BỘ GIÁO DỤC VÀ ÐÀO TẠO TRƯỜNG ÐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM GAN DO VIRUS HBV TẠI BỆNH VIỆN 175 Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN NGỌC NHI Niên khóa : 2009 - 2013 Tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ÐÀO TẠO TRƯỜNG ÐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM GAN DO VIRUS HBV TẠI BỆNH VIỆN 175 Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.BS VŨ BẢO CHÂU NGUYỄN NGỌC NHI CN CHU THỊ THU HÀ Tháng 06/2013   LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Thầy Vũ Bảo Châu Cơ Chu Thị Thu Hà tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, giúp đỡ động viên em suốt trình thực khóa luận Ban chủ nhiệm mơn Cơng Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tất q thầy dạy dỗ truyền đạt kiến thức chuyên môn kinh nghiệm sống cho em suốt năm học tập trường Cố vấn học tập Tô Thị Nhã Trầm luôn đồng hành lớp DH09SH trình học tập suốt năm Con xin gửi lòng biết ơn đến mẹ anh chị gia đình ln ln tạo điều kiện tốt nguồn động viên tinh thần lớn cho suốt năm tháng vừa qua sau Tập thể lớp DH09SH đặc biệt người bạn luôn vượt qua khó khăn suốt thời gian học tập trường Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013 Nguyễn Ngọc Nhi i     TÓM TẮT Viêm gan virus HBV gây bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phổ biển hầu giới Ở nhiều nước Châu Á, Châu Phi, 80% nguyên nhân gây ung thư gan nhiễm virus HBV Hiện nay, giới có khoảng 300 - 350 triệu người mang HBV mạn tính Đồng thời, hàng năm, khoảng triệu người mang HBV mạn tính chết xơ gan, ung thư gan nguyên phát Việc chẩn đoán phát định lượng nồng độ virus HBV máu bệnh nhân có HBsAg dương tính khơng giúp đưa phác đồ điều trị thích hợp cần thiết mà sở cho nghiên cứu dịch tễ virus HBV Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Real-Time PCR để định lượng nồng độ DNAHBV huyết bệnh nhân Đồng thời, thống kê số liệu để khảo sát tình hình nhiễm DNA-HBV bệnh viện 175 qua phân bố bệnh theo độ tuổi giới tính… Kết nghiên cứu 164 mẫu bệnh phẩm phát 98 trường hợp dương tính chiếm tỷ lệ 59,8% Về phân bố độ tuổi : từ 20 - 39 tuổi ≥ 60 tuổi chiếm tỷ lệ 70%, 40 - 59 tuổi chiếm tỷ lệ 60% Tỷ lệ nhiễm DNA-HBV nam nữ (60%) Trong đó, kết định lượng cho thấy số mẫu dương tính nồng độ > 105 copies/ml chiếm tỷ lệ cao 38,4% ii     SUMMARY The title of thesis “Using Real - Time PCR assay to detect hepatitis B virus (HBV) at Hospital 175” Hepatitis is caused by hepatitis B virus (HBV) It is an infectious disease very dangerous and popular in the world There is about 80% of reason caused liver cancer due to HBV in many countries of Asia and Africa Nowadays, in the world, about 300350 millions people are in state of chronic HBV infection Every year, about one million people are dead by cirrhosis, liver cancer Therefore, the diagnosis and quantity of DNA-HBV concentration in serum of the patients who are positive for HBsAg help to predict and treat effectively This is necessary and is the basis for research