BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME RT-PCR XÁC ĐỊNH VI KHUẨN LAO (Mycobacterium tuberculosis) SỐNG DỰA TRÊN TRÌNH TỰ ĐÍCH LÀ mRNA CỦA ANTIGEN ALPHA GENE Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN PHAN THÀNH Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME RT-PCR XÁC ĐỊNH VI KHUẨN LAO (Mycobacterium tuberculosis) SỐNG DỰA TRÊN TRÌNH TỰ ĐÍCH LÀ mRNA CỦA ANTIGEN ALPHA GENE Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY NGUYỄN PHAN THÀNH CN HỒ THỊ THANH THỦY Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Cô Lê Huyền Ái Thúy, chị Hồ Thị Thanh Thủy, anh Nguyễn Duy Khánh, anh Nguyễn Văn Hưng hết lòng hướng dẫn, bảo kiến thức lý thuyết thao tác thực nghiệm giúp tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị điều kiện làm việc cho suốt thời gian thực tập công ty Các bạn nhóm thực đề tài này, bạn lớp, gia đình, thầy Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh giúp đỡ, ủng hộ tinh thần, vật chất cho tơi lúc khó khăn thời gian thực đề tài Người thực Nguyễn Phan Thành i   TÓM TẮT Trước xuất chủng lao kháng thuốc, với đại dịch HIV, việc điều trị bệnh ngày trở nên khó khăn Bên cạnh phướng pháp xác định vi khuẩn lao trước không phục vụ tốt công tác theo dõi hiệu điều trị Chính ngun nhân trên, đề tài “xây dựng quy trình real-time RT-PCR nhằm xác định vi khuẩn lao sống dựa trình tự đích mRNA antigen alpha gene” thực nhằm cung cấp quy trình phát nhanh tồn vi khuẩn lao sống thể bệnh nhân Với mục tiêu vậy, nhóm thực thiết kế cặp mồi mẫu dò đặc hiệu cho mRNA gen 85B Sau đó, tiến hành khảo sát đặc điểm, khả hoạt động hệ mồi-mẫu dò này, lý thuyết lẫn thực nghiệm Để tránh trường hợp dương tính giả xảy với quy trình, thí nghiệm bố trí để khảo sát nồng độ enzyme DNase cần để tinh dịch chiết RNA Tiếp theo khảo sát xác định thông số nhiệt độ lai hệ mồi-mẫu dị, độ nhạy quy trình Cuối cùng, với kết thu được, quy trình ứng dụng mẫu bệnh phẩm Nhờ hỗ trợ chương trình máy tính, mồi xi-MTBF6, mồi ngượcMTBR6, mẫu dò-MTBP5 thiết kế kiểm tra lý thuyết lẫn thực nghiệm cho thấy ba hoạt động tốt khuếch đại đặc hiệu với trình tự mRNA gen 85B Nồng độ enzyme DNase cần sử dụng unit (u) Nhiệt độ lai mồi 59oC Độ nhạy quy trình 102 copies/ml Ứng dụng quy trình mẫu bệnh phẩm có 9/30 mẫu dương tính ii   SUMMARY Because the emergence of drug-resistant tuberculosis and HIV, it is more difficult to treat, especially to mornitor the effective of treatment in order to get the best therapeutic methods for each patient In additions, the methods of determining Mycobacterium tuberculosis could not detect viable M tuberculosis, required long time and are not good for mornitoring treatment tuberculosis Because of these reasons, the project “Detection of viable M tuberculosis by real-time RT-PCR amplification on mRNA alpha antigen” is carried out to provide a process that is to identify viable MTB in human rapidly With these purposes, we designed specific primers and probe for mRNA of antigen 85B, then test traits, performance of them by theoretical and experimental tests Avoiding false positive results, an assay to survey concentration of enzyme DNAse needed purifying RNA extracts The next survey is to determine parameters of primers temperator melt as well as the sentivity of