BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL TRONG CÂY BẠC HÀ (Mentha arvensis L.) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : LƯƠNG THIỆN KHÁNH Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 06/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL TRONG CÂY BẠC HÀ (Mentha arvensis L.) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS TRẦN THỊ LỆ MINH LƯƠNG THIỆN KHÁNH KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM Tháng 06/2013 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Nhà Trường Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh tồn thể q thầy cô chân thành giảng dạy truyền đạt kiến thức bổ ích suốt năm học trường Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Lệ Minh, Tô Thị Nhã Trầm người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi truyền đạt kiến thức quý báu cho để thực tốt việc nghiên cứu đề tài khóa luận Chân thành cảm ơn đến chị Đỗ Ngọc Thanh Mai, Bùi Thị Hồng Gấm Nguyễn Thị Thúy Kiều giúp đỡ tận tình tơi gặp khó khăn việc thực khóa luận tốt nghiệp Xin gửi lời cảm ơn đến bạn tôi, tập thể lớp DH09SH ủng hộ, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Cuối xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân gia đình bên cạnh, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập trưởng thành Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013 Lương Thiện Khánh iii TÓM TẮT Hiện nhu cầu sử dụng tinh dầu bạc hà ngày gia tăng, song lượng tinh dầu tự nhiên chưa đủ đáp ứng, dẫn đến việc sản xuất tổng hợp tinh dầu phương pháp hóa học điều phần ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Nguyên nhân xuất phát từ việc thiếu hụt nguồn cung cấp giống Chính thế, u cầu đặt phải xây dựng quy trình sản xuất giống bạc hà để cung ứng cho thị trường số lượng giống tốt có hiệu kinh tế Do đó, việc xây dựng quy trình nhân giống in vitro sản xuất giống bạc hà, khơng đảm bảo khả thích nghi cao trồng đồng ruộng mà tăng hàm lượng tinh dầu, menthol mang lại hiệu kinh tế cao cho nhà sản xuất cần thiết Trong đề tài, tiến hành thử nghiệm nhân giống bạc hà gồm vào mẫu, tạo callus, tái sinh chồi tạo rễ ba điều kiện nuôi cấy: ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C; ánh sáng đèn neon, nhiệt độ phòng 29 ± 50C; ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C Sau giai đoạn nhân giống in vitro tiến hành thử nghiệm trồng bạc hà đồng ruộng ly trích tinh dầu, đánh giá hàm lượng menthol Kết đạt sau tiến hành thí nghiệm cho thấy giai đoạn vào mẫu, tạo callus tái sinh chồi cho kết tốt bạc hà nuôi cấy điều kiện sử dụng ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C Giai đoạn tạo rễ, tái sinh hoàn chỉnh điều kiện ni cấy tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C tốt Cây bạc hà nuôi cấy điều kiện tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C có sinh trưởng phát triển tốt so với bạc hà nuôi cấy hai điều kiện phòng lạnh phòng nóng Hàm lượng tinh dầu (4,36%) menthol (73,32%) bạc hà nuôi cấy điều kiện tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C cho kết cao iv SUMMARY The thesis " Surveying the effects of in vitro propagation conditions on the growth, development and content of oil, menthol in peppermint (Metha arvensis L.)” Currently, while demand for using oleum menthae is increasing, the amount of natural oils is not enough to respond So the oil is synthesised by chemically, this affects the health of consumers The main reason is the supply of seedling deficiency Therefore, construction a process to product peppermint seedlings is essential to provide market the number of quality seeds and economic efficiency So development a mint cseedlings in vitro propagated process, not only highly adaptive when growing