epidemiology This research applied Real-Time PCR technology to quantity of DNA-HBV concentration in serum of the patients Statistic data help to investigate the state of HBV infection at hospital 175, distribution of disease by age and gender… Having studied 164 patient detected 98 cases to be positive with HBV (59,8 %) For age of distribution, age of 20 - 39 and age of more than 60 years old were 70 %, age of 40-59 years old was 60% The HBV positive rate of males and females were equal (60%) For samples, which had concentration of more 105 copies/ml were the highest (38,4%) Key word: HBV, cirrhosis, liver cancer, quantitation, status of HBV infection iii     MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt .ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt v Danh sách bảng .vii Danh sách hình viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh viêm gan virus HBV 2.1.1 Lịch sử phát bệnh viêm gan siêu vi B 2.1.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan B 2.2 Virus HBV 2.2.1 Cấu trúc virus HBV 2.2.2 Quá trình nhân lên HBV 2.3 Chẩn đoán viêm gan siêu vi B 10 2.3.1 Phương pháp định tính 10 2.3.2 Phương pháp định lượng DNA-HBV 12 2.4 Phương pháp Real-Time PCR 13 2.4.1 Khái niệm 13 2.4.2 Ưu nhược điểm phương pháp Real-Time PCR 16 2.4.3 Một số khái niệm dùng phản ứng Real-Time PCR 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Vật liệu 18 3.2.1 Đối tượng số lượng mẫu 18 iv     3.2.2 Vật liệu hóa chất dùng để tách chiết DNA 18 3.2.3 Hóa chất dùng cho xây dựng đường chuẩn định lượng 18 3.2.4 Vật liệu hóa chất dùng cho phản ứng Real-Time PCR 19 3.2.5 Thiết bị dụng cụ 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nghiên cứu 19 3.3.1 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Phân tích kết Real-Time PCR 25 4.1.1 Mẫu dương tính 25 4.1.2 Mẫu dương tính ngưỡng 29 4.1.3 Mẫu âm tính 29 4.2 Tình hình nhiễm DNA-HBV 175 30 4.2.1 Tình hình nhiễm DNA-HBV 30 4.2.2 Tình hình nhiễm DNA-HBV theo độ tuổi 31 4.2.3 Tình hình nhiễm DNA-HBV theo giới tính 32 4.3 Phân loại nhóm nồng độ DNA-HBV 33 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35  PHỤ LỤC v     DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT cccDNA covalently closed circular DNA Ct Thresold Cycles DNA Deoxyribonucleic Axit HBcAg Hepatitis B core Antigen HBeAg Hepatitis B eliminate Antigen HBsAg Hepatitis B surface Antigen HBcAb Hepatitis B core Antibody HBeAb Hepatitis B eliminate Antibody HBsAb Hepatitis B surface Antibody HBV Hepatitis B Virus IC Internal Control ORFs Open Reading Frames PCR Polymerase Chain Reaction SNP Single Nucleotide Polymorphism Sq Sample quantity WHO World Health Organization vi     DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tình hình nhiễm HBV theo lớp tuổi TP Hồ Chí Minh năm 2000 Bảng 3.1 Thành phần kít tách chiết DNA từ bệnh phẩm 18 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt định lượng HBV cài đặt cho máy Real-Time PCR 22 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm HBV bệnh viện 175 30 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm DNA-HBV theo độ tuổi 32 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm DNA-HBV theo giới tính 32 Bảng 4.4 Phân loại nhóm nồng độ DNA-HBV 33 vii     DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Tình hình bệnh viêm gan B mạn tính giới Hình 2.2 Ba dạng cấu trúc HBV huyết kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Cấu trúc tiểu thể Dane .7 Hình 2.4 Tổ chức gen HBV Hình 2.5 Mơ hình chu trình nhân lên HBV 10  Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động molecular beacon 15  Hình 2.7 Nguyên tắc hoạt động Taqman probe 16 Hình 4.1 Kết chạy Real-Time PCR mẫu dương tính cao dạng linear 26 Hình 4.2 Mối tương quan chu kỳ nồng độ DNA-HBV 26  Hình 4.3 Kết chạy real-time PCR mẫu dương tính phân tích dạng log 27  Hình 4.4 Kết chạy Real-Time PCR mẫu dương tính trung bình dạng linear .27 Hình 4.5 Kết chạy Real-Time PCR mẫu dương tính yếu dạng linear 28 Hình 4.6 Kết chạy Real-Time PCR mẫu dương tính ngưỡng dạng linear .29 Hình 4.7 Kết chạy Real-Time PCR mẫu âm tính dạng linear 30 viii       Hìình 4.3 Kếết chạy y real-time PCR mẫuu dương tínnh phân tícch dạng logg Baaseline: đườ ờng baselinne; 102,104,106; mẫu chuẩn c dương nồn ng độ tương ứnng 102, 104, 106; S: mẫẫu xét nghiệệm; D: mẫu u chứng âm m; trục Ox: biểu diễn số s chhu kỳ; trục Oy: O biểu diễễn tín hiệu hhuỳnh quan ng 4.1.1.2 Mẫu dư ương tính trrung bình Mẫu cchuẩn 106 104 Mẫuu xét nghiệm m 1002 Chứ ứng nội Chứnng âm H Hình 4.4 Kếtt chạy Real-Time R PCR mẫu dương d tính ttrung bình dạng linearr C thông số Các s sttandard có hệ số tương g quan tuyếến tính R2 b 0,996, hiệu suất nhân n bằằng 98,0%, hệ số dốc -3,3224 đạt yêêu cầu có c thể tiến hành h lấy kếết Chứ ứng âm có đường đ biểuu diễn tín hiệu h huỳnh quang khơn ng vượt quua tín 27   hiệu huỳnh h quanng nền, ứng tỏ trình xét ng ghiệm khônng bị ngoạii nhiễm Chhứng nội khhông vượt qua q tín hiệuu huỳnh quaang màu m “HEX” mồi có ó lực caoo với DNA đích nhiềuu nên chhứng nội khhông khuyếch k đạại ứng nội âm m tính màuu “HEX” M xét ng Mẫu ghiệm cho kết k dươ ơng tính chu c kỳ nhiệtt 31,5 Kết dươngg tính nhân với 50, từ tính t hàm lượngg DNA-HB BV ban đầu u 8,46 x 104 q sau nhân với 50 cao hơnn so với x 102 nên mẫu m dương tính copiess/ml Kết trung bình 4.1.1.3 Mẫu dư ương tính yếu y C thơng số standard Các s chho kết hệ số tư ương quan R2 0,,999; hiệu suất s nhân b E 98,0%; độộ dốc -3,324 đđạt yêu cầuu tiến hành lấy l kết quảả Chứng âm m có đường biểu diễn tín t hiệu huỳỳnh quang khơng k vượtt qua tín hiiệu huỳnh quang nền, chứng tỏ q trình xét nghiệm m khơng bị b ngoại nhhiễm Chứng g nội không g vượt qua tín hiệu huuỳnh quangg màuu “HEX” d mồi có lực cao vớ ới DNA đícch nhiều hơ ơn nên chứnng nội khônng khuuyếch đại d chứngg nội âm tínnh màu “H HEX” M chuẩn Mẫu Mẫu xét nghiệm n 106 104 102 Chứng nội n Chứng âm â Hình 4.5 Kết chạy Real Time PCR mẫu dươngg tính yếu dạng d linear M xét ngghiệm cho kết Mẫu k dươ ơng tính chu kỳ nhiiệt 35 Kết dương tính nhân với 50, từ tính t hàm lượngg DNA-HB BV ban đầu u 5,48 x 102 28   copies/ml Kết sau nhân với 50 cao so với x 102 nên mẫu dương tính yếu 4.1.2 Mẫu dương tính ngưỡng Các thơng số standard có hệ số tương quan tuyến tính R2 1,000, hiệu suất nhân 99,6%; độ dốc -3,436 đạt yêu cầu tiến hành lấy kết Chứng âm cho kết âm tính, chứng tỏ trình xét nghiệm khơng bị ngoại nhiễm Chứng nội có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu huỳnh quang chu kỳ 26 mẫu dương tính yếu nên chứng nội khuyếch đại với DNA đích Mẫu xét nghiệm cho kết dương tính sau chu kỳ nhiệt 36 nên cho dương tính ngưỡng nghĩa tín hiệu huỳnh quang mà thiết bị huỳnh quang ghi nhận ngưỡng tín hiệu để có khả định lượng Kết dương tính nhỏ x 102 copies/ml nên định lượng nồng độ mẫu sau chạy phản ứng Real-Time PCR Mẫu chuẩn Chứng nội 106 102 Mẫu xét nghiệm 10 Chứng âm Hình 4.6 Kết chạy Real-Time PCR mẫu dương tính ngưỡng dạng linear 4.1.3 Mẫu âm tính Chứng âm cho kết âm tính, chứng tỏ q trình xét nghiệm khơng bị ngoại nhiễm Chứng nội có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu chứng chu kỳ nhiệt thứ 32 chứng minh mẫu không bị ức chế Mẫu xét nghiệm có đường biểu diễn 29     tín hiệệu huỳnh quang q khơnng vượt quaa tín hiệu huỳnh h quangg n mẫu âm tínnh thật   Mẫuu chuẩn Chứngg nội Mẫu xét nghiệm n 106 10 102 Chứngg âm Hình 4.7 Kết chạy Reall-Time PCR R mẫu âm tính dạng linnear 4.2 Tình T hình nhiễm DNA-HBV tạii 175 4.2.1 Tình hình nhiễm DN NA-HBV Bảng 4.1 Tỷ lệ nhhiễm HBV t bệnh việện 175 Kết Số lượng (n=1644) T Tỷ lệ (%) D Dương tính 98 59,8 Âm tính 66 40,2 T Theo kết qu uả thống kêê có 164 bệệnh nhân có HBsAg ddương tính thực Real-T Time PCR có 98 trườ ờng hợp dư ương tính chiếm tỷ lệ 59,8% Như N thhì có 59,8% % trường hợ ợp bệnh nhân mang viruss thể hoạtt động, siêu u vi thời kỳ nhân đơi g tế bào ký chủ chínnh bệnh b nhân nnày nguồnn lây nhiễm m cao 0,2% trườnng hợp bệnhh nhân mà vvirus tồồn thể cchưa cộng đồng Khoảng 40 ời lành manng bệnh hoặặc tronng tiến trìnnh điều trị v hoàn chỉnh dạng ngườ b khỏi bệnh 30   Theo nghiên cứu Phan Thị Lệ Chi (2012), nghiên cứu 132 mẫu huyết tỷ lệ dương tính Bệnh viện đa khoa Tây Ninh 75% Kết tương đối giống đối tượng bệnh nhân giống nhau, bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng nhiễm HBV chưa biết rõ thời gian nguyên nhân nhiễm bệnh Theo nghiên cứu Nguyễn Đình Ứng ctv (2011), nghiên cứu 150 mẫu huyết địa bàn tỉnh Vĩnh Phúc đối tượng nhân viên y tế, người dân, đối tượng nghiện chích gái mại dâm tỷ lệ nhiễm DNA-HBV 7,4 % Kết thấp nhiều so với nghiên cứu này, khác biệt do: đối tượng nghiên cứu khác Trong nghiên cứu đối tượng nghiên cứu bệnh nhân có HBsAg (+) bệnh viện 175 Còn nghiên cứu Nguyễn Đình Ứng ctv, đối tượng nghiên cứu nhân viên y tế, người dân, đối tượng nghiện chích gái mại dâm địa bàn tỉnh Vĩnh Phúc, đối tượng chưa xét nghiệm HBsAg nên tỷ lệ nhiễm DNA-HBV nghiên cứu thấp nhiều so với nghiên cứu bệnh viện 175 Mặt khác, nhân viên y tế, đối tượng nghiện chích/gái mại