the process Finally, with the results obtained, the process is applied on the samples After months, we have successfully designed primers and probe specificly amplified for mRNA of antigen 85B The needed enzyme DNase concentration is unit (u) The melt temperator of primers is 59oC The sensitivity of the process is 102 copies/ml The results is 9/30 positive samples             iii   MỤC LỤC   Trang   Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Danh sách từ viết tắt viii Danh sách bảng x Danh sách hình xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh lao 2.1.1 Lịch sử bệnh lao 2.1.2 Khái niệm bệnh lao 2.1.3 Nguồn lây 2.1.4 Đường xâm nhiễm 2.1.5 Diễn biến bệnh 2.1.5.1 Nhiễm lao 2.1.5.2 Bệnh lao 2.1.6 Miễn dịch dị ứng bệnh lao 2.1.6.1 Miễn dịch bệnh lao 2.1.6.2 Dị ứng bệnh lao 2.1.6.3 Các phương pháp phát dị ứng 2.1.7 Tình hình bệnh lao 2.1.7.1 Tình hình bệnh lao giới 2.1.7.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam 2.1.7.3 Tình hình bệnh lao kháng thuốc iv   2.2 Vi khuẩn lao 2.2.1 Phân loại 10 2.2.2 Đặc điểm vi khuẩn lao 10 2.2.3 Giới thiệu kháng nguyên 85B vi khuẩn lao 13 2.3 Phương pháp chẩn đoán 15 2.3.2.1 Phương pháp nhuộm soi đàm tìm AFB 15 2.3.2.2 Phương pháp ni cấy tìm vi khuẩn lao 15 2.3.2.3 Phương pháp X-quang phổi chuẩn 15 2.3.2.4 Phương pháp thử phản ứng Tuberculin 16 2.3.2.5 Phương pháp ELISA 16 2.3.2.6 Phương pháp PCR 16 2.4 Phương pháp real-time RT-PCR 16 2.4.1 Phương pháp PCR 16 2.4.1.1 Nguyên tắc 17 2.4.1.2 Các bước phản ứng 17 2.4.1.3 Thành phần phản ứng PCR 18 2.4.2 Phản ứng RT 18 2.4.3 Phản ứng real-time PCR 19 2.4.3.1 Khái niệm real-time PCR 19 2.4.3.2 Nguyên tắc hoạt động 19 2.4.3.3 Ưu điểm 19 2.4.3.4 Mẫu dò real-time PCR 19 2.4.3.5 Khái niệm chu kỳ ngưỡng 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu 22 3.2.1 Mẫu chứng dương mẫu bệnh phẩm 22 3.2.2 Mồi mẫu dò 22 3.2.3 Vật liệu hóa chất dùng để xử lý mẫu bệnh phẩm 22 3.2.4 Vật liệu hóa chất dùng để tách chiết mRNA 22 3.2.5 Vật liệu hóa chất dùng cho phản ứng RT 23 v   3.2.6 Vật liệu hóa chất dùng cho phản ứng real-time PCR 23 3.2.7 Thiết bị dụng cụ 23 3.3 Phương pháp 24 3.3.1 Phương pháp thiết kế mồi mẫu dò 24 3.3.1.1 Các phần mềm máy tính sử dụng 24 3.3.1.2 Phương pháp tiến hành 24 3.3.1.3 Các tiêu chuẩn thiết kế mồi 24 3.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 25 3.3.3 Phương pháp tách chiết mRNA 25 3.3.3.1 Nguyên tắc 25 3.3.3.2 Phương pháp tách chiết RNA 26 3.3.4 Phương pháp real-time RT-PCR 26 3.3.4.1 Phương pháp RT 27 3.3.4.2 Phương pháp real-time PCR 27 3.3.5 Phương pháp đánh giá mồi mẫu dò 27 3.3.5.1 Phương pháp đánh giá khả hoạt động mồi mẫu dò 27 3.3.5.2 Phương pháp xác định nồng độ enzyme DNase 28 3.3.5.3 Phương pháp xác định độ đặc hiệu mồi mẫu dò 29 3.3.5.4 Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu mồi 29 3.3.