BỘ GIÁO DỤC VÀ đÀO TẠO TRƯỜNG đẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH đỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO HẠT NANO TỪ CHITOSAN, ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT VÀ THỬ đỘC TÍNH TRÊN SÂU KHOANG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn : CN đỗ Thị Tuyến Sinh viên thực MSSV: 1151110313 : Võ Phùng Tuyết Thanh Lớp: 11DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN xin gửi lời cảm ơn chân thành đến q thầy, khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường tận tình dạy truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập trường đại học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh hành trang q giá giúp tơi bước vào đời hòa nhập tốt vào xã hội Và tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến đỗ Thị Tuyến – người tận tình hướng dẫn tơi q trình làm thí nghiệm viết ñồ án đồng thời chân thành cảm ơn ñến ban lãnh ñạo Viện Sinh học Nhiệt ñới ñã tạo điều kiện để tơi thực tốt ñược ñồ án, ủng hộ ñộng viên bạn bè gia đình q trình thực ñồ án TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 08 năm 2015 Võ Phùng Tuyết Thanh LỜI CAM đOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Võ Phùng Tuyết Thanh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời cam ñoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng, sơ ñồ ñồ thị Danh mục hình Mở đầu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tài liệu chitosan nano chitosan 1.1.1 Chitosan 1.1.2 Nano chitosan 1.2 Tổng quan dầu neem 13 1.2.1 Nguồn nguyên vật liệu 13 1.2.2 Phương pháp tách chiết dầu neem 13 1.2.3 Các nhóm hoạt chất dầu neem 13 1.2.4 Cơ chế tác động azadirachtin lên trùng 15 1.2.5 Mối tương quan hoạt tính cấu trúc 18 1.2.6 Một số nghiên cứu tạo công thức thuốc BVTV từ hạt neem 18 1.2.7 Một số ứng dụng neem 21 1.2.8 Tình hình nghiên cứu neem Việt Nam 23 1.3 Sơ lược vi nhũ tương 25 1.3.1 Giới thiệu 25 1.3.2 Các loại cấu trúc vi nhũ tương 25 1.3.3 Ưu nhược ñiểm sản phẩm vi nhũ tương 26 1.3.4 Thành phần vi nhũ tương 27 1.4 Sơ lược sâu khoang 28 1.4.1 Giới thiệu 28 1.4.2 đặc ñiểm hình thái – sinh học 28 1.4.3 Biện pháp phòng chống 31 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 32 2.2 Vật liệu 32 2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 32 2.2.2 Hóa chất thí nghiệm 32 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Phương pháp tách chiết, tinh xác ñịnh hàm lượng hoạt chất từ nhân hạt neem 34 2.3.2 Tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem (CN) phương pháp vi nhũ tương 34 2.3.3 Xác định tính chất hóa lý chế phẩm 38 2.3.4 đánh giá hoạt lực chế phẩm 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chiết tách, tinh sạch, xác ñịnh hàm lượng azadiractin 43 3.1.1 Chiết tách, tinh 43 3.1.2 Xác ñịnh ñộ tinh phổ HPLC 46 3.1.3 Xác định hàm lượng Azadirachtin tổng có dầu Neem 47 3.2 Tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem 51 3.2.1 Tạo nguyên liệu dạng dung dịch giàu azadirachtin 51 3.2.2 Kết tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem (CN) 53 Đồ án tốt nghiệp 3.3 Kết xác định tính chất hóa lý chế phẩm 59 3.3.1 Kết ño tỉ trọng ñộ nhớt 59 3.3.2 đánh giá ñộ bền nhũ tương 60 3.3.3 Kết ñánh giá ñộ tạo bọt 60 3.4 Kết ñánh giá hiệu lực chế phẩm lên sâu khoang 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 DANH MỤC BẢNG VIẾT TĂT AZRL (Azadirachtin related limonoid) Hoạt chất Azadirachtin nhóm limonoid Bt Vi khuẩn Bacillus thuringensis DMSO Dimethyl –sulfoxide HPLC (High Performance Liquid Sắc ký lỏng cao áp Chromatography) EtOAc Ethyl acetat JH (Juvenile hormon) Hóc môn trẻ LD50 Liều gây chết 50% MIC (Minimum inhibition concentration) Nồng độ ức chế tối thiểu PHHT Hóc mơn ñốt ngực trước TCN Tiêu chuẩn ngành TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam UV – Vis Quang phổ tử ngoại khả kiến Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG, SƠ đỒ VÀ đỒ THỊ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 3.1 3.2 3.3 3.4 Nội dung Hàm lượng ba hoạt chất dầu bánh dầu Neem Một số sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật từ dầu Neem Một số sản phẩm thương mại dùng y học Thành phần chất dựng ñường chuẩn Azadirachtin Thành phần chất pha ñể ño mẫu Khảo sát nồng ñộ Chitosan hòa tan acid acetic Khảo sát thời gian khuấy chế phẩm CN Khảo sát nồng ñộ dầu Neem Bố trí thí nghiệm Hỗn hợp dung mơi rửa giải mẫu qua cột Kết ñánh giá ñộ bền nhũ tương Số lượng sâu chết trung bình qua ngày Hiệu lực gây chết sâu khoang chế phẩm CN Trang 15 22 23 36 37 39 40 40 44 47 60 61 62 DANH MỤC SƠ đỒ Sơ ñồ 1.1 1.2 1.3 3.1 3.2 Nội dung Tác ñộng kiềm hãm trực tiếp lên hệ nội tiết côn trùng Azadirachtin Vai trò tham gia sản phẩm quản lý dịch hại tổng hợp Thành phần Neem Quy trình tách, tinh hoạt chất Azadirachtin Quy trình thu nhận dịch chiết cồn giàu Azadirachtin từ nhân hạt Neem Trang 17 19 21 49 53 DANH MỤC đỒ THỊ đồ thị 3.1 Nội dung đường chuẩn Azadirachtin Trang 48 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 Nội dung Công thức phân tử Chitosan Các nhóm chức Chitin, Chitosan Cellulose Sơ đồ tạo hạt nano Chitosan phương pháp khâu mạch nhũ tương Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan phương pháp giọt tụ/ kết tủa Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan phương pháp hợp giọt nhũ tương Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan phương pháp tạo gel ion Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan phương pháp mixen ñảo Cấu trúc phân tử Azadirachtin“A” Cấu trúc phân tử Azadirachtin“D” Cấu trúc phân tử Nimbin Sơ đồ hình thành nhũ tương ñơn lớp ña lớp Phương pháp tạo vi nhũ tương Sâu khoang (Spodoptera litura ) Vòng ñời sâu khoang Phương pháp nghiên cứu ñề ñể tạo chế phẩm CN Sâu ni để làm nguồn tiến hành thử nghiệm Kén sâu Ngài sâu Xác ñịnh ñộ tinh Azadirachtin HPLC Hệ thống máy UV – Vis Agilent Phần mềm ño quang phổ UV-Visible Nghiệm thức C-0,5 % Nghiệm thức C-1,0 % Nghiệm thức C-1,5 % Nghiệm thức C-2,0 % Chế phẩm CN khuấy 120’, 90’, 60’, 30’ñể yên sau 24h độ tự nhũ nghiệm thức 30’ độ tự nhũ nghiệm