lần 1, 2, NT2.1, NT2.2, NT2.3 : dung dịch vi khuẩn pha loãng 20 lần, lặp lại lần 1, 2, NT3.1, NT3.2, NT3.3 : dung dịch vi khuẩn pha loãng 30 lần, lặp lại lần 1, 2, Đối với mẫu lây nhiễm với dung dịch vi khuẩn nồng độ khác tỉ lệ mẫu sống khác Số lượng mẫu sống tăng dần nồng độ vi khuẩn giảm dần Các mẫu có tiếp xúc với dung dịch vi khuẩn bị dập hư xung quanh mép Khi đồng nuôi cấy vi khuẩn mẫu mơi trường MS khơng đường vi khuẩn phát triển ít, sau rửa với nước cất chứa cefotaxime chuyển sang mơi trường MS có đường + cefotaxime g/l, vi khuẩn phát triển hơn, từ số mẫu có khả rễ 22 a  b  Hình 4.1 Mẫu lây nhiễm vi khuẩn.(a) Trước lây nhiễm, (b) Mẫu ngày sau lây nhiễm nồng độ pha loãng 10 lần     a  b  c  d  Hình 4.2 Mẫu sau 15 ngày lây nhiễm (a) Đối chứng (b) Mẫu lây nhiễm với dung dịch vi khuẩn pha loãng 10 lần (c, d) Mẫu lây nhiễm với dung dịch vi khuẩn pha loãng 20 lần 23 Bảng 4.2 Tỉ lệ mẫu rễ sau 17 ngày lây nhiễm Nghiệm thức % mẫu rễ lần I lần II lần III 100 100 100 Pha loãng 10 lần 0 25 Pha loãng 20 lần 12,5 12,5 Pha loãng 30 lần 0 12,5 Đối chứng Đối chứng ban đầu xuất sẹo vị trí bị cắt, sau rễ bắt đầu hình thành sau ngày kéo dài bắt đầu phân nhánh Điều giải thích auxin nội sinh mẫu có tác động ngắn lên q trình tạo sẹo, sau lượng auxin cảm ứng tạo rễ kéo dài Điều phù hợp với ghi nhận vai trò auxin việc cảm ứng tạo sẹo tạo rễ sơ khởi nồng độ cao Ở nồng độ thấp auxin kích thích kéo dài rễ tạo thành (Profumo ctv, 1985; Teo ctv, 1997; Bùi Trang Việt, 2000) (Trích dẫn Nguyễn Thị Thanh Uyên, 2006) Khi lây nhiễm mẫu với dung dịch vi khuẩn pha loãng nồng độ khác có tạo rễ sau 15 ngày Tuy nhiên chưa thể phân biệt hình thái rễ tạo thành nghiệm thức nên chưa thể xác định ảnh hưởng vi khuẩn Sau 30 ngày, tất hóa vàng chết nên chưa có điều kiện kiểm tra rễ tạo thành Hiện tượng mẫu đối chứng nghiệm thức bị vàng sức sống sau 30 ngày chết, nguyên nhân nồng độ kháng sinh cao, theo nghiên cứu Nguyễn Thị Thu Hòa (2008) ảnh hưởng nồng độ cefotaxime đến sinh trưởng xác định nồng độ cefotaxime cao (>500mg/l) làm ảnh hưởng đến sinh trưởng bình thường Vì để hạn chế ảnh hưởng nồng độ kháng sinh lên mẫu, cần chuyển mẫu sang mơi trường chứa lượng cefotaxime 4.2 Ni đoạn thân rock wool có chứa dịch vi khuẩn 24 Bảng 4.3 Kết thu nuôi đoạn thân rock wool Mẫu Sau 15 ngày Đối chứng Kết kính hiển vi Hầu hết đoạn thân rễ Khơng xuất lơng hút xung quanh chóp rễ NT1.1 40% đoạn thân sống rễ Lông hút nhiều phần chóp rễ NT1.2 60% mẫu sống tạo rễ Lơng hút nhiều phần chóp rễ NT1.3 Mẫu bị hư thối, chết 100% Không NT2.1 20% mẫu sống rễ Không xuất lông hút phần chóp rễ, xuất rễ tơ phần thân rễ NT2.2 Mẫu chết 100% Không NT2.3 Mẫu chết 100% Không NT3.1 Mẫu chết 100% Không NT3.2 Mẫu chết 100% Không NT3.3 Mẫu chết 100% Không Đối chứng đoạn thân ni rock wool có chứa MS lỏng NT1.1, NT1.2, NT1.3 : MS lỏng + 10ml/l dung dịch vi khuẩn, lặp lại lần 1, 2, NT2.1, NT2.2, NT2.3 : MS lỏng + 20ml/l dung dịch vi khuẩn, lặp lại lần 1, 2, NT3.1, NT3.2, NT3.3 : MS lỏng + 30ml/l