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy quy trình 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết khảo sát hệ mồi-mẫu dò lý thuyết 31 4.1.1 Khảo sát đặc tính hệ mồi-mẫu dò 31 4.1.2 Kết khảo sát độ đặc hiệu hệ mồi-mẫu dò 32 4.2 Kết xây dựng quy trình real-time RT-PCR 34 4.2.1 Kết khảo sát hoạt động hệ mồi mẫu dò 34 4.2.2 Khảo sát nhiệt độ lai 34 4.2.3 Khảo sát nồng độ DNase 35 4.2.4 Khảo sát độ đặc hiệu .38 4.2.5 Khảo sát độ nhạy 39 4.2.6 Áp dụng quy trình mẫu bệnh phẩm 39 vi   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC vii   DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AFB : Acid-fast bacillus (trực khuẩn kháng cồn kháng axit) BLAST : Basic local alignment tool Bp : Base pair cDNA : Complementary DNA DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic acid ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay HIV : Human Immunodeficiency Virus kD : KiloDalton LAM : Lipoarabinomannan MDR-TB : multidrug-resistant tuberculosis MGIT : Mycobacterium growth indicator tube MHC : Major Histocompability Complex mRNA : Messenger ribonucleic acid MTB : Mycobacterium tuberculosis NALC : N-acetyl-L-cysteine PCR : Polymerase chain reaction PPD : Purified Protein Derivative RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal ribonucleic acid RT : Reverse transcriptase TCD4 : T-cell depletion Tm : Temperature melting viii   khác biệt so với phương pháp cũ Sự khác biệt mẫu chứng dương giải thích mẫu bệnh phẩm khơng chứa vi khuẩn lao sống, hay vi khuẩn chết lúc vận chuyển Các nghiên cứu Desjardin ctv (1996), Jou ctv (1997), Hellyer ctv (1998) , áp dụng phương pháp RT-PCR trình tự mRNA 85B vi khuẩn lao, Mdivani ctv (2009) sử dụng phương pháp real-time RT-PCR, dừng lại việc so sánh kết phản ứng mRNA so với DNA, chưa đưa quy trình real-time RT-PCR cụ thể Việc xây dựng thành cơng quy trình phát vi khuẩn lao sống phương pháp real-time RT-PCR trình tự mRNA 85B tiếp nối kết nghiên cứu trên, đồng thời phát triển hồn chỉnh kết để đưa nghiên cứu ứng dụng thực tế Sự phát triển hoàn chỉnh đề tài so với nghiên cứu trước việc thiết kế cặp mồi mẫu dò đặc hiệu cho chủng vi khuẩn lao gây bệnh (các nghiên cứu trước áp dụng chủng lao định), khảo sát xác định nhiệt độ lai mồi 59oC, độ nhạy thu 102 copies/ml (đây độ nhạy cao cho quy trình realtime RT-PCR) 41   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua tháng thực đề tài, xây dựng thành cơng quy trình real-time RT-PCR nhằm phát vi khuẩn lao sống dựa trình tự đích mRNA antigen alpha gene Trong đó, hệ mồi mẫu dị thiết kết đặc hiệu cho trình tự mRNA 85B vi khuẩn lao, nồng độ enzyme DNase thấp cần để tinh dịch chiết RNA u, nhiệt độ lai cặp mồi 59oC độ nhạy quy trình 102 copies/ml Khi áp dụng quy trình mẫu bệnh phẩm cho thấy phát 9/22 mẫu xét nghiệm dương tính trước 8/8 mẫu âm tính 5.2 Đề nghị Tuy xây dựng thành cơng quy trình phát vi khuẩn lao sống cách nhanh chóng hiệu quả, song đề tài nhiều hạn chế như: khơng thể sử dụng mẫu có chứa mRNA 85B biết trước nồng độ để khảo sát độ nhạy tồn quy trình, khảo sát 30 mẫu bệnh phẩm khơng có hồ sơ bệnh án Trong hạn chế lớn chưa thể áp dụng quy trình mẫu bệnh phẩm có hồ sơ bệnh án, nhằm kiểm tra mức độ hiệu quy trình thực tế cách rõ ràng Vì vậy, đề nghị tiếp tục khảo sát quy trình mẫu bệnh phẩm với số lượng lớn có hồ sơ bệnh án, để đánh giá mức độ hiệu quy trình 42 42   TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bio-Rad Laboratories, lnc Real-time PCR kỹ thuật-ứng dụng Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Phương pháp PCR Sinh học phân tử Nhà xuất bảng Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh, trang 190 – 199 Hướng dẫn chẩn đốn, điều trị phịng bệnh lao Ban hành kèm