dâm thuộc nhóm nguy nhiễm DNA-HBV cao, mà tỷ lệ dương tính lại thấp cỡ mẫu nhỏ mẫu không đặc trưng Ý nghĩa mặt dịch tễ học: Việt Nam nước mà kinh tế gặp nhiều khó khăn, mức sống người dân thấp, việc tiêm phòng vaccine ngăn ngừa nhiễm HBV phòng chống lây nhiễm chưa phổ biến, tỷ lệ dương tính nước ta cao, bệnh diễn tiến âm thầm, nguy lây lan cộng đồng lớn, cần mở rộng chương trình tiêm chủng vaccine ngăn chặn nguy nhiễm HBV 4.2.2 Tình hình nhiễm DNA-HBV theo độ tuổi Kết thống kê cho thấy độ tuổi nhiễm DNA-HBV từ 20 - 39 ≥ 60 cao (gần 70%) Điều do: Việt Nam nằm vùng lưu hành dịch cao, bệnh diễn tiến âm thầm khơng có dấu hiệu đặc trưng đến giai đoạn trưởng thành bệnh diễn tiến nặng chuyển sang giai đoạn mãn tính nên tỷ lệ nhiễm DNA-HBV độ tuổi trưởng thành cao, 60% Theo nghiên cứu thực phòng tiêm chủng vaccine trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh trình bày bảng 2.1, khảo sát 9.078 đối tượng từ tuổi trở lên cho thấy tỷ lệ mang HBsAg tăng dần theo lứa tuổi, tỷ lệ nhiễm HBsAg cao độ tuổi 31     trưởng thành giảm dần sau 60 tuổi Trong đó, theo nghiên cứu tỷ lệ nhiễm DNA-HBV lại cao sau 60 tuổi (70%) Sự khác cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ, số lượng bệnh nhân 60 tuổi đến xét nghiệm (9/13) Bệnh nhân đến khám điều trị bệnh viện 175 chủ yếu người trưởng thành, độ tuổi không đa dạng Trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh nên số liệu thu thập chưa phản ánh xác phân bố nhiễm DNA-HBV từ lứa tuổi nhỏ đến tuổi trưởng thành Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm DNA-HBV theo độ tuổi Nhóm tuổi Số lượng Tổng Tỷ lệ (%) 20 - 39 52 76 68,4 40 - 59 43 75 57,3 ≥ 60 13 69,2 P = 0,462 4.2.3 Tình hình nhiễm DNA-HBV theo giới tính Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm DNA-HBV theo giới tính Giới tính Số lượng Tổng Tỷ lệ (%) Nam 76 127 59,8 Nữ 22 37 59,5 P = 0,594 Theo nghiên cứu này, tỷ lệ nhiễm DNA-HBV nam nữ (gần 60%), nhiên khác biệt ý ngĩa mặt thống kê ( p > 0,05 ) Một số nghiên cứu nước cho tỷ lệ nam nhiễm DNA-HBV cao nữ Điều nam giới thường sử dụng chất bia, rượu làm suy giảm chức gan Ngồi ra, HIV viêm gan B có đường lây nhiễm giống mà tỷ lệ nam nhiễm HIV cao nữ việc sử dụng bơm kim tiêm chung nhóm nghiện chích ma túy nên khả lây nhiễm cho cao Do cấu bệnh nhân bệnh viện 175 chủ yếu nam, nam nhiều nữ gấp lần (127/37) mà tỷ lệ nhiễm lại gần (gần 60%), điều nhận thấy tỷ lệ nhiễm DNA-HBV 32     nam nữ Nhiều nghiên cứu cho giới tính khơng ảnh hưởng đến tỷ nhiễm HBV Do cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ nên số liệu thu thập chưa phản ánh tỷ lệ nhiêm DNA-HBV theo giới tính bệnh viện 175 4.3 Phân loại nhóm nồng độ DNA-HBV Bảng 4.4 Phân loại nhóm nồng độ DNA-HBV Nồng độ DNA-HBV Số lượng Tỷ lệ (%) < 102 27 27,3 102 – 103 5,0 103 – 105 28 28,3 > 105 38 38,4 Nồng độ DNA-HBV giúp phản ánh tình trạng nhân đôi siêu vi tiêu cần thiết để áp dụng phương pháp điều trị, theo dõi hiệu điều trị kháng virus thông qua biến đổi nồng độ virus huyết DNA-HBV (+) huyết