BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC Streptomyces VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : LƯƠNG THỊ YẾN NGUYỆT Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC STREPTOMYCES VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT LƯƠNG THỊ YẾN NGUYỆT KS LÊ HỒNG THỦY TIÊN Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, ngồi nổ lực thân dẫn tận tình thầy cơ, giúp đỡ bạn bè động viên khích lệ từ gia đình Bằng lòng biết ơn chân thành sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập trường ThS Nguyễn Như Nhứt, người thầy, người anh tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi để hồn thành khóa luận Các anh chị Cơng ty Gia Tường – Chi nhánh tỉnh Bình Dương giúp đỡ tơi nhiều q trình thực khóa luận q trình làm quen với mơi trường làm việc Các bạn lớp CNSH 32 làm việc, động viên, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian học tập vừa qua Má, người dõi theo bước tôi, người gia đình quan tâm, ủng hộ tơi học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Sinh viên thực Lương Thị Yến Ngyệt TÓM TẮT i Ngày nay, xã hội ngày phát triển, mức sống người cao Do đó, nhu cầu ứng dụng khoa học kỹ thuật vào vào đời sống ngày nhiều Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật nói chung cơng nghệ enzyme nói riêng, chế phẩm enzyme mà đặc biệt protease ứng dụng ngày nhiều nhiều vào lĩnh vực như: công nghiệp da, công nghệ thực phẩm, công nghiệp sữa, chất tẩy rửa…Vi sinh vật nguồn thu nhận protease phong phú có giá trị Vì lý trên, thực đề tài “Khảo sát khả sinh tổng hợp protease số chủng thuộc Streptomyces ứng dụng sản xuất” Các chủng Streptomyces xác định khả sinh tổng hợp protease Trong 23 chủng Streptomyces nghiên cứu, chủng St 12 cho hoạt tính protease cao Chủng ni cấy môi trường sinh protease dịch thể với điều kiện khác để chọn điều kiện thích hợp cho tổng hợp protease Hoạt tính protease hàm lượng protein xác định phương pháp Anson phương pháp Lowry Kết thu cho thấy protease đạt hoạt tính cao (0,628 đvht/ml) pH = sau ngày nuôi cấy Pepton sucrose với nồng độ % nguồn nitrogen carbon tốt Và sinh tổng hợp protease cao môi trường bổ sung % MgCl2 Enzyme thu được tinh sơ cách tủa ethanol với tỷ lệ thời gian khác Với tỷ lệ Venzyme : Vethanol 1:3 20 phút hiệu suất thu hồi hoạt tính đạt tối đa SUMMARY ii The thesis: “Servey the ability of biosynthesizing protease of some Streptomyces and application in protease production” Nowadays, society’s developing, the masses’s living standard becomes higher with every passing day Therefore, the application’s need of science and technology become much more Following development of science and technology, enzyme technology, emzyme products in protease group were applied more and more, such as: bating hides, food, dairy industry and laundry detergent…Microorganism is plentiful sources to receive protease Thus, we carry out this thesis Streptomyces strains were assayed protease production Steptomyces strain St 12 is able to