theo Quyết định số 979 /QĐ-BYT ngày 24 tháng3 năm 2009 Bộ trưởng Bộ Y tế Trần Văn Sáng 2007 Đặc điểm bệnh lao Bệnh học lao Nhà xuất Y học, Hà Nội, trang 10 – 20 Tài liệu tiếng Anh Cristopher Z Schneider, Tanya Parish, Luiz A Basso, Diógenes S Santos 2008 The two chorismate mutases from both Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium smegmatis: Biochemical analysis and limited regulation of promoter activity by aromatic amino acids Journal of Bacteriology, vol 190, p 122–134 David N McMurray 1996 Mycobacteria and Nocardia Medical Microbiology Samuel Baron The University of Texas Medical Branch at Galveston Desjardin L E., Perkins M D., Teixeira L., Cave M D., Eisenach K D 1996 Alkaline decontamination of sputum specimens adversely affects stability of Mycobacterial mRNA Journal Of Clinical Microbiology, vol 34, p 2435– 2439 Gunter Harth, Bai-Yu Lee, Jun Wang, Daniel L Clemens, Marcus A Horwitz 1996 Novel Insights into the genetics, biochemistry, and immunocytochemistry of the 30-kilodalton major extracellular protein of Mycobacterium tuberculosis INFECTION AND IMMUNITY, vol 64, p 3038–3047 Hellyer T J., Desjardin L E., Hehman G L., Cave M D., Eisenach K D 1998 Quantitative analysis of mRNA as a marker for viability of Mycobacterium tuberculosis Journal of Clinical Microbiology, vol 58, p 290– 295 10 Jay Arthur Myers 1952 Editorial: Chemotherapy in tuberculosis, Dis Chest, 598-600 11 Jun-ichiro Sekiguchi, Tohru Miyoshi-Akiyama, Ewa Augustynowicz-Kopec´, Zofia Zwolska, Fumiko Kirikae, Emiko Toyota, Intetsu Kobayashi, Koji Morita, Koichiro Kudo, Seiya Kato, Tadatoshi Kuratsuji, Toru Mori, Teruo Kirikae 2006 Detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis Journal of Clinical Microbiology, vol 45, p 179–192 12 Keita Miki, Toshi Nagata, Takao Tanaka, Yeung-Hyen Kim, Masato Uchijima, Naoya Ohara, Satoshi Nakamura, Masaji Okada, and Yukio Koide 2004 Induction of protective cellular immunity against Mycobacterium tuberculosis by recombinant attenuated self-destructing Listeria monocytogenes strains harboring eukaryotic expression plasmids for antigen 85 complex and MPB/MPT51 Infect Immun, vol 72, p 2014–2021 43   13 Nazarul Hasan, Mashiat Ullah Siddiqui, Zahra Toossi, Saba Khan, Jawed Iqbal, Najmul Islam 2007 Allicin-induced suppression of Mycobacterium tuberculosis 85B mRNA in human monocytes Biochemical and Biophysical Research Communications, vol 355, p 471–476 14 Nino Mdivani, Haijing Li, Maka Akhalaia, Medea Gegia, Leila Goginashvili, Douglas S Kernodle, George Khechinashvili, Yi-Wei Tang 2009 Monitoring therapeutic efficacy by real-time detection of Mycobacterium tuberculosis mRNA in sputum Clinical Chemistry 55:9 15 World Health Organization 2009.Global tuberculosis control Tài liệu tham khảo từ website 16 Nguyễn Phúc Cẩm Hoàng Lao quan niệu sinh dục 2006 http://vnthuquan.net/diendan/printable.aspx?m=47074 44   PHỤ LỤC Kết BLAST NCBI mồi xuôi   > ref|XM_001176568.1| PREDICTED: Strongylocentrotus purpuratus similar to polo-like kinase (LOC579629), mRNA Length=2007 GENE ID: 579629 LOC579629 | similar to polo-like kinase [Strongylocentrotus purpuratus] Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query GCTGCGTAGGGTCGTT 22 |||||||||||||||| Sbjct 893 GCTGCGTAGGGTCGTT 