điểm cho diện virus, kèm theo transaminase tăng, HBsAg (+) Thông thường bệnh nhân định điều trị tải lượng virus đạt 105 copies/ml Khi tải lượng virus < 103 copies/ml bệnh nhân cần theo dõi điều trị có thay đổi bất thường nồng độ DNA-HBV tăng, men gan tăng, hình ảnh tổn thương gan sinh thiết Trong kết nghiên cứu này, số bệnh nhân có có nồng độ DNA-HBV > 105 copies/ml chiếm tỷ lệ cao (38,4%) 33     Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  5.1 Kết luận Quy trình chẩn đoán viêm gan virus HBV kỹ thuật Real-Time PCR thực 164 mẫu bệnh phẩm có xét nghiệm HBsAg (+) phát 98 trường hợp mang virus HBV máu chiếm tỷ lệ 59,8% Trong khơng có khác biệt tỷ lệ dương tính độ tuổi giới tính Phân loại nhóm nồng độ DNA-HBV sau: < 102 copies/ml chiếm tỷ lệ 27,3%; 102 - 103 copies/ml chiếm tỷ lệ 5,0%; 103 - 105 copies/ml chiếm tỳ lệ 28,3 %; > 105 copies/ml chiếm tỷ lệ 38,4 % 5.2 Kiến nghị Khảo sát với cỡ mẫu lớn Mở rộng phạm vi nghiên cứu tính kháng thuốc, genotype virus HBV 34     TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Hữu Hoàng Đinh Dạ Lý Hương 2000 Phần 3: Dịch tễ học viêm gan siêu vi B Viêm gan siêu vi B từ cấu trúc siêu vi đến điều trị Bộ môn nội, Trường Đại học Y Dược TP.HCM, trang 39-51 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2008 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục, trang 128-130,196-197 Nguyễn Đức Trúc 2004 Định lượng HBV (Hepatitis B Virus) kỹ thuật Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction) Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM Phạm Hùng Vân 2009 PCR Real-Time PCR - Các vấn đề áp dụng thường gặp.Nhà xuất y học, TP.HCM, trang 34-58 Phan Thị Lệ Chi 2012 Ứng dụng kỹ thuật Real-Time PCR để xác định kiểu gen, lượng virus máu đặc điểm kháng thuốc điều trị virus viêm gan B người bệnh bệnh viện Tây Ninh Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TP.HCM Vũ Bằng Đình 2009 Chương 17: viêm gan virus B Bệnh học gan mật tụy Hà Văn Mạo Vũ Bằng Đình Nhà xuất Y học, Hà Nội, trang 280-293 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Alter MJ 2003 Epidemilogy of Hepatitis B in Europe and Worldwide Jounal of hepatology, 39: 64-69 Baesley R.P 1988 Hepatitis B immunization strategies WHO, EPI, 5: 4-26 Garson JA., Grant PR, Ayliffe U., and Tedder RS 2005 Real-Time PCR quantitation of hepatitis B virus DNA using automated sample preparation and murine cytomegalovirus internal control Journal of Virological Methods, 126: 207-213 Ganem, P., and A.M Prince 2004 Hepatitis B virus infection – natural history and clininal consequences N.Engl J Med, 350: 1128-1129 J Mahoney, F 1999 Update on Diagnose, Management, and Prevent of Hepatitis B Virus Infection Clinical Microbiology Review, 12: 351-356 Lee, W.M 1997 Hepatitis B virus infection N EnglJ Med, 337: 1733-1745 Maynard J.E 1990 Hepatitis B: global importance and need for control International conference on prospects for eradication of hepatitis B virus Vaccine, 8:18-20 Suzuki K 1994 Viral hepatitis in Japan