in the field but also increased concentrations of synthetic oil and menthol, bring high economic efficiency for producers is necessary The research focussed on: testing on the sample of mint, creating callus, regenerating shoot and rooting of three culture conditions: neon light, temperature 26 ± 20C and neon light, room temperature 29 ± 50C and natural light, temperature 28 ± 60C After a period of in vitro propagation, mint is planted on the field, extracted oil, evaluated menthol content The result showed that neon lights, temperature 26 ± 200C is optimal condition to creating callus, regenerating shoot Optimal temperature for Rooting phase, complete regeneration is 28 ± 600C on natural culture conditions Mint was grown in natural conditions with temperature 28 ± 600C, had the growth and development of better than peppermint was cultured in two conditions cold rooms and heat room Mint was grown in natural conditions, temperature 28 ± 600C had the best results with oil content (4.36%) and menthol (73.32%) Keywords: propagation condition, mint, menthol v MỤC LỤC Lời cảm ơn iii Tóm tắt iii Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách hình xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bạc hà châu Á (bạc hà Á) 2.1.1 Phân loại bạc hà 2.1.2 Đặc điểm hình thái bạc hà Á 2.1.3 Đặc điểm sinh vật học bạc hà 2.1.3.1 Các thời kì sinh trưởng bạc hà 2.1.3.2 Điều kiện sinh thái 2.1.4 Kỹ thuật trồng, chăm sóc thu hoạch bạc hà 2.1.4.1 Kỹ thuật trồng bạc hà 2.1.4.2 Chăm sóc bạc hà 2.1.4.3 Thu hoạch bạc hà 2.2 Tinh dầu bạc hà 2.2.1 Giới thiệu tinh dầu bạc hà 2.2.2 Công dụng tinh dầu bạc hà 2.2.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ tinh dầu 2.3 Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1Nhân giống vơ tính in vitro 2.3.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1.2 Ý nghĩa ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô 2.3.2 Một số phương pháp nhân giống vơ tính in vitro vi 2.3.3 Quá trình thực nhân giống vơ tính in vitro 2.3.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy nhân giống in vitr 10 2.3.4.1 Cường độ chất lượng ánh sáng 10 2.3.4.2 Sự thống khí nồng độ khí CO2 O2 lên sinh trưởng phát triển cấy mô 12 2.3.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển cấy mô 15 2.3.4.4 Sự tương tác nhiệt độ ánh sáng 15 2.3.4.5 Độ ẩm tương đối bình ni cấy 16 2.3.4.6 Thành phần thể tích mơi trường nuôi cấy 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Thời gian địa điểm làm đề tài 18 3.2 Vật liệu nghiên cứu 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Tạo bạc hà in vitro 18 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến hình thành callus   18 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến tái sinh chồi từ callus 19 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy giai tạo rễ 19 3.3.5 Khảo sát sinh trưởng phát triển bạc hà ex vivo 19 3.3.6 Đánh giá hàm lượng tinh dầu từ bạc hà điều kiện nuôi cấy 20 3.3.7 Đánh giá hàm lượng menthol phương pháp đo OD 21 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Tạo bạc hà in vitro 22 4.2 Ảnh hưởng điều kiện ni cấy đến hình thành callus 23 4.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến tái sinh chồi từ callus 25 4.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy giai đoạn tạo rễ 27 4.5 Trồng thử nghiệm bạc hà in vitro 28 4.5.1 Thuần hóa ngồi vườn ươm 28 4.5.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển bạc hà in vitro trồng đồng ruộng 28 4.6 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng tinh dầu, menthol bạc hà 33 4.6.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng tinh dầu 33 vii 4.6.2 Xác định hàm lượng menthol phương pháp đo OD 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 Tài liệu tham khảo 37 Phụ lục viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA : Analysis Of Variance BA : Benzyladenine CTV : Cộng tác viên Kn : Kinetin LED : Light Emitting Diode MS : Murashige - Skoog NAA : Naphthylacetic acid NPR : Net Photosynthetic Rate NT : Nghiệm thức PPF : Photosynthetic Photon Flux ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Kết mẫu bạc hà sau tuần tái sinh mẫu 22 Bảng 4.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả hình thành callus 24 Bảng 4.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả tái sinh chồi 26 Bảng 4.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy giai đoạn tạo rễ 27 Bảng 4.5 Tỉ lệ sống, chiều cao bạc hà giai đoạn vườn ươm 29 Bảng 4.6 Kết thống kê chiều cao, số cành, trọng lượng tươi 30 Bảng 4.7 Hàm lượng tinh dầu trọng lượng khô bạc hà 33 Bảng 4.8 Hàm lượng menthol có tinh dầu 34 Bảng 4.9 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến suất bạc hà 35 x 17 Nguyễn Mỹ Uyên Đỗ Đăng Giáp 2007 Khảo sát tăng trưởng in vitro khoai lang Ipomoea batatas L điều kiện ánh sáng tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành Công nghệ Sinh học, Viện sinh học nhiệt đới Tài liệu nước 18 Blazkovas, A., J Ullmann, Z Josefusová, and I Machácková 1989 The influence of gaseous phase on growth of plants in vitro - The effect of different types of stoppers Acta Hortic 251: 209 - 214 19 Bula, R.J., Merrow, T.W., Tibbitts, T.W., Barta, D.J., Ignatius, R.W and Martin, T.S 1991 Light-emitting diodes as a radiation source for plants HortScience 26: 203 - 205 20 Cournac L., Dimon B., Carrier P., Lohou A and Chagvardieff P 1992 Growth and photosynthetic characteristics of Solanum Tuberosum plantlets cultivated in vitro in different conditions of aeration, sucrose supply, and CO2 enrichment Plant Physiology 97: 112 - 117 21 Debergh and Maene 1977 Acta Hortic 78: 449 - 454 22 De Proft., M P., J.L Mean and P.C Debergh 1985 Carbon dioxide and ethylene evolution in the cuture atmosphere of magnolia cuture in vitro Physiol Plant 65: 375 - 379 23 Dillen, W., Buysens, S 1989 A simple technique to overcome vitrification in Gypsophila paniculata L Plant Cell Tiss Org Cult 19: 181 - 183 24 Economou, A.S and P.E Read 1987 Light treatments to improve efficiency of in vitro propagation systems HortScience 22:751 - 753 25 Figucira, A., Janick, J and BeMiller, J N 1994 Partrial cacao pop and stem gums Carbohydrate Polymers 24: 133 - 138 26 Forney, C.F., Brandl, D.G 1992 Control of humidity in small controlledenvironment chambers using glycerol-water solutions HortTechnology 2: 52 54 27 Fujiwara, K., T Kozai, and I Watanabe 1988 Development of a photoautotrophic tissue culture system for shoots and/or plantlets at rooting and acclimatization stages Acta Hort 23: 153 - 158 28 Hakkaart, F.A and Versluijs 1983 Some factors affecting glassiness in carnation meristem tip cultures Plant Path 89: 47 - 50 29 Hart, J.W 1988 Light and Plant Growth In: Topics in Plant Physiololgy 1: 34 - 50 30 Hunter, R.H.F., R.A.S Lawson and L.E.A Rowson 1983 Maturation, transplantation and fertilization of ovarian oocytes in cattle Reprod Fertil pp 30: 325 31 Iwanami, Y., T Kozai, Y Kitaya and S Kino 1992 Effects of supplemental red and far-red lighting using light emitting diodes on stem elongation and growth of potato plantlets in vitro (Abstr.) International Symposium Transplant production Systems, Yokohama, Japan 183 32 Kalpana Sengar, RS Sengar and Sanjay Kumar Garg 2011 Developing an efficient protocol through tissue culture technique for sugarcane micropropagation Tissue culture lab, college of biotechnology, sardar vallabh bhai patel University of agriculture