produce the highest activity protease among 23 strains be studied This strain cutivated in liquid protease production media and difference conditions to choose optium condition Enzyme was assayed by Anson and Lowry method using casein and albumin as a substrate The result show that protease production was optimum (0,626 UI/ml) after the incubation of days at pH in shaking culture 1% pepton and sucrose were the best nitrogen and carbon sources In medium adding % MgCl2, protease production ability was best Protease was received by enzyme and ethanol with volume ratio mixing Activity is maximum efficiency at Venzyme : 3Vethanol in 20 minutes Key words: Streptomyces, protease production, culture, enzyme assay MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN III TÓM TẮT IV iii SUMMARY V MỤC LỤC VI DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT X DANH SÁCH CÁC BẢNG XI DANH SÁCH CÁC HÌNH XII CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan protease 2.1.1 Giới thiệu chung protease 2.1.1.1 Định nghĩa 2.1.1.2 Cấu tạo 2.1.1.3 Chức sinh học protease 2.1.2 Phân loại protease 2.1.3 Ứng dụng 2.1.3.1 Trong sản xuất bột giặt chất tẩy rửa 2.1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm 2.1.3.3 Trong công nghiệp da 2.1.3.4 Trong lĩnh vực khác 2.1.4 Nguồn thu nhận protease 2.1.4.1 Động vật 2.1.4.2 Thực vật 2.1.4.3 Vi sinh vật 2.2 Giới thiệu chung Streptomyces 2.2.1 Hình thái phân loại Streptomyces 2.2.1.1 Hình thái 2.2.1.2 Phân loại 2.2.2 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 10 2.2.3 Chu trình đời sống Streptomyces 10 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease Streptomyces 12 iv 2.2.4.1 Thành phần môi trường 12 2.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 3.1 Thời gian đại điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu 14 3.2.1 Giống xạ khuẩn 14 3.2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 14 3.2.2.1 Hóa chất 14 3.2.2.2 Dụng cụ thiết bị 14 3.2.3 Các công thức môi trường 14 3.2.3.1 Môi trường cấy chuyền giữ giống 14 3.2.3.2 Môi trường thử khả sinh protease 15 3.3.3.3 Môi trường tăng sinh dịch thể 15 3.3.3.4 Môi trường đếm khuẩn lạc 16 3.3.3.5 Môi trường nuôi cấy dịch thể sinh tồng hợp protease 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp cấy chuyền giữ giống 16 3.3.2 Phương pháp định tính khả sinh protease 16 3.3.3 Phương pháp tăng sinh 17 3.3.4 Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc 17 3.3.5 Phương pháp nuôi cấy môi trường dịch thể 17 3.3.6 Phương pháp thu dịch chiết enzyme 18 3.3.7 Phương pháp xác định hoạt tính protease 18 3.3.7.1 Nguyên tắc 18 3.3.7.2 Hóa chất 18 3.3.7.3 Dựng đường chuẩn Tyrosine 18 3.3.7.4 Xác định hoạt tính enzyme 19 3.3.7.5 Tính kết 19 3.