Viral hepatitis and liver disease Spinger Verlag, pp.426-428 Seeger, Co and W.S.Mason 2000 Hepatitis B virus biology Microbiol Mol Biol Rev, 64: 51-68 TÀI LIỆU INTERNET 10 Nguyễn Đình Ứng ctv Khảo sát tình trạng nhiễm Virut Viêm gan B số đối tượng địa bàn tỉnh Vĩnh Phúc 2011 http://hocvienquany.vn/tapchiyduoc/DATA 35     TÀI LIỆU WEB 11 http://www.impe-qn.org.vn/impeqn 12   http://www.virology.uct.ac.za/teachhepatitis.html 13   http://www.hon.ch/Library/Theme/HepB/hbvirus.GIF 14   http://www.drthuthuy.com/reseach/HBVGenotype.html 15   http://mgl.snu.ac.kr/images/HBV%20life%20cycle.jpg 36     PHỤ LỤC Bảng Kết Real-Time PCR 164 bệnh nhân STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36   Mã bệnh nhân 1712B6 1812B9 2412B6 2412B7 2712B2 2712B3 0701B8 0701B9 0701B10 1001B9HD 1401B9HD 1701B9HD 3101B5HD 0301B12 0301B13 0301B14 0301B15 0301B16 0701B5 0701B6 0701B7 0701B13 1001B5 1001B6 1001B7 1001B8 1001B10 1001B11 1001B12 1001B13 1001B14 1001B15 1401B7 1401B8 1401B10 1401B11 Tuổi 28 37 60 50 49 55 57 19 59 54 50 24 34 50 67 30 36 26 32 64 29 31 23 37 40 26 46 42 32 48 26 Giới tính Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Hàm lượng virus (copies/ml) 8,25 x 103 Âm tính 9,36 x 106 Âm tính Âm tính 1,93 x 104 Âm tính Âm tính Âm tính 1,6 x 104 Âm tính Âm tính 4,18 x 105 1,38 x 105 Âm tính 1,67 x 103 < x 102 Âm tính Âm tính < x 102 Âm tính x 103 Âm tính < x 102 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính 1,35 x 108 Âm tính 8,68 x 103 Âm tính < x 102 < x 102 1,61 x 104 < x 102   Bảng Kết Real-Time PCR 164 bệnh nhân (tt) STT 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76   Mã bệnh nhân 1401B12 1701B10 1701B11 1701B12 1701B13 1701B14 1701B15 2101B6 2101B7 2101B8 2401B7 2401B8 2401B9 2401B10 2401B11 2401B12 2401B13 2401B14 2401B15 2401B16 2401B17 2701B7 2701B8 2701B9 2701B10 3101B6 3101B7 0402B6HD 2502B8HD 0402B5 0402B7 0402B8 0402B9 0402B10 0702B4 0702B6 2102B5 2102B6 2102B7 2102B8 Tuổi 20 51 42 44 22 60 54 53 55 20 34 37 49 30 33 43 44 50 57 22 41 26 40 41 54 67 29 39 37 34 77 51 40 34 65 58 44 54 Giới tính Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Hàm lượng virus (copies/ml) 1,27 x 107 < x 102 1,44 x 105 < x 102 7,71 x 107 Âm tính Âm tính < x 102 Âm tính Âm tính 3,36 x 103 8,64 x 103 8,77 x 104 Âm tính 2,69 x 107 Âm tính Âm tính 1,58 x 103 Âm tính 3,03 x 106 9,12 x 107 < x 102 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính 7,73 x 106 1,63 x 106 < x 102 6,89 x 103 Âm tính 8,42 x 107 6,8 x 106 3,02 x 107 < x 102 < x 102 Âm tính Âm tính 1,63 x 105 7,52 x 102   Bảng Kết Real-Time PCR 164 bệnh nhân (tt) STT 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116   Mã bệnh nhân 2102B9 2102B10 2502B7 2502B8HD 2802B5 0703B11HD 0703B12 1403B14HD 1803B4 2103B14 2103B17 2503B15HD 2503B16HD 2803B14 0403B3 0703B8 0703B9 0703B10 1103B4 1103B5 1103B6 1403B10 1403B11 1403B12 1403B13 1803B3 1803B5 1803B6 1803B7 1803B8 1803B9 1403B12 1403B19 2103B9 2103B10 2103B11 2103B12 2103B13 2103B15 2103B16 