and technology, meerut 250: - 10 33 Kozai 1991 Photoautotrophic micropropagation in vitro Cell developing Biotechnology Plant 27: 47 - 51 38 34 Kozai, T., K Sekimoto 1988 Effects of the number of air changes per hour of the closed vessel and the photosynthetic photon flux on the carbon dioxide concentration inside the vessel and the growth of strawberry plantlets in vitro Environ Control Biotechnology 26: 21 - 29 35 Lawrence, B 2006 The genus Mentha Pp 576 36 Lentini, Z., Mussel, H., Mutschler, M.A., Earle, E.D 1988 Ethylene generation and reversal of ethylene effects during development in vitro of rapid-cycling Brassica campestris L Plant Science 54: 75 - 81 37 Moe, R., N Glomsrud, I Bratberg, and S Valso 1991 Control of height in poinsettia by temperature drop and graphical tracking Acta Hort 327: 41 - 38 Morini, S., Sciutti, R., Fortuna 1987 invitro growth response of Prunus cerasifera shoot as in influenceced by difference light - dark cycles and sucrose concentrations 28: 245 - 248 39 Murashige 1977 Plant cell and organ culture as horticultural practices Acta Hortic 78: 17 - 30 40 Nhut, D.T., Anh Hong, L.T., Watanabe, H., Goi, M and Tanaka, M 2002 Growth of banana plantlets cultured in vitro under red and blue light - emitting diode (LED) irradiation source Acta Hort 575: 117 - 124 41 Ohki, K., J.P Zehr, P.G Falkowski, and Y Fujita 1991 Regulation of nitrogen-fixation by different nitrogen sources in the marine non heterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp NIBB1067 Arch Microbiol 156: 335 42 Savithri Bhat, Gupta S K., Tuli R., Khanuja S., Sharma, Bagchi G D., Anil Kumar and Sushil Kumar, 2001 Photoregulation of adventitious and axllary shoot proliferation in menthol mint, Menthal arvensis L Current science 80: 798 - 881 43 Seibert M, Wetherbee PJ, Job DD The effects of light intensity and spectral quality on growth and shoot initiation in tobacco callus Plant Physiol 1975 Jul 56: 130 - 139 44 Shimada, N., Tanaka, F., Kozai, T 1988 Effects of low concentration on net photosynthesis of C3 plantlets in vitro Acta Hortic 230: 171 - 175 45 Smith,J.J., John, P 1992 Activation of 1‐aminocyclopropane‐1‐carboxylate oxidase by bicarbonate carbon‐dioxide Phytochemistry 32: 1381 - 1386 46 Tanaka, M 1991 Disposable film culture vessels.212 - 228 47 Tanaka, T., N Ishida, M Ishimatsu, G Nonaka and I Nishioka 1992 Six new complex tannins, guajavins, psidins and psiguavin from the bark of Psidium guajava L Chem Pharm Bull 40: 2092 - 2093 48 Wardle, K., E.B Dobbs, and K.L Short 1983 in vitro acclimatization of aseptically cultured plantlets to humidity Amer Soc Hort Sci 108: 386 - 389 49 Watanabe, T and Raff, M 1992 Diffusible rod-promoting signals in the developing rat retina 899 50 Yae, B.W., Zimmerman R.H., Fordham, I and Ko K.C 1987 Influence of photoperiod, apical meristem, and explant orientation on axillary shoot proliferation of apple cultivars in vitro Journal of the American Society for Horticultural Science 112: 588 - 592 51 Zeltich I 1975 Pathways of carbon fixation in green plants Annu Rev Biochem 44: 123 - 145 39 52 Ziv M 1991 Quality of micropropagated plants - vitrification in vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 27: 64 - 69 Tài liệu internet 53.http://duocvanxuan.com.vn/diep-ha-chau-van-xuan/60-phuong-thuoc-tu-caybac-ha.html 54.http://www.bachkhoatrithuc.vn/encyclopedia/4667-02633929271076601250/Cac-loai-duoc-thao-chinh-yeu/Ho-Hoa-Moi -cay-bacha-cay-Mentha-x-piperita-Lamiaceae.htm 55.http://www.nsl.hcmus.edu.vn/greenstone/collect/thesiskh/index/assoc/HASH01 32/c28a7f05.dir/4.PDF 40 PHỤ LỤC Thí nghiệm tái sinh mẫu 1.1 Kết mẫu đạt sau tuần tái sinh Bảng Tỷ lệ mẫu đạt sau tuần vào