thức 60’ độ tự nhũ nghiệm thức 90’ độ tự nhũ nghiệm thức 120’ Chitosan 2% khuấy 120’ nồng ñộ dầu Neem ñể yên sau 24h độ tự nhũ nghiệm thức Neem 15% độ tự nhũ nghiệm thức Neem 20% độ tự nhũ nghiệm thức Neem 25% độ tự nhũ nghiệm thức Neem 30% độ tự nhũ nghiệm thức Neem 35% Chế phẩm CN kính hiển vi Máy đo độ nhớt Trang 9 10 11 11 14 14 15 26 27 28 29 38 43 43 44 50 51 51 54 54 54 54 55 56 56 56 56 57 57 57 58 58 58 59 60 Đồ án tốt nghiêp nghiệp 3.21 3.22 3.23 3.24 Kết ño ñộ nhớt Chế phẩm tự nhũ hoàn toàn nước Các khay ñựng sâu Khay ñựng sâu 61 61 63 64 Hình 3.16 độ tự nhũ nghiệm thức Neem 25% Hình 3.17 độ tự nhũ nghiệm thức Neem 30% Hình 3.18 độ tự nhũ nghiệm thức Neem 35% Kết thí nghiệm cho thấy, tăng nồng ñộ dầu Neem từ 15 ñến 30% khả tụ nhũ tăng dần, phân tán ñều nước, nồng độ dầu Neem lên đến 35% kiểm tra độ tự nhũ cho thấy có lớp chế phẩm mỏng tụ lại phía bề mặt điều lượng dầu Neem đưa vào vượt hấp thụ Chitosan dẫn ñến hạt tạo thành không bền vững Kết khảo sát cho thấy nồng ñộ dầu Neem chiếm 30% tốt ñể tạo thành chế phẩm CN Qua ba thí nghiệm khảo sát nồng ñộ Chitosan, dầu Neem thời gian khuấy sản phẩm thu cơng thức để tạo chế phẩm gồm 5% Oleic acid, 15% Tween 80 30% dầu Neem, 2% Chitosan dung dịch acid acetic 1% ñược thêm vào ñể ñủ 100% (v/v) Các hạt phân bố ñồng ñều dung dịch quan sát kính hiển vi (hình 3.19) Hình 3.19 Chế phẩm CN kính hiển vi 3.3 Kết xác định tính chất hóa lý chế phẩm 3.3.1 Kết đo tỉ trọng ñộ nhớt Chế phẩm vi nhũ tương CN tạo thành có dạng lỏng, màu trắng sữa, kết xác định chế phẩm có tỉ trọng d20 = 0,9193 g/ml (theo 10TCN 499- 2002), ñộ nhớt chế phẩm = 111 centipose Hình 3.20 Máy đo độ nhớt Hình 3.21 Kết đo độ nhớt 60 3.3.2 đánh giá ñộ bền nhũ tương Bảng 3.2 Kết ñánh giá ñộ bền nhũ tương Chỉ tiêu độ tự nhũ ban đầu CN TCVN 8383 - 2010 Hồn tồn Hồn tồn độ bền nhũ tương Thể tích lớp kem sau 0,5 Thể tích lớp kem sau độ tái nhũ sau 24 độ bền nhũ tương cuối ml ml ml ml Hoàn toàn ml Hoàn toàn ml Khảo sát cho thấy chế phẩm CN tạo nhũ ñều ñặn, dung dịch màu trắng sữa, khơng tạo cặn lắng (Hình 3.22), tiêu ñộ tự nhũ, ñộ tái nhũ, ñộ bền nhũ tương ñều phù hợp với TCVN 8383 – 2010 61 3.3.3 Kết ñánh giá ñộ tạo bọt Thể tích bọt tạo thành sau phút ml, kết phù hợp với TCVN 8383 – 2010 60 ml Hình 3.22 Chế phẩm tự nhũ hồn tồn nước 3.4 Kết đánh giá hiệu lực chế phẩm lên sâu khoang Tiến hành thí nghiệm mục 2.3.4, kết thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Số lượng sâu chết trung bình qua ngày Nghiệm thức Nồng ñộ Azadirachtin (ppm) Số sâu chết (con) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày đC 0,00 0,00 0,00 0,00 0,67 1,67 0,00 CN 6.6 6,60 0,67 1,00 0,33 2,67 7,67 4,67 CN 8.25 8,25 0,00 0,00 3,00 4,67 9,67 2,00 CN 9.9 CN 11.55 CN 13.2 9,90 0,00 0,00 3,33 8,33 10,00 6,00 11,55 0,00 3,33 6,67 7,70 5,67 4,33 13,20 2,33 4,00 3,67 10,33 5,33 6,67 Bảng 3.6 Hiệu lực gây chết sâu khoang chế phẩm CN Nghiệm thức Nồng ñộ Azadirachtin (ppm) đC 0,00 CN 6.6 CN 8.25 CN 9.9 6,60 8,25 9,90 Hiệu lực (% ± SD) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 