Tuổi 38 59 33 29 41 Giới tính 29 54 45 30 55 50 30 60 27 45 75 21 41 37 60 47 38 54 26 50 39 52 31 17 76 Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ 27 Nam 40 31 25 53 Hàm lượng virus (copies/ml) 1,73 x 108 Âm tính < x 102 Âm tính Âm tính Âm tính 3,35 x 104 Âm tính < x 102 3,05 x 106 < x 102 Âm tính Âm tính < x 102 < x 102 106 < x102 Âm tính < x 102 Âm tính < x 102 9,3 x 107 6,75 x 102 9,79 x 106 2,9 x 105 Âm tính 1,28 x 105 Âm tính 8,46 x 104 Âm tính < x 102 6,9 x 104 1,18 x 104 5,48 x 102 Âm tính Âm tính 8,43 x 107 3,42 x 105 Âm tính 2,05 x 107   Bảng Kết Real-Time PCR 164 bệnh nhân (tt) STT 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156   Mã bệnh nhân 2503B11 2503B12 2503B13 2503B15 2503B17 2803B11 2803B12 2803B13 2803B15 2803B16 2803B17 0104B7HD 0404B10HD 1104B20HD 1504B9HD 1804B8HD 2504B6HD 2504B7HD 0104B8 0104B9 0104B10 0404B11 0404B12 0404B13 0804B10 1104B12 1104B13 1104B14 1104B15 1104B16 1104B17 1104B18 1104B21 1504B7 1504B8 1504B11 1804B7 1804B9 1804B10 1804B11 Tuổi 25 26 23 53 32 21 43 26 57 31 53 41 31 24 61 46 42 50 50 48 53 28 48 50 43 53 37 24 43 50 49 30 33 35 53 32 48 32 Giới tính Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Hàm lượng virus (copies/ml) Âm tính < x 102 x 104 Âm tính Âm tính x 108 2,13 x 108 2, 05 x 104 Âm tính 2,42 x 106 7,3 x 103 3,77 x 103 2,95 x 103 < x 102 3, 67 x 103 3,44 x 108 2,89 x 103 Âm tính 6,86 x 104 2,09 x 107 2,53 x 103 Âm tính 1,59 x 107 1,46 x 108 4,08 x 104 Âm tính 1,19 x 106 < x 102 Âm tính Âm tính < x 102 Âm tính Âm tính 3,04 x 107 5,42 x 105 4,2 x 103 Âm tính 1,23 x 108 1,09 x 103 Âm tính   Bảng Kết Real-Time PCR 164 bệnh nhân (tt) STT 157 158 159 160 161 162 163 164 Mã bệnh nhân Tuổi 37 31 52 29 21 59 46 52 2204B3 2204B4 2204B5 2204B6 2504B8 2504B9 2504B10 2504B11 Hàm lượng virus (copies/ml) < x 102 6,65 x 102 Âm tính Âm tính 1,16 x 106 Âm tính 4,05 x 104 6,45 x 104 Giới tính Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Bảng Bảng ANOVA tỷ lệ nhiễm DNA-HBV theo độ tuổi số liệu bảng 4.2 Source of  Variation  SS  Between  Groups  600  Within Groups  3633,333  Total  df  4233,333  MS  F  P‐value  F crit  600 908,3333 0,66055 0,461969 7,708647              Bảng Bảng ANOVA tỷ lệ nhiễm DNA-HBV theo giới tính số liệu bảng 4.3 Source of Variation  Between Groups  Within Groups  SS  1089 5508 Total  6597           df     MS  F  P‐value  F crit  1089 0,395425 0,593706  18,51282  2754          ... CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM GAN DO VIRUS HBV TẠI BỆNH VIỆN 175 Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.BS VŨ BẢO CHÂU... Giới thiệu bệnh viêm gan virus HBV 2.1.1 Lịch sử phát bệnh viêm gan siêu vi B 2.1.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan B 2.2 Virus HBV 2.2.1 Cấu trúc virus HBV ... tễ virus HBV Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Real-Time PCR để định lượng nồng độ DNAHBV huyết bệnh nhân Đồng thời, thống kê số liệu để khảo sát tình hình nhiễm DNA -HBV bệnh viện 175 qua phân bố bệnh