mẫu Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu đạt (%) Điều kiện nuôi cấy Lần lặp lại1 Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 52 56 61 Phòng nóng 48 56 44 Tự nhiên 38 44 56 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 189.556 94.778 1.930 0.2254 Within 294.667 49.111 -Total 484.222 Least Significant Difference Test LSD value = 14.00 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 56.33 A Mean = 56.33 A Mean = 55.00 A Mean = 55.00 A Mean = 46.00 A Mean = 46.00 A 1.2 Kết mẫu sống sau tuần tái sinh Bảng Tỷ lệ mẫu sống tuần vào mẫu Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Tỷ lệ mẫu sống (%) Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 71,4 70 72,7 Phòng nóng 69,2 70 63,3 Tự nhiên 50 56 55,5 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 509.147 254.573 29.042 0.0008 Within 52.593 8.766 Total 561.740 Least Significant Difference Test LSD value = 5.915 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 71.37 A Mean = 71.37 A Mean = 67.50 A Mean = 67.50 A Mean = 58.33 B Mean = 58.33 B Kết khối lượng mô sẹo sau 30 ngày Bảng Khối lượng mô sẹo sau 30 ngày Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Khối lượng callus (g) Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 0,709 0,745 0,731 Phòng nóng 0,435 0,426 0,503 Tự nhiên 0,587 0,588 0,607 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 0.112 0.056 75.619 0.0001 Within 0.004 0.001 -Total 0.117 Least Significant Difference Test LSD value = 0.06318 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 0.7300 0.4600 0.5900 A Mean Mean Mean C B = = = 0.7300 0.5900 0.4600 A B C Thí nghiệm tái sinh chồi từ mơ sẹo thân 3.1 Tỷ lệ mô sẹo tạo chồi Bảng Tỷ lệ mô sẹo tao chồi Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Tỷ lệ mô sẹo tạo chồi (%) Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 96,3 100 100 Phòng nóng 51,19 55,6 59,26 Tự nhiên 29,63 33,33 37,04 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 6922.801 3461.400 345.505 0.0000 Within 60.110 10.018 -Total 6982.911 Least Significant Difference Test LSD value = 6.324 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 100.0 55.35 33.33 A B C Mean Mean Mean = = = 100.0 55.35 33.33 A B C 3.2 Số chồi tái sinh từ mô sẹo Bảng Số chồi/mô sẹo Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Số chồi/mô sẹo Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 19,56 21,23 20,83 Phòng nóng 7,75 8,02 8,05 Tự nhiên 3,67 4,56 4,25 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 435.747 217.874 600.589 0.0000 Within 2.177 0.363 -Total 437.924 Least Significant Difference Test LSD value = 1.204 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 20.54 7.940 4.300 A B C Mean Mean Mean = = = 20.54 7.940 4.300 A B C 3.3 Chiều cao chồi Bảng Chiều cao chồi Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Chiều cao chồi (cm) Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 2,34 2,14 2,19 Phòng nóng 4,24 4,1 4,16 Tự nhiên 3,56 3,89 3,65 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 7.587 3.794 348.399 0.0000 Within 0.065 0.011 Total 7.653 Least Significant Difference Test LSD value = 0.2095 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 2.200 4.170 3.670 C A B Mean Mean Mean = = = 4.170 3.670 2.200 A B C Thí nghiệm tạo rễ 4.1 Số rễ chồi Bảng Số rễ/chồi Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Số rễ/chồi Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 6,2 7,3 Phòng nóng 8,4 11,5 Tự nhiên 15,8 16,1 16,4 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 143.796 71.898 65.693 0.0001 Within 6.567 1.094 Total 150.362 Least Significant Difference Test LSD value = 2.090 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 