0,00a 0,00b 0,00b 0,00d 0,00d 0,00d 1,67a 4,17b 5,00ab 10,23cd 26,47c 38,83c ± 2,89 ± 3,82 ± 4,33 ± 6,86 ± 9,27 ± 12,13 ab cd bc 0,00 a 0,00 a 0,00 a 0,00 0,00 b b ab CN 11,55 11.55 CN 13.2 13,20 7,50 17,73 34,77 ± 6,61 ± 6,43 ± 4,04 ab bc ab 8,33 ± 8,78 a 27,97 51,37 ± 2,63 ± 3,52 41.40 ab 54,03 ab 45,07 bc ± 6,57 67,33 a ± 8,23 65,50 ab 8,33 25,00 ± 6,29 ± 13.23 ± 13,40 ± 10,35 ± 4,35 5,83a 15,83a 25,00a 49,97a 61,97a 79,63a ± 5,20 ± 2,89 ± 2,5 ± 9,96 ± 8,30 ±8,60 Chú thích: Trong cột, giá trị có ký tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê Sự khác biệt nghiệm thức có ý nghĩa mức p < 0,01 Các số liệu ñược thể dạng số trung bình ± SD Dựa vào số liệu bảng 3.6 xác ñịnh ñược giá trị gây chết 50% chế phẩm CN ñối với sâu khoang Spodoptera litura Fabr Sau ngày LC50=8,19 ppm Qua số liệu hai bảng 3.5 3.6, nhận thấy nồng ñộ Azadirachtin tăng hiệu lực diệt sâu tăng Tuy nhiên, kết hiệu lực gây chết nồng ñộ Azadirachtin 11,55 ppm thấp so với hiệu lực gây chết nồng ñộ 9,9 ppm chênh lệch nồng độ khơng đáng kể khơng có khác biệt mặt thống kê điều xảy quần thể sâu sức sống cá thể khác có xảy ăn thịt ñồng loại nghiệm thức Hiệu lực gây chết cao nồng ñộ 13,2 ppm, nhiên khơng có khác biệt mặt thống kê so với nồng ñộ 9,9 ppm 11,55 ppm Do ñó nồng ñộ Azadirachtin 9,9 ppm hiệu mặt kinh tế ý nghĩa phòng trừ sâu khoang Hình 3.23 Các khay đựng sâu Hình 3.24 Khay ñựng sâu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận xây dựng quy trình tạo ngun liệu dạng dung dịch từ hạt Neem chứa hoạt chất Azadirachtin ñể làm nguyên liệu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật Tạo thành công hạt Nano Chitosan ứng dụng xây dựng ñược quy trình sản xuất thuốc trừ sâu nhân hạt Neem đạt tiêu hóa lý theo tiêu chuẩn Việt Nam có thành phần gồm 5% Oleic acid, 15% Tween 80 30% dầu Neem, 2% Chitosan dung dịch acid acetic 1% ñược thêm vào ñể ñủ 100% (v/v) Kết thử nghiệm thuốc phòng thí nghiệm cho thấy chế phẩm CN có hiệu diệt sâu đạt hiệu kinh tế có ý nghĩa phòng trừ sâu khoang nồng ñộ 9,9 ppm đề nghị Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện sản phẩm Khuyến khích sản xuất ña dạng sản phẩm thuốc trừ sâu từ Nano Chitosan dầu Neem phục vụ cho vùng rau hoa màu chuyên canh, tạo nguồn thực phẩm sạch, an toàn cho người thân thiện với môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng Việt Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chính (2000), Cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật, NXBNN, Hà Nội, tr – 69 Nguyễn Văn đàn, Nguyễn Việt Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, Nhà xuất Y học, tr 90 – 91 Ngô Văn đát, Nguyễn Bách Tuấn, Nguyễn Lý (2005), “Nghiên cứu trích ly chiết xuất hoạt chất azdirachtin từ hạt xoan Ấn độ Neem gia công thành chế phẩm Vineem 1.500EC”, Hội thảo – Các biện pháp sinh học phòng chống sâu bệnh hại cât trồng nông nghiệp, Bộ NN&PTNT, Viện Bảo vệ Thực vật, đà Lạt, tr.248 – 249 Lâm Công định (1985), Xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) – Một