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng protein 20 3.3.8.1 Nguyên tắc 20 3.3.8.2 Hóa chất 20 3.3.8.3 Dựng đường chuẩn albumin 21 v 3.3.8.4 Xác định hàm lượng protein dung dịch mẫu 21 3.3.8.5 Tính kết 21 3.3.9 Phương pháp xác định khối lượng sinh khối Streptomyces 21 3.3.10 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease 22 3.3.10.1 Thời gian nuôi cấy 22 3.3.10.2 pH 22 3.3.10.3 Nguồn nitrogen 22 3.3.10.4 Nguồn carbon 22 3.3.10.5 Các loại muối 23 3.3.10.6 Vai trò thành phần mơi trường ni 23 3.3.11 Phương pháp tinh sơ protease 23 3.3.11.1 Khảo sát tỷ lệ tủa 23 3.3.11.2 Khảo sát thời gian tủa 23 3.3.12 Xác định hiệu suất thu hồi hoạt tính protease hàm lượng protein 23 3.3.13 Phương pháp đánh giá khả giặt tẩy enzyme 24 3.1.14 Sơ đồ nghiên cứu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết 26 4.1.1 Chọn giống 26 4.1.1.1 Định tính khả sinh protease chủng Streptomyces 26 4.1.1.2 Thời gian nuôi cấy 28 4.1.2 Kết ảnh hưởng số yếu tố 28 4.1.2.1 pH 28 4.1.2.2 Nguồn nitrogen 29 4.1.2.3 Nguồn carbon 30 4.1.2.4 Các loại muối 31 4.1.2.5 Vai trò thành phần môi trường nuôi cấy 32 4.1.3 Tinh sơ protease 33 4.1.3.1 Tỷ lệ tủa 33 4.1.3.2 Thời gian tủa 34 4.1.4 Thử nghiệm chế phẩm protease 35 4.2 Thảo luận 37 vi Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DIFP : Diisopropyl Fluorophosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid EGTA : Ethylene Glycol Tetraacetic Acid ISP : International Streptomyces Project Kbs : Không bổ sung MT : Môi trường p-CMB : p-chloromercuribenzoic acid PMSF : Phenylmethanesulfonylfluoride TCA : Tricloroacetic Acid Đvht : Đơn vị hoạt tính vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn Tyrosine 19 Bảng 3.2 Các bước tiến hành xác định hoạt tính protease 19 Bảng 3.3 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn Albumin 21 Bảng 4.1 Kết đường kính vòng phân giải casein 23 chủng Streptomyces 26 Bảng 4.2 Hoạt độ protease sau khoảng thời gian nuôi cấy khác 28 Bảng 4.3 Hoạt độ protease sinh khối nuôi cấy pH khác 29 Bảng 4.4 Hoạt độ protease sinh khối với nguồn nitrogen khác 30 Bảng 4.5 Hoạt độ protease sinh khối với nguồn carbon khác 31 Bảng 4.6 Hoạt độ protease sinh khối với loại muối khác 31 viii Bảng Hoạt độ protease chủng St 12 sau thời gian nuôi cấy khác Thời gian Độ nuôi pha cấy lỗng TKtb TTtb ÌOD Tyrosine 660nm (µM ) Hoạt độ protease (đvht/ml) (ngày) 10 0,043 0,168 0,125 0,304 0,134 0,042 0,166 0,124 0,301 0,133 0,043 0,147 0,105 0,255 0,112 0,049 0,187 0,138 0,334 0,147 0,049 0,191 0,142 0,344 0,151 0,047 0,187 0,140 0,339 0,149 0,051 0,217 0,166 0,400 0,176 0,049 0,202 0,153 0,369 0,163 0,044 0,206 0,162 0,391 0,172 0,044 0,217 0,173 0,415 0,183 0,048 0,230 0,182 0,438 0,193 0,046 0,235 0,189 0,453 0,199 0,050 0,289 0,239 0,572 0,252 0,049 0,281 0,232 0,555 0,244 0,047 0,271 0,224 0,536 0,236 0,048 0,189 0,141 0,341 0,150 0,052 0,196 0,144 0,348 0,153 0,050 0,192 0,143 0,345 0,152 0,053 0,176 0,123 0,298 0,131 0,052 0,161 0,110 0,267 0,118 0,056 0,170 0,115 0,279 0,123 0,058 0,181 0,123 0,299 0,131 0,053 0,167 0,114 0,278 0,122 0,060 0,183 0,124 0,300 0,132 TKtb: thử không trung bình; TTtb: thử thật trung bình Hoạt độ protease tb (đvht/ml) 0,126 0,149 0,170 0,192 0,244 0,152 0,124 0,129 Bảng Hoạt độ protease