BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA - TOCOPHEROL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TỪ THỊ HỒNG NHI Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 7/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA - TOCOPHEROL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN THANH ĐIỀN TỪ THỊ HỒNG NHI ThS LÊ VĂN HUY Tháng 7/2013 LỜI CẢM ƠN Qua năm học tập trường Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em tiếp thêm nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu, mà tảng vững cho em sống sau Để có thành công bước đầu ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em suốt thời gian học tập Các Thầy (Cô) Bộ môn Công nghệ Sinh học ln tận tình hướng dẫn, giảng dạy giúp đỡ em ThS Nguyễn Thanh Điền ThS Lê Văn Huy trực tiếp hướng dẫn giúp đỡtôi suốt thời gian thực đề tài Các Thầy (Cô) phòng Sắc ký thuộc Viện Nghiên cứu Cơng Nghệ Sinh Học Môi Trường – trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tồn thể lớp CNSH 35 hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đề tài Thành kính ghi ơn bố mẹ nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho động viên, hỗ trợ tinh thần, vật chất để hồn thành tốt khóa luận Bố mẹ nguồn động viên người tạo thêm sức mạnh để vượt qua khó khăn trở ngại sống TP HCM tháng năm 2013 Từ Thị HồngNhi TÓM TẮT Từ Thị Hồng Nhi, Đại Học Nông Lâm TP HCM, tháng năm 2013 “Đánh giá hàm lượng alpha – tocopherol(vitamin E) số loại thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)” GVHD: Th.S Nguyễn Thanh Điền – Th.S Lê Văn Huy – Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Đề tài tiến hành từ tháng 12 đến tháng năm 2013 Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường – Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình tách, chiết định lượng α – tocopherol số mẫu thực phẩm (tỏi Trung Quốc, tỏi Lý Sơn, rau cần tây, ớt Đà Lạt, dứa, rau ngót, trái khế) phương pháp HPLC Kết đạt được: Xây dựng quy trình định lượng hàm lượng α – tocopherol số mẫu thực phẩm đạt kết quả: Xây dựng quy trình ly trích α – tocopherol điều kiện xà phòng hóa: nồng độ KOH 0,375 mol/l, thời gian 40 phút nhiệt độ 800C, điều kiện có sục khí nitơ cho kết phân tách α – tocopherol tốt ổn định dựa hình ảnh sắc ký đồ Xây dựng quy trình định lượng α – tocopherol HPLC đạt thông số sau: độ tin cậy đường chuẩn α – tocopherol (R2 = 0,998), hiệu suất thu hồi trung bình mẫu (Rtb = 108%) Kết khảo sát số mẫu: mẫu rau ngót phát với hàm lượng αlpha – tocopherol cao hẳn (415,44mg/kg) so với mẫu tỏi (243,7 mg/kg), ớt Đà Lạt (99,83 mg/kg) rau cần tây (60,64 mg/kg) ii SUMMARY Tu Thi Hong Nhi, Nong Lam University, June 2013 “Investigation on level of α– tocopherol (vitamin E)in edible plants” Instructor: MSc Nguyen Thanh Dien – MSc Le Van Huy – Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University, Ho Chi Minh city The thesis was carried out from December 2012 to June 2013 at Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University Purpose of thesis: To establish the procedure on extraction and quantitation of α – tocopherol in edible plants (Ly Son garlic, Chinese garlic, sauropus androgynus, local celery, pineapple leaves, carambola fruit, Dalat chilli) by high performance liquid chromatography Results: Extraction procedure, was conducted on optimum conditions such as purging N2 at specific time, saponification conditions (KOH concentration: 0,375mol/l, time: 40 minute and temperature: 800C), show a good and stable extraction of α – tocopherol demonstrating by chromatographic profile Quantitation procedure of α – tocopherol on edible plants by HPLC was well performed with some parameters: high correlation efficiency (R2 = 0,998), high recovery efficiency (108%) The results of evaluation on some edible plants show that the level of α – tocopherol on sauropus androgynus (415,44 mg/kg) are higer than that levels on garlic (243,7 mg/kg), Dalat chilli (99,83 mg/kg) and local celery (60,64 mg/kg) In addition, the levels of α – tocopherol on local celery, pineapple leaves and carambola fruit are not detectable iii MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Đối tượng nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Giới thiệu vitamin E 2.1.1 Khái niệm vitamin E .3 2.1.2 Lịch sử vitamin E .3 2.1.3 Nguồn cung cấp vitamin E 2.1.4 Một số nghiên cứu định lượng vitamin E thực phẩm 2.1.5 Cấu trúc hóa học – phân loại 2.1.6 Tính chất vitamin E 2.1.6.1 Tính chất vật lý 2.1.6.2 Tính chất hóa học .6 2.1.6.3 Tính chất chống viêm 2.1.7 Chức vitamin E 2.1.8 Nhu cầu sử dụng vitamin E .8 2.1.9 Hoạt tính sinh học vitamin E 2.2 Giới thiệu HPLC (High pressure liquid chromatography – HPLC) 2.2.1 Lịch sử phát triển sắc ký 2.2.2 Hệ thống HPLC .10 2.2.3 Lựa chọn điều kiện sắc ký 12 iv 2.2.3.1 Lựa chọn pha tĩnh 12 2.2.3.2 Lựa chọn pha động 12 2.2.3.3 Lựa chọn đầu dò .12 2.2.