6.500 9.630 16.10 C B A Mean Mean Mean = = = 16.10 9.630 6.500 A B C 4.2 Chiều dài rễ Bảng Chiều dài rễ Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Chiều dài rễ Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 3,5 3,2 3,7 Phòng nóng 4,4 4,5 Tự nhiên 5,2 5,6 4,7 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 4.536 2.268 18.387 0.0028 Within 0.740 0.123 -Total 5.276 Least Significant Difference Test LSD value = 0.7007 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 3.470 4.630 5.170 B A A Mean Mean Mean = = = 5.170 4.630 3.470 A A B Chiều cao giai đoạn vườn ươm Bảng Chiều cao giai đoạn vườn ươm Nghiệm thức Điều kiện tự Chiều cao giai đoạn vườn ươm (cm) nhiên Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 10,5 9,5 11 Phòng nóng 9,7 11,3 10,6 Tự nhiên 12,1 11,2 12,5 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 0.669 0.334 2.389 0.1725 Within 0.840 0.140 -Total 1.509 Least Significant Difference Test LSD value = 0.7475 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 10.57 10.87 11.23 A A A Mean Mean Mean = = = 11.23 10.87 10.57 A A A Thí nghiệm khảo sát sinh trưởng, phát triển bạc hà 6.1 Chiều cao sau 20 ngày trồng Bảng 10 Chiều cao sau 20 ngày trồng Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Chiều cao sau 20 ngày trồng (cm) Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 7,83 7 Phòng nóng 8,5 8,17 10 Tự nhiên 9,67 10,33 11,2 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 14.546 7.273 12.311 0.0075 Within 3.544 0.591 -Total 18.090 Least Significant Difference Test LSD value = 1.536 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 7.280 8.890 10.39 B A A Mean Mean Mean = = = 10.39 8.890 7.280 A A B 6.2 Số cành sau 20 ngày trồng Bảng 11 Số cành sau 20 ngày trồng Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Số cành sau 20 ngày trồng Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 5,33 3,67 4,67 Phòng nóng 4,67 6,33 Tự nhiên 6,67 7.67 8,87 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 15.629 7.815 8.734 0.0167 Within 5.368 0.895 -Total 20.998 Least Significant Difference Test LSD value = 1.890 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 4.560 5.670 7.740 B B A Mean Mean Mean = = = 7.740 5.670 4.560 A B B 6.3 Chiều cao sau 40 ngày trồng Bảng 12 Chiều cao sa 40 ngày trồng Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Chiều cao sau 40 ngày trồng Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 15,83 15,47 14,87 Phòng nóng 17,83 17,9 18,2 Tự nhiên 24,53 25,21 23,76 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 132.237 66.118 247.903 0.0000 Within 1.600 0.267 -Total 133.837 Least Significant Difference Test LSD value = 1.032 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 15.39 17.98 24.50 C B A Mean Mean Mean = = = 24.50 17.98 15.39 A B C 6.4 Số cành sau 40 ngày trồng Bảng 13 Số cành sau 40 ngày trồng Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Số cành sau 40 ngày trồng Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 8,33 8,67 8,67 Phòng nóng 8,67 8,65 Tự nhiên 12,67 13 13,33 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 37.652 18.826 303.739 0.0000 Within 0.372 0.062 -Total 38.024 Least Significant Difference Test LSD value = 0.4975 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 8.560 8.770 13.00 B B A Mean Mean Mean = = = 13.00 8.770 8.560 A B B 6.55 Chiều cao sau 60 ngày trồng Bảng 14 Chiều cao sau 60 ngày trồng Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Chiều cao sau 60 ngày trồng (cm) Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 40,33 41 42,33 Phòng nóng 43,33 44 43,83 Tự nhiên 46 44.87 46,67 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 14.749 