chủng St 17 sau thời gian nuôi cấy khác Thời gian Độ ni pha cấy lỗng TKtb TTtb ÌOD660nm Tyrosine (µM ) Hoạt độ Hoạt độ protease protease tb (đvht/ml) (đvht/ml) (ngày) 10 0,047 0,073 0,026 0,069 0,031 0,049 0,076 0,027 0,073 0,032 0,047 0,075 0,028 0,075 0,033 0,049 0,082 0,034 0,088 0,039 0,051 0,096 0,045 0,115 0,051 0,049 0,089 0,040 0,104 0,046 0,059 0,121 0,062 0,155 0,068 0,056 0,116 0,060 0,151 0,066 0,056 0,117 0,061 0,152 0,067 0,042 0,168 0,126 0,306 0,135 0,043 0,183 0,141 0,340 0,150 0,042 0,173 0,131 0,318 0,140 0,060 0,209 0,149 0,359 0,158 0,055 0,193 0,138 0,334 0,147 0,051 0,183 0,132 0,320 0,141 0,057 0,208 0,151 0,365 0,160 0,053 0,204 0,151 0,365 0,160 0,053 0,202 0,150 0,361 0,159 0,042 0,180 0,138 0,334 0,147 0,044 0,176 0,133 0,321 0,141 0,043 0,176 0,134 0,324 0,142 0,059 0,163 0,104 0,254 0,112 0,057 0,164 0,107 0,261 0,115 0,056 0,161 0,105 0,256 0,113 TKtb: thử khơng trung bình; TTtb: thử thật trung bình 0,032 0,045 0,067 0,141 0,149 0,160 0,144 0,113 Bảng Hoạt độ protease chủng St 32 sau thời gian nuôi cấy khác Thời gian nuôi cấy (ngày) 10 Độ pha TKtb TTtb lỗng ÌOD Tyrosine 660nm (µM ) Hoạt độ Hoạt độ protease protease (đvht/ml) (đvht/ml) 0,063 0,067 0,005 0,020 0,009 0,064 0,068 0,004 0,019 0,008 0,066 0,070 0,004 0,019 0,008 0,054 0,058 0,004 0,019 0,008 0,051 0,058 0,007 0,026 0,011 0,053 0,059 0,006 0,024 0,010 0,059 0,066 0,008 0,027 0,012 0,060 0,068 0,008 0,028 0,012 0,061 0,070 0,009 0,031 0,013 0,058 0,064 0,007 0,025 0,011 0,056 0,062 0,006 0,024 0,010 0,054 0,062 0,008 0,028 0,012 0,050 0,065 0,015 0,044 0,019 0,051 0,066 0,016 0,046 0,020 0,052 0,066 0,014 0,042 0,019 0,060 0,098 0,038 0,099 0,043 0,062 0,096 0,035 0,091 0,040 0,062 0,092 0,030 0,080 0,035 0,058 0,077 0,019 0,054 0,024 0,063 0,083 0,020 0,056 0,025 0,061 0,080 0,020 0,055 0,024 0,053 0,064 0,011 0,034 0,015 0,046 0,059 0,014 0,041 0,018 0,050 0,058 0,008 0,028 0,012 TKtb: thử khơng trung bình; TTtb: thử thật trung bình 0,008 0,010 0,013 0,011 0,019 0,040 0,024 0,015 PHỤ LỤC Khảo sát ảnh hưởng pH lên sinh tổng hợp protease chủng St 12 Bảng Hoạt độ protease sinh khối nuôi cấy pH khác Độ pH pha TKtb TTtb ÌOD660nm lỗng Tyrosine (µM ) Hoạt độ Hoạt độ protease protease tb (đvht/ml) (đvht/ml) 0,061 0,450 0,390 0,926 0,407 0,057 0,440 0,383 0,909 0,400 0,061 0,447 0,387 0,919 0,404 0,059 0,243 0,185 0,444 0,195 0,057 0,253 0,196 0,471 0,207 0,054 0,250 0,196 0,471 0,207 0,078 0,247 0,170 0,408 0,180 0,076 0,255 0,179 0,429 0,189 0,076 0,296 0,221 0,528 0,232 0,051 0,147 0,096 0,235 0,104 0,048 0,145 0,097 0,236 0,104 0,051 0,142 0,091 0,222 0,098 0,064 0,156 0,093 0,227 0,100 0,062 0,154 0,092 0,226 0,099 0,059 0,156 0,097 0,238 0,105 TKtb: thử khơng trung bình; TTtb: thử thật trung bình Sinh khối (g/100 ml) 0,404 1,350 0,203 0,979 0,200 1,083 0,102 0,835 0,101 1,264 PHỤ LỤC Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen khác lên sinh tổng hợp protease chủng St 12 Bảng Hoạt độ protease sinh khối nuôi cấy môi trường