878 > ref|XR_026474.1| PREDICTED: Strongylocentrotus purpuratus similar to polo-like kinase (LOC587774), mRNA Length=1731 GENE ID: 587774 LOC587774 | similar to polo-like kinase [Strongylocentrotus purpuratus] Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query GCTGCGTAGGGTCGTT 22 |||||||||||||||| Sbjct 694 GCTGCGTAGGGTCGTT 679 > ref|XR_026567.1| PREDICTED: Strongylocentrotus purpuratus similar to polo-like kinase (LOC587774), mRNA Length=1731 GENE ID: 587774 LOC587774 | similar to polo-like kinase [Strongylocentrotus purpuratus] Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query GCTGCGTAGGGTCGTT 22 |||||||||||||||| Sbjct 694 GCTGCGTAGGGTCGTT 679   > ref|XM_779733.2| PREDICTED: Strongylocentrotus purpuratus similar to polo-like kinase (LOC579629), mRNA Length=2007 GENE ID: 579629 LOC579629 | similar to polo-like kinase [Strongylocentrotus purpuratus] Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query GCTGCGTAGGGTCGTT 22 |||||||||||||||| Sbjct 893 GCTGCGTAGGGTCGTT 878 > gb|EU172806.1| Uncultured fungus clone G912P34RB17.T0 18S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=792 Score = 30.2 bits (15), Expect = 75 Identities = 18/19 (94%), Gaps = 0/19 (0%) Strand=Plus/Minus Query TCTGCTGCGTAGGGTCGTT 22 |||||||| |||||||||| Sbjct 752 TCTGCTGCTTAGGGTCGTT 734 > ref|XM_001635469.1| Nematostella vectensis predicted protein (NEMVEDRAFT_v1g241554) partial mRNA Length=4227 GENE ID: 5515446 NEMVEDRAFT_v1g241554 | hypothetical protein [Nematostella vectensis] (10 or fewer PubMed links) Score = 30.2 bits (15), Expect = 75 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Minus Query CTGCGTAGGGTCGTT 22 ||||||||||||||| Sbjct 2124 CTGCGTAGGGTCGTT 2110 > ref|XM_001520712.1| PREDICTED: Ornithorhynchus anatinus similar to kinesin family member 13B, (LOC100092048), partial mRNA Length=2233 GENE ID: 100092048 LOC100092048 | similar to kinesin family member 13B [Ornithorhynchus anatinus] Score = 30.2 bits (15), Expect = 75 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Minus Query CTGCGTAGGGTCGTT 22 ||||||||||||||| Sbjct 1677 CTGCGTAGGGTCGTT 1663 > gb|AE017125.1| Helicobacter hepaticus ATCC 51449, complete genome Length=1799146 Features in this part of subject sequence: hypothetical protein Score = 30.2 bits (15), Expect = 75 Identities = 18/19 (94%), Gaps = 0/19 (0%) Strand=Plus/Minus Query TCTGCTGCGTAGGGTCGTT 22 ||||||| ||||||||||| Sbjct 534129 TCTGCTGAGTAGGGTCGTT 534111   Kết BLAST NCBI mồi ngược   > gb|AF542530.2| Cryptococcus neoformans var neoformans strain JEC20 mating type a locus, complete sequence Length=148067 Score = 36.2 bits (18), Expect = 1.2 Identities = 18/18 (100%), Gaps = 0/18 (0%) Strand=Plus/Minus Query ACAAGGCCGCAGACATGT 22 |||||||||||||||||| Sbjct 22354 ACAAGGCCGCAGACATGT 22337 > ref|XM_002804709.1| PREDICTED: Macaca mulatta ryanodine receptor (RYR3), mRNA Length=15127 GENE ID: 694996 RYR3 | ryanodine receptor [Macaca mulatta] Score = 34.2 bits (17), Expect = 4.8 Identities = 17/17 (100%), Gaps = 0/17 (0%) Strand=Plus/Minus Query CAAGGCCGCAGACATGT 22 ||||||||||||||||| Sbjct 5790 CAAGGCCGCAGACATGT 5774 > emb|AL732530.6| Mouse DNA sequence from clone RP23-102I12 on chromosome Contains a heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (Hnrpa1) pseudogene, complete