7.375 2.055 0.2091 Within 21.535 3.589 -Total 36.284 Least Significant Difference Test LSD value = 3.785 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 41.32 43.72 44.63 A A A Mean Mean Mean = = = 44.63 43.72 41.32 A A A 6.6 Số cành sau 60 ngày Bảng 15 Số cành sau 60 ngày trồng Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Số cành sau 60 ngày trồng Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 8,67 8,33 8,67 Phòng nóng 9,65 8,67 8,68 Tự nhiên 13,35 14,67 14 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 52.440 26.220 82.616 0.0001 Within 1.587 0.317 -Total 54.027 Least Significant Difference Test LSD value = 1.125 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 8.500 9.000 14.07 B B A Mean Mean Mean = = = 14.07 9.000 8.500 A B B 6.7 Trọng lượng tươi g/cây sau 60 ngày trồng Bảng 16 Trọng lượng tươi g/cây sau 60 ngày trồng Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Trọng lượng tươi g/cây sau 60 ngày trồng (g) Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 101 96 96,7 Phòng nóng 108,7 96,6 95 Tự nhiên 128 132 135,7 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 2216.169 1108.084 40.341 0.0003 Within 164.807 27.468 -Total 2380.976 Tukey's Honestly Significant Difference Test Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 97.90 100.1 132.2 B B A Mean Mean Mean = = = 132.2 100.1 97.90 A B B 6.8 Trọng lượng khô g/cây sau 60 ngày trồng Bảng 17 Trọng lượng khô g/cây sau 60 ngày trồng Nghiệm thức Điều kiện nuôi Trọng lượng khô g/cây sau 60 ngày trồng (g) cấy Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 11,43 13,06 11,73 Phòng nóng 13,93 12,5 12,93 Tự nhiên 17,5 17 16,8 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 40.598 20.299 45.952 0.0002 Within 2.650 0.442 -Total 43.249 Least Significant Difference Test LSD value = 1.328 at alpha = 0.050 Original Order Mean Mean Mean = = = 12.07 13.12 17.01 Ranked Order B B A Mean Mean Mean = = = 17.01 13.12 12.07 A B B 6.9 Hàm lượng tinh dầu 100 g Bạc hà khô Bảng 18 Hàm lượng tinh dầu 100 g Bạc hà khô Nghiệm thức Điều kiện nuôi Hàm lượng tinh dầu 100 g Bạc hà khô (g) cấy Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 2,59 2,76 2,67 Phòng nóng 3,47 3,27 3,29 Tự nhiên 4,27 4,12 4,53 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 4.327 2.164 104.582 0.0000 Within 0.124 0.021 -Total 4.451 Least Significant Difference Test LSD value = 0.2895 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 2.670 3.340 4.360 C B A Mean Mean Mean = = = 4.360 3.340 2.670 A B C 6.10 Hàm lượng menthol có tinh dầu Bảng 19 Hàm lượng menthol có tinh dầu Nghiệm thức Điều kiện ni Hàm lượng menthol có tinh dầu (%) cấy Lần lặp lại Lần lặp lại Lần lặp lại Phòng lạnh 44,06 47,5 48,36 Phòng nóng 62,13 68,16 63,86 Tự nhiên 76,76 73,32 70,74 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1132.999 566.500 70.991 0.0001 Within 47.879 7.980 -Total 1180.878 Least Significant Difference Test LSD value = 5.644 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean = = = 46.60 64.70 73.60 C B A Mean Mean Mean = = = 73.60 64.70 46.60 A B C ... đến sinh trưởng, phát triển hàm lượng tinh dầu, menthol bạc hà  Đưa quy trình nhân giống bạc hà có hiệu kinh tế cao 1.3 Nội dung Thực nhân giống in vitro bạc hà tiến hành khảo sát khả sinh trưởng,. .. 28 4.5.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển bạc hà in vitro trồng đồng ruộng 28 4.6 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng tinh dầu, menthol bạc hà ... triển hàm lượng tinh dầu, menthol bạc hà (Metha arvensis L.) thực nhằm đưa quy trình nhân giống bạc hà có hiệu kinh tế cao 1.2 Yêu cầu đề tài  Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nhân giống in vitro đến