bổ sung nguồn nitrogen khác Nguồn nitrogen Cao men Casein Pepton Gelatin Kbs Độ pha TKtb TTtb lỗng ÌOD Tyrosine 660nm (µM ) Hoạt độ protease (đvht/ml) 0,152 0,263 0,111 0,271 0,119 0,155 0,262 0,108 0,262 0,115 0,153 0,264 0,111 0,269 0,119 0,272 0,296 0,024 0,066 0,029 0,278 0,303 0,025 0,068 0,030 0,298 0,305 0,007 0,025 0,011 0,136 0,549 0,413 0,980 0,431 0,134 0,533 0,399 0,948 0,417 0,129 0,532 0,403 0,956 0,421 0,105 0,226 0,121 0,294 0,129 0,106 0,222 0,116 0,281 0,124 0,094 0,233 0,139 0,335 0,148 0,065 0,263 0,198 0,475 0,209 0,064 0,270 0,206 0,493 0,217 0,064 0,261 0,197 0,472 0,208 TKtb: thử khơng trung bình; TTtb: thử thật trung bình Hoạt độ protease Sinh khối (g/100 tb ml) (đvht/ml) 0,117 1,755 0,030 2,230 0,424 1,927 0,127 1,367 0,213 1,092 PHỤ LỤC Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon khác lên sinh tổng hợp protease chủng St 12 Bảng 10 Hoạt độ protease sinh khối chủng St 12 nuôi cấy môi trường với nguồn carbon khác Nguồn carbon Xylose Glucose Sucrose Lactose Tinh bột Độ pha TKtb TTtb lỗng ÌOD Tyrosine 660nm (µM ) Hoạt độ Hoạt độ protease protease tb (đvht/ml) (đvht/ml) 0,215 0,501 0,286 0,682 0,300 0,215 0,508 0,293 0,699 0,307 0,221 0,645 0,425 1,008 0,444 0,359 0,676 0,317 0,754 0,332 0,359 0,672 0,313 0,746 0,328 0,353 0,664 0,311 0,741 0,326 0,067 0,448 0,381 0,906 0,399 0,066 0,459 0,393 0,933 0,410 0,066 0,462 0,397 0,942 0,415 0,087 0,347 0,260 0,621 0,273 0,084 0,375 0,291 0,694 0,305 0,081 0,335 0,254 0,607 0,267 0,065 0,272 0,207 0,496 0,218 0,066 0,247 0,181 0,435 0,192 0,064 0,254 0,191 0,458 0,201 TKtb: thử khơng trung bình; TTtb: thử thật trung bình Sinh khối (g/100 ml) 0,350 1,374 0,329 1,449 0,408 1,262 0,282 1,068 0,204 1,240 PHỤ LỤC Khảo sát ảnh hưởng loại muối khác lên sinh tổng hợp protease chủng St 12 Bảng 11 Hoạt độ protease sinh khối chủng St 12 nuôi cấy môi trường bổ sung với loại muối khác Các loại muối CaCl2 KCl MgCl2 Kbs Độ pha TKtb TTtb ÌOD660nm lỗng Tyrosine (µM ) Hoạt độ Hoạt độ protease protease tb (đvht/ml) (đvht/ml) 0,055 0,208 0,153 0,368 0,162 0,051 0,213 0,162 0,391 0,172 0,057 0,217 0,161 0,387 0,170 0,047 0,190 0,143 0,346 0,152 0,049 0,187 0,138 0,334 0,147 0,046 0,180 0,135 0,326 0,143 0,090 0,447 0,358 0,851 0,374 0,088 0,453 0,365 0,868 0,382 0,092 0,447 0,355 0,844 0,371 0,069 0,281 0,212 0,507 0,223 0,065 0,283 0,219 0,524 0,230 0,064 0,273 0,209 0,500 0,220 TKtb: thử khơng trung bình; TTtb: thử thật trung bình Sinh khối (g/100 ml) 0,168 1,167 0,148 1,196 0,376 1,313 0,224 1,112 PHỤ LỤC Khảo sát vai trò thành phần mơi trường lên khả sinh tổng hợp protease chủng St 12 Bảng 12 Hoạt độ protease nuôi cấy môi trường với thành phần khác Môi Độ pha trường loãng MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 TKtb TTtb ÌOD 660 Tyrosine nm (µM ) Hoạt độ protease (đvht/ml) 0,123 0,710 0,587 1,391 0,612 0,121 0,721 0,600 1,420 0,625 0,122 0,743 0,621 1,471 0,647 0,087 0,314 0,227 0,544 0,239 0,089 0,313 0,224 0,536 0,236 0,091 0,316 0,225 0,539 