dung dịch vi khuẩn, lặp lại lần 1, 2, Bảng 4.4 Số liệu sau thu nhận xử lí từ thí nghiệm ni đoạn thân rock wool Nghiệm thức Dung dịch vi khuẩn (ml/l) % Số có rễ Hình thái rễ 100 + 10 33,33 +++ 20 30 6,67 ++ + Không xuất rễ tơ ++ rễ tơ xuất +++ rễ tơ xuất nhiều 25 Từ kết cho nhận thấy môi trường MS lỏng bổ sung 10ml/l vi khuẩn vào tỉ lệ mẫu sống cho rễ cao 33,33%; rễ xuất nhiều lông hút xung quanh Còn mơi trường có bổ sung nồng độ vi khuẩn cao số chết nhiều, mơi trường bổ sung 30 ml/l dung dịch vi khuẩn mẫu chết hết Như nồng độ vi khuẩn cao khơng thích hợp cho xâm nhiễm theo phương pháp Hình 4.3 Đoạn thân dùng để ni rock wool Quan sát thí nghiệm thấy số lượng chết nhiều vi khuẩn gây thối nhũn thân, số sống xuất rễ khoảng 15 ngày Số lượng rễ khoảng từ đến rễ, kích thước rễ từ 0,5 - cm Quan sát rễ kính hiển vi cho thấy khác biệt hoàn toàn rễ đối chứng rễ có ni chung với vi khuẩn Rễ đối chứng hồn tồn khơng xuất lơng hút, rễ đoạn thân ni mơi trường có vi khuẩn lại xuất nhiều lơng hút (Hình 4.4) Vi khuẩn A rhizogenes có khả xâm nhập vào tế bào thực vật chuyển T DNA vào thực vật Khi T - DNA vi khuẩn hợp với nhiễm sắc thể thực vật, biểu rõ mà ta quan sát trực tiếp xuất rễ tóc Để kiểm tra xác cần xác định diện gen rol phản ứng PCR 26 a b Hình 4.4 Rễ đoạn thân ni rock wool kính hiển vi (A) Đối chứng (4X) ; b) 10 ml/l dung dịch vi khuẩn (10X) a b Hình 4.5 Rễ đoạn thân ni rock wool kính hiển vi 10X (A) Đối chứng ; b) 10 ml/l dung dịch vi khuẩn) Phương pháp khó tách rock wool khỏi rễ, dễ nhầm lẫn với rễ mọc từ thân, nên cách tốt quan sát hình thái rễ kính hiển vi rễ phát triển có kích thước ngắn Trong giai đoạn ngâm đoạn thân với dịch vi khuẩn ngâm phần cắt chéo 450 chọn đoạn thân không non, không già để tăng sức sống cho mẫu 4.3 Tiêm vi khuẩn vào cà độc dược 27 Bảng 4.5 Kết thí nghiệm tiêm trực tiếp vi khuẩn vào non Nghiệm thức Đối chứng Kết thu Có rễ mọc vị trí tiêm 1/5 mẫu Hộp Tại vị trí tiêm thấy xuất lỗ phồng lên Hộp Các bị úa thối Hộp Một số úa thối, lại không thầy xuất rễ Hộp Cây úa thối Hộp Xung quanh vị trí tiêm phồng lên có lỗ đen Sau tuần tiêm dịch vi khuẩn vào thân non thấy vị trí tiêm phình ra, đối chứng có 1/5 xuất rễ kéo dài xuống bề mặt rock wool Khoảng 15 ngày sau tiêm dịch vi khuẩn bắt đầu có tượng bị thối, đen, sức sống vi khuẩn xâm nhập vào bắt đầu tác động trực tiếp lên cây, với nồng độ vi khuẩn cao nên sau thời gian hầu hết chết Khi sử dụng vi khuẩn để chuyển gen hiệu chuyển gen lồi khác nhau, dòng vi khuẩn khác Điều phụ thuộc vào khả thích nghi dòng vi khuẩn, nồng độ dung dịch vi khuẩn, cấu trúc DNA tế bào chủ, điều kiện bên ngồi Có lẽ chưa xác định nồng độ vi khuẩn thích hợp thích hợp nên hầu hết tiêm dịch vi khuẩn bị chết Do chưa có điều kiện li trích rễ để kiểm tra nên chúng tơi chưa đưa kết luận xác số rễ mọc từ mẫu có lây nhiễm vi khuẩn có xuất T-DNA hay chưa Qua phương pháp trên, nhận thấy rằng: Nên trì phương pháp lây nhiễm vi khuẩn với mẫu lá, rễ mọc từ nghiệm thức có số đặc điểm giống nhận