sequence Length=211998 Features flanking this part of subject sequence: 81051 bp at 3' side: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (Hnrpa1) pseud Score = 34.2 bits (17), Expect = 4.8 Identities = 17/17 (100%), Gaps = 0/17 (0%) Strand=Plus/Minus Query CAAGGCCGCAGACATGT 22 ||||||||||||||||| Sbjct 40425 CAAGGCCGCAGACATGT 40409 > ref|XM_001923782.2| PREDICTED: Danio rerio si:dkeyp-94b4.1 (si:dkeyp-94b4.1), partial mRNA Length=2614 GENE ID: 562786 si:dkeyp-94b4.1 | si:dkeyp-94b4.1 [Danio rerio] Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Plus Query AAGGCCGCAGACATGT 22 |||||||||||||||| Sbjct 1950 AAGGCCGCAGACATGT 1965   > emb|FP929061.1| Clostridiales sp SSC/2 draft genome Length=3114788 Features in this part of subject sequence: ABC-type cobalt transport system, ATPase component Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Plus Query AAGGCCGCAGACATGT 22 |||||||||||||||| Sbjct 595382 AAGGCCGCAGACATGT 595397 > gb|BT083059.1| Anoplopoma fimbria clone afim-evh-006-327 39S ribosomal protein L40, mitochondrial precursor putative mRNA, complete cds Length=811 Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query AAGGCCGCAGACATGT 22 |||||||||||||||| Sbjct 142 AAGGCCGCAGACATGT 127 > gb|BT082657.1| Anoplopoma fimbria clone afim-evh-513-224 39S ribosomal protein L40, mitochondrial precursor putative mRNA, complete cds Length=920 Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query AAGGCCGCAGACATGT 22 |||||||||||||||| Sbjct 125 AAGGCCGCAGACATGT 110 > gb|CP001390.1| Geobacter sp FRC-32, complete genome Length=4304501 Features in this part of subject sequence: heavy metal sensor signal transduction histidine kinase Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Plus Query AAGGCCGCAGACATGT 22 |||||||||||||||| Sbjct 3489445 AAGGCCGCAGACATGT 3489460 > gb|CP001013.1| Leptothrix cholodnii SP-6, complete genome Length=4909403 Features in this part of subject sequence: preprotein translocase, SecY subunit Score = 28.2 bits (14), Expect = 297 Identities = 17/18 (94%), Gaps = 0/18 (0%) Strand=Plus/Plus Query ACAAGGCCGCAGACATGT 22 ||||||||||||| |||| Sbjct 4411651 ACAAGGCCGCAGAAATGT 4411668 > gb|EU020306.1| Mesocyclops edax clone Meso149f2 putative integrinlinked protein kinase mRNA, partial cds Length=950 Score = 32.2 bits (16), Expect = 19 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Plus Query AAGGCCGCAGACATGT 22 |||||||||||||||| Sbjct 783 AAGGCCGCAGACATGT 798   > emb|FP340317.5| Zebrafish DNA sequence from clone CH73-206M9, complete sequence Length=17753 Score = 30.2 bits (15), Expect = 75 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Minus Query AGGCCGCAGACATGT 22 ||||||||||||||| Sbjct 8410 AGGCCGCAGACATGT 8396 > ref|XM_002308898.1| Populus trichocarpa predicted protein, mRNA Length=2775 GENE ID: 7496124 POPTRDRAFT_867254 | hypothetical protein [Populus trichocarpa] (10 or fewer PubMed links) Score = 30.2 bits (15), Expect = 75 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Minus Query AGGCCGCAGACATGT 22 ||||||||||||||| Sbjct 526 AGGCCGCAGACATGT 512 > emb|FM211192.1| Mycobacterium leprae Br4923, complete genome sequence Length=3268071 Features in this part of subject sequence: antigen 85A, mycolyltransferase Score = 30.2 bits (15), Expect = 75 Identities = 18/19 (94%), Gaps = 0/19 (0%) Strand=Plus/Plus Query TACAAGGCCGCAGACATGT 22 ||||||||||| ||||||| Sbjct 2419178 TACAAGGCCGCGGACATGT 2419196 > gb|CP001124.1| Geobacter bemidjiensis Bem, complete genome Length=4615150 Features in this part of subject sequence: peptidase M48 Ste24p Score = 28.2 bits (14), Expect = 297 Identities = 14/14 (100%), Gaps = 0/14 (0%) Strand=Plus/Minus Query GGCCGCAGACATGT 22 |||||||||||||| Sbjct 3898029 GGCCGCAGACATGT 3898016 > gb|AC231789.1| Oryza minuta clone OM Ba0222K02, complete sequence Length=179883 Score = 30.2 bits (15), Expect = 75 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Plus Query AGGCCGCAGACATGT 22 ||||||||||||||| Sbjct 124842 AGGCCGCAGACATGT 124856   Kết BLAST NCBI mẫu dò   gb|CP000539.1| Acidovorax sp JS42, complete genome > Length=4448856 Features in this part of subject sequence: DNA mismatch repair enzyme (predicted ATPase)-like protein Score = 34.2 bits (17), Expect = 6.4 Identities = 17/17 (100%), Gaps = 0/17 (0%) Strand=Plus/Plus Query GACCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||||| Sbjct 2333431 GACCCGGCATGGGAGCG 2333447 > gb|CP001854.1| Conexibacter woesei DSM 14684, complete genome Length=6359369 Features in this part of subject sequence: glucose-methanol-choline oxidoreductase Score = 32.2 bits (16), Expect = 25 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query ACCCGGCATGGGAGCG 23 |||||||||||||||| Sbjct 5758363 ACCCGGCATGGGAGCG 5758348 > emb|CU207383.6| Pig DNA sequence from clone CH242-506C13 on chromosome X, complete sequence Length=217439 Score = 32.2 bits (16), Expect = 25 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query ACCCGGCATGGGAGCG 23 |||||||||||||||| Sbjct 190658 ACCCGGCATGGGAGCG 190643 > gb|CP001043.1| Burkholderia phymatum STM815 chromosome 1, complete sequence Length=3479187 Features flanking this part of subject sequence: bp at 5' side: 4'-phosphopantetheinyl transferase 490 bp at 3' side: amino acid adenylation domain protein Score = 32.2 bits (16), Expect = 25 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Plus   Query Sbjct 1885954 ACCCGGCATGGGAGCG |||||||||||||||| ACCCGGCATGGGAGCG 23 1885969 > gb|CP000473.1| Solibacter usitatus Ellin6076, complete genome Length=9965640 Features in this part of subject sequence: bacterial translation initiation factor (bIF-2) Score = 32.2 bits (16), Expect = 25 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Plus Query ACCCGGCATGGGAGCG 23 |||||||||||||||| Sbjct 6508484 ACCCGGCATGGGAGCG 6508499 > gb|CP000285.1| Chromohalobacter salexigens DSM 3043, complete genome Length=3696649 Features flanking this part of subject sequence: 88 bp at 5' side: protein of unknown function DUF1232 44 bp at 3' side: hypothetical protein Score = 32.2 bits (16), Expect = 25 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Plus Query ACCCGGCATGGGAGCG 23 |||||||||||||||| Sbjct 168053 ACCCGGCATGGGAGCG 168068 > gb|CP001220.1| Comamonas testosteroni CNB-2, complete genome Length=5373643 Features in this part of subject sequence: ApbE-like lipoprotein Score = 30.2 bits (15), Expect = 100 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Minus Query CCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||| Sbjct 3454384 CCCGGCATGGGAGCG 3454370 > gb|CP001804.1| Haliangium ochraceum DSM 14365, complete genome Length=9446314 Features in this part of subject sequence: protein of unknown function DUF1568 Score = 30.2 bits (15), Expect = 100 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Minus Query CCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||| Sbjct 3974609 CCCGGCATGGGAGCG 3974595 > emb|FN554889.1| Streptomyces scabiei 87.22 complete genome Length=10148695 Features in this part of subject sequence: putative glucose dehydrogenase Score = 30.2 bits (15), Expect = 100 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Plus Query CCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||| Sbjct 9960459 CCCGGCATGGGAGCG 9960473 > gb|CP001729.1| Alicyclobacillus acidocaldarius subsp acidocaldarius DSM 446 plasmid pAACI02, complete sequence Length=87298   Score = 30.2 bits (15), Expect = 100 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Minus Query CCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||| Sbjct 16630 CCCGGCATGGGAGCG 16616 > ref|NG_008919.1| Homo sapiens UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4galactosyltransferase, polypeptide (B4GALT1), RefSeqGene on chromosome Length=63718 Score = 30.2 bits (15), Expect = 100 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Plus Query CCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||| Sbjct 33348 CCCGGCATGGGAGCG 33362 > ref|XM_001930339.1| Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP hypothetical protein, mRNA Length=1179 GENE ID: 6339005 PTRG_00041 | hypothetical protein [Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP] Score = 30.2 bits (15), Expect = 100 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Plus Query CCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||| Sbjct 409 CCCGGCATGGGAGCG 423 > gb|CP000830.1| Dinoroseobacter shibae DFL 12, complete genome Length=3789584 Features in this part of subject sequence: conserved hypothetical protein Score = 30.2 bits (15), Expect = 100 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Plus Query CCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||| Sbjct 2716678 CCCGGCATGGGAGCG 2716692 > ref|XM_001561830.1| Leishmania braziliensis MHOM/BR/75/M2904 hypothetical protein, conserved (LbrM05_V2.0660) partial mRNA Length=7287 GENE ID: 5412781 LbrM05_V2.0660 | hypothetical protein [Leishmania braziliensis MHOM/BR/75/M2904] (10 or fewer PubMed links) Score = 30.2 bits (15), Expect = 100 Identities = 15/15 (100%), Gaps = 0/15 (0%) Strand=Plus/Plus Query CCCGGCATGGGAGCG 23 ||||||||||||||| Sbjct 2749 CCCGGCATGGGAGCG 2763   ... nhân trên, đề tài ? ?xây dựng quy trình real-time RT-PCR nhằm xác định vi khuẩn lao sống dựa trình tự đích mRNA antigen alpha gene? ?? thực nhằm cung cấp quy trình phát nhanh tồn vi khuẩn lao sống. .. TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME RT-PCR XÁC ĐỊNH VI KHUẨN LAO (Mycobacterium tuberculosis) SỐNG DỰA TRÊN TRÌNH TỰ ĐÍCH LÀ mRNA CỦA ANTIGEN ALPHA GENE Hướng dẫn khoa học Sinh vi? ?n thực TS... diện vi khuẩn lao sống mẫu bệnh phẩm Vì phương pháp xác định vi khuẩn lao sống dựa trình tự đích mRNA antigen alpha gene cho kết nhanh đặc hiệu với dòng vi khuẩn lao, đáp ứng kịp thời cho vi? ??c