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký phân tích Vitamin E 13 2.2.4 Các yếu tố để đánh giá quy trình phân tích 13 2.2.5 Ứng dụng sắc ký lỏng cao áp 14 2.2.6 Ưu nhược điểm HPLC .14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 3.1 Thời gian, địa điểm tiến hành .15 3.1.1 Thời gian .15 3.1.2Địa điểm 15 3.2 Vật liệu 15 3.2.1 Phương pháp thu mẫu 15 3.2.2 Hóa chất 15 3.2.3 Thiết bị dụng cụ .15 3.2.3.1 Thiết bị 15 3.2.3.2 Dụng cụ 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Nguyên tắc xác định hàm lượng vitamin E 15 3.3.2 Tối ưu quy trình ly trích vitamin E .16 3.3.3 Tối ưu quy trình phân tích HPLC 17 3.3.4 Dựng đường chuẩn α – tocopherol 18 3.3.5 Xác định hàm lượng vitamin E mẫu 18 3.3.6 Hiệu suất thu hồi quy trình ly trích vitamin E 19 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Xây dựng đường chuẩn α – tocopherol .20 4.2 Kết tối ưu quy trình ly trích mẫu tỏi .21 4.3 Kết tối ưu quy trình phân tích HPLC 23 4.3.1 Ảnh hưởng tốc độ dòng 23 4.3.2 Ảnh hưởng bước sóng 24 4.3.3 Ảnh hưởng pha động 25 4.3.4 Điều kiện sắc ký 26 v 4.4 Khảo sát hàm lượng α – tocopherol loại mẫu 27 4.5 Kết hiệu suấtthu hồi α – tocopherol loại mẫu 30 _Toc363569277Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO .32 vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT FAO: Food and Agriculture Organisation HPLC: High Performance Liquid Chromatography MeOH: Methanol UV: Ultraviolet LC/MS: Liquid Chromatography - Mass Spectrometry GC/MS: Gas chromatography - Mass spectroscopy HPLC – RP: High Performance Liquid Chromatography – Reverse Phase LOD: Limit of detection LOQ: Limit of quantitation ACN: Acetonitrile BHT: Butylated hydroxytoluene vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nhu cầu RRR – α – tocopherol độ tuổi .8 Bảng 2.2 Một số dung môi tính chất chúng .11 Bảng 2.3 Các yếu tố phân biệt pha thường pha đảo .12 Bảng 2.4 So sánh loại đầu dò sử dụng HPLC .13 Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích HPLC 18 Bảng 4.1 Bảng tương quan nồng độ α – tocopherol diện tích peak 20 Bảng 4.2 Bảng kết phân tích hàm lượng α – tocopherol mẫu 27 Bảng 4.3 Bảng hiệu suất thu hồi quy trình trích mẫu .30 viii Phụ lục 2Sắc ký đồ α – tocopherol nồng độ chuẩn 119,1 µg/ml Phụ lục 3Sắc ký đồ ly trích mẫu tỏi điều kiện khơng sục khí nitơ Phụ lục Sắc ký đồ ly trích mẫu tỏi điều kiện có sục khí nitơ Phụ lục 5Sắc ký đồ sục điều kiện sục khí nitơ xà phòng hóa 30 phút, nhiệt độ 800C Phụ lục Sắc ký đồ sục điều kiện sục khí nitơ xà phòng hóa 40 phút, nhiệt độ 800C Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 0,5 ml/phút Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát bước sóng 254 nm Phụ lục Sắc đồ khảo sát dung môi pha động Methanol/nước 30/70 Phụ lục 10 Sắc đồ khảo sát dung môi pha động Methanol/acetonitrile/nước 15:15:70 Phụ lục 11 Sắc đồ khảo sát dung môi pha động Sắc đồ khảo sát dung môi pha động đệm phosphate dung môi hữu Phụ lục 12 Sắc ký đồ mẫu tỏi Trung Quốc Phụ lục 13 Sắc ký đồ mẫu ớt Đà Lạt Phụ lục 14 Sắc ký đồ mẫu dứa Phụ lục 15 Sắc ký đồ mẫu khế Phụ lục 16Sắc ký đồ mẫu rau cần tây ... giá hàm lượng alpha – tocopherol số loại thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng cao áp tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá bổ sung thêm sở liệu hàm lượng alpha – tocopherol số loại rau Việt Nam Tạo... (cho phản ứng với HNO3 FeCl3) phương pháp sắc ký (phương pháp sắc lý lỏng hiệu cao – HPLC) Gần đa số nghiên cứu phân tích vitamin E thực phẩm áp dụng phương pháp phân tích HPLC: nghiên cứu vitamin... nghiên cứu sâu phương pháp phân tích hàm lượng alpha – tocopherol có số loại thực phẩm 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình tách, chiết định lượng α – tocopherol số mẫu thực phẩm (tỏi Trung