0,237 0,089 0,350 0,261 0,622 0,274 0,086 0,347 0,261 0,624 0,274 0,086 0,348 0,262 0,626 0,275 0,117 0,482 0,365 0,868 0,382 0,117 0,503 0,386 0,918 0,404 0,114 0,492 0,379 0,900 0,396 0,107 0,360 0,254 0,606 0,267 0,102 0,341 0,239 0,572 0,252 0,105 0,348 0,243 0,581 0,256 0,130 0,361 0,232 0,554 0,244 0,128 0,366 0,239 0,571 0,251 0,133 0,371 0,238 0,569 0,251 0,124 0,463 0,340 0,808 0,356 0,115 0,482 0,367 0,873 0,384 0,119 0,463 0,344 0,819 0,360 0,051 0,271 0,220 0,527 0,232 0,050 0,270 0,220 0,526 0,231 0,051 0,264 0,213 0,509 0,224 0,033 0,196 0,164 0,394 0,173 0,036 0,182 0,146 0,353 0,155 0,038 0,185 0,147 0,355 0,156 0,077 0,176 0,099 0,242 0,107 0,079 0,172 0,093 0,227 0,100 Hoạt độ Sinh protease khối tb (g/100 (đvht/ml) ml) 0,628 1,892 0,237 1,208 0,275 0,712 0,394 1,843 0,258 1,400 0,248 1,587 0,367 1,267 0,229 1,243 0,162 0,735 0,104 1,066 0,078 0,177 0,099 0,242 0,107 TKtb: thử khơng trung bình; TTtb: thử thật trung bình Bảng 13 pH mơi trường sau nuôi cấy chủng St 12 môi trường khiếm khuyết thành phần khác Môi trường MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 pHban đầu = pH sau nuôi cấy 8,20 8,31 8,25 8,22 8,23 8,22 7,73 7,61 7,67 8,17 8,12 8,15 8,38 8,37 8,37 8,35 8,37 8,36 7,86 7,86 7,86 7,97 7,91 7,98 7,04 7,09 7,09 8,47 8,45 8,40 pHtb 8,25 8,22 7,67 8,15 8,37 8,36 7,86 7,95 7,07 8,44 PHỤ LỤC 10 Khảo sát tỷ lệ tủa thời gian tủa tinh sơ protease ethanol Bảng 14 Hoạt độ protease trước sau tủa với tỷ lệ khác Độ Venzyme:Vethanol pha TK TT ÌOD660nm lỗng Tyrosine (µM ) Hoạt độ protease (đvht/ml) Hoạt độ protease tb (đvht/ml) Trước tủa 1:00 0,115 0,749 0,634 1,501 0,661 0,104 0,723 0,619 1,466 0,645 0,104 0,736 0,632 1,496 0,658 0,655 Sau tủa 1:01 1:02 1:03 1:04 1:05 50 0,026 0,347 0,321 0,765 8,412 50 0,029 0,338 0,31 0,739 8,127 50 0,026 0,34 0,315 0,751 8,256 50 0,024 0,57 0,546 1,294 14,235 50 0,025 0,552 0,527 1,249 13,744 50 0,025 0,561 0,536 1,271 13,976 50 0,031 0,687 0,656 1,553 17,082 50 0,032 0,641 0,609 1,442 15,866 50 0,033 0,666 0,634 1,501 16,513 50 0,033 0,625 0,593 1,405 15,452 50 0,032 0,62 0,589 1,395 15,348 50 0,035 0,615 0,58 1,374 15,115 50 0,032 0,611 0,579 1,372 15,089 50 0,03 0,607 0,577 1,367 15,038 50 0,032 0,613 0,581 1,376 15,141 TKt: thử không ; TT: thử thật 8,265 13,985 16,487 15,305 15,089 Bảng 15 Hàm lượng protein trước sau tủa với tỷ lệ khác Venzyme:Vethanol Độ pha loãng OD750nm Hàm lượng Hàm lượng protein protein tb (mg/ml) (mg/ml) Trước tủa 1:0 0,298 0,596 0,271 0,542 0,263 0,526 0,555 Sau tủa 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 50 0,226 11,3 50 0,228 11,4 50 0,225 11,25 50 0,248 12,4 50 0,249 12,45 50 0,247 12,35 50 0,282 14,1 50 0,271 13,55 50 0,296 14,8 50 0,310 15,5 50 0,286 14,3 50 0,292 14,6 50 0,289 14,45 50 0,288 14,4 50 0,287 14,35 11,317 12,400 14,150 14,800 14,400 Bảng 16 Hiệu suất thu hồi hoạt tính protease, hiệu suất thu hồi hàm lượng protein hoạt độ riêng tủa tỷ lệ tủa khác Hoạt tính protease Venzyme: Tổng Hiệu suất Vethanol hoạt độ thu hồi (đvht) (%) Hàm lượng protein Tổng hàm lượng protein (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Hoạt độ riêng (Đvht/mg ) Trước tủa 1:0 32,733 27,745 Sau tủa 1:1 8,265 25,25 11,317 40,79 0,620 1:2 13,985 42,72 12,400 44,69 1,128 1:3 16,487 50,37 14,150 51,00 1,165 1:4 15,305 46,76 14,800 53,34 1,034 1:5 15,089 46,10 14,400 51,90 1,048 Bảng 17 Hoạt độ protease trước sau tủa với với thời gian khác Thời gian tủa (phút) Độ pha loãng TK TT ÌOD660nm Tyrosine (µM ) Hoạt độ protease (đvht/ml) Hoạt độ protease tb (đvht/ml) Trước tủa 0,141 0,761 0,62 1,468 0,646 0,138 0,764 0,626 1,482 0,652 0,129 0,766 0,637 1,508 0,664 0,654 Sau tủa 10 20 30 40 50 60 50 0,03 0,574 0,544 1,289 14,184 50 0,031 0,588 0,557 1,320 14,520 50 0,03 0,572 0,542 1,285 14,132 50 0,034 0,763 0,729 1,725 18,972 50 0,033 0,766 0,733 1,734 19,075 50 0,03 0,765 0,735 1,739 19,127 50 0,029 0,631 0,602 1,426 15,685 50 0,028 0,634 0,606 1,435 15,788 50 0,031 0,633 0,602 1,426 15,685 50 0,03 0,542 0,512 1,214 13,355 50 0,03 0,617 0,587 1,391 15,296 50 0,041 0,54 0,499 1,184 13,019 50 0,033 0,59 0,557 1,320 14,520 50 0,031 0,546 0,515 1,221 13,433 50 0,033 0,557 0,524 1,242 13,666 50 0,028 0,525 0,497 1,179 12,967 50 0,031 0,507 0,476 1,129 12,424 50 0,025 0,535 0,51 1,209 13,304 TK: thử không; TT: thử thật 14,278 19,058 15,719 13,890 13,873 12,898 Bảng 18 Hàm lượng protein trước sau tủa với thời gian khác Thời gian tủa (phút) Độ pha loãng OD750nm Hàm lượng protein (mg/ml) Hàm lượng protein tb (mg/ml) Trước tủa 0,269 0,538 0,235 0,470 0,256 0,512 0,507 Sau tủa 10 20 30 40 50 60 50 0,186 9,300 50 0,186 9,300 50 0,187 9,350 50 0,2 10,000 50 0,206 10,300 50 0,193 9,650 50 0,255 12,750 50 0,242 12,100 50 0,243 12,150 50 0,261 13,050 50 0,259 12,950 50 0,257 12,850 50 0,28 14,000 50 0,263 13,150 50 0,263 13,150 50 0,445 22,250 50 0,487 24,350 50 0,466 23,300 9,317 9,983 12,333 12,950 13,433 23,300 Bảng 19 Hiệu suất thu hồi hoạt tính protease, hiệu suất thu hồi hàm lượng protein hoạt độ riêng tủa thời gian tủa khác Hoạt tính protease Thời gian (phút) Hàm lượng protein Tổng hàm Tổng hoạt Hiệu suất thu lượng độ hồi (%) protein (mg) (đvht) Hiệu suất thu hồi (%) Hoạt độ riêng (Đvht/mg ) Trước tủa 32,689 25,333 Sau tủa 10 14,128 43,67 9,317 36,78 1,533 20 19,058 57,29 9,983 39,41 1,909 30 15,719 48,07 12,333 48,68 1,275 40 13,890 42,48 12,950 51,12 1,073 50 13,873 42,43 13,433 53,03 1,033 60 12,898 39,45 23,300 91,97 0,554 ... we carry out this thesis Streptomyces strains were assayed protease production Steptomyces strain St 12 is able to produce the highest activity protease among 23 strains be studied This strain... 3.2.1 Giống xạ khuẩn 14 3.2.2 Hóa chất, dụng cụ thi t bị 14 3.2.2.1 Hóa chất 14 3.2.2.2 Dụng cụ thi t bị 14 3.2.3 Các công thức môi trường ... protease có nguồn gốc vi sinh vật sử dụng để cải thi n dinh dưỡng mùi vị thức ăn giàu protein Chúng có tác dụng làm mềm thịt, dậy mùi phó mát, cải thi n kết cấu bột, hương vị màu sắc bánh qui 2.1.3.3