định không hướng đất, nhiều lông tơ, phát triển không phụ thuộc vào mơi trường Phương pháp thành cơng ta thu lượng rễ lớn, tiết kiệm diện tích mơi trường ni cấy Trong q trình rửa mẫu nên thực nhanh nhẹ nhàng mẫu nhạy cảm, dễ bị dập có tác động mạnh 28 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tiến hành đồng nuôi cấy mẫu với dịch vi khuẩn, số mẫu xuất rễ, khơng có sai khác nhiều số mẫu rễ nồng độ vi khuẩn dùng để lây nhiễm Khi ngâm mẫu dung dịch vi khuẩn pha lo ãng khác số có tỉ lệ sống khác Tỉ lệ mẫu sống cao nồng độ pha loãng 30 lần Đoạn thân ni rock wool có chứa mơi trường MS lỏng dung dịch vi khuẩn số đoạn thân sống rễ nhiều hơn, rễ tóc nhiều bổ sung 10 ml/l dung dịch vi khuẩn vào môi trường nuôi Cây cà độc dược tiêm dịch vi khuẩn trực tiếp chết nhiều, có đối chứng xuất rễ 5.2 Đề nghị Nên trì phương pháp đồng nuôi cấy mẫu với dịch vi khuẩn thử nghiệm nồng độ kháng sinh khác để tìm lượng thích hợp Cần nghiên cứu thêm nồng độ vi khuẩn thích hợp để phương pháp tiêm có hiệu Li trích DNA rễ xuất mẫu để kiểm tra diện gen rol 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Trần Nam An 2008 Bước đầu khảo sát ảnh hưởng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes lên tổng hợp alkaloid mẫu cấy dịch huyền phù Trường xuân hoa (Catharathus roseus) in vitro Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Trần Quốc Dung (chủ biên), Nguyễn Hữu Lộc Trần Thị Lệ 2008 Công nghệ chuyển gen (động vật thực vật) Nhà xuất Đại học Huế Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2000 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng (tập 2: Chuyển nạp gen) Nhà xuất Nông nghiệp trang 95 – 103 Nguyễn Thị Thu Hòa 2008 Xây dựng hệ thống tái sinh bước đầu lây nhiễm mẫu cà độc dược (Datura innoxia Mill) vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Khóa luận tốt nghiệp Kĩ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Lê Văn Hồng 2008 Giáo trình – Bài giảng – Giáo án Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Đại học Đà Nẵng, tháng 257 – 266 Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh Cao Cường 2002 Công nghệ gen Nhà xuất đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, trang 129 – 166 Trần Thị Lệ Minh, Bùi Cách Tuyến, Bourgaud Frédéric Gontier Eric 2005 Sản xuất hợp chất thứ cấp với mơ hình thủy canh Tạp chí KHKT Nơng lâm nghiệp: 146 – 152 Trần Thị Lệ Minh, Bùi Cách Tuyến, Bourgaud Frédéric Gontier Eric 2005 Kích thích sinh tổng hợp hoạt chất thứ cấp Tạp chí KHKT Nơng lâm nghiệp: 146 – 152 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Akasaka Y, Mii M, Daimon H 1998 Morphological alterations and root nodule formation in Agrobacterium rhizogenes-mediated transgenic hairy roots of peanut (Arachis hypogaea L.) Annals of Botany 81: 355–362 10 Baranski R – Klcke E – Schumann G 2006 Green flourescent protein as an efficient selection marker for Agrobacterium rhizogenes mediated carrot transformation 2006 Plant Cell Rep 25: 190 – 197 11 Batra J., Dutta A., Singh D., Kumar S and Sen J 2004 Growthh and terpenoid indole alkaloid production in Catharanthus roseus hairy root clones in relation to left – and – right – termini – linked Ri T – DNA gene integration Plant cell report 23: 148 – 154 30 12 Chabaud Mireille, Aurélien Boisson – Dernier, Juan Zhang, Christopher G Taylor, Olives Yu and David G Barker 2006 Agrobacterium rhizogenes – mediated root transformation Medicago truncatula handbook: – 13 Dechaux Celine and Michelle Biotel – Conti 2005 A strategy for overraccumulation of scopolamine in Datura innoxia hairy root cultures Acta biologica cracoviensia series botanica 47/1: 1001 – 107 14 Georgina Estrada-Navarrete, Xochitl Alvarado-Affantranger, Juan-Elías Olivares, Claudia Díaz - Camino, Olivia Santana, Enrique Murillo, Gabriel Guillén, Nayeli Sánchez-Guevara, Jorge Acosta, Carmen Quinto, Dongxue Li, Peter M Gresshoff, and Federico Sánchez 2006 Agrobacterium rhizogenes Transformation of the Phaseolus spp.: A Tool for Functional Genomics MPMI Vol 19: 1385 – 1393 15 Giovannini Annalisa, Nicola Pecchinoni, Mario Rabaglio and Andrea Allavena 1997 Characterization of ornamental datura plants transfomrmed by Agrobacterium rhizogenes In Vitro Cell Biol – Plant 33 : 101 - 106 16 Sangwan Rajbir S., Crinne Duerocq, and Brigitte S Sangwn – Norreel 1991 Effect of culture conditions on Agrobacterium – mediated transfomation in datura Plant Cell Reports: 90 – 93 17 Taylor Veena Veena – Christopher G 2007 Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications In Vitro Cell.Dev.Biol — Plant 43: 383 – 403 18 E Alpizar, E Dechamp, F Lapeyre – Montes, C Guilhaumon, B Bertrand, C Jourdan, P Lashermes and H Etienne 2008 Agrobacterium rhizogenestransformed Roots of Coffee (Coffea arabica): Conditions for Long-term Proliferation, and Morphological and Molecular Characterization Annals of Botany 101: 929–940 31 PHỤ LỤC Bảng Bảng số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm tạo rễ phương pháp nuôi đoạn thân cà độc dược rock wool Số đoạn thân rễ Nghiệm thức Lần I Lần II Lần III Đối chứng 100 100 100 Nồng độ vk 10ml/l 60 40 Nồng độ vk 20ml/l 20 0 Nồng độ vk 30ml/l 0 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tạo rễ phương pháp nuôi đoạn thân cà độc dược rock wool số liệu bảng Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 18766,7 6255,56 Within groups 2133,33 266,667 23,46 0,0003 Total (Corr.) 20900,0 11 ... liên kết kháng sinh với riboxome 3.2.2 Thi t bị, dụng cụ, hóa chất 3.2.2.1 Nuôi cấy in vitro lây nhiễm mẫu cà độc dược với vi khuẩn Thi t bị dụng cụ cần thi t kĩ thuật nuôi cấy mô Kháng sinh:... agropine Nó có kích thước 1032 bp, mã hóa cho protein có 344 amino acid, ornithine cyclodeaminase enzyme xúc tác chuyển hóa ornithine thành proline Sự diện rolD chuyển gen kích thích hoa sớm, làm tăng... QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thi u chuyển gen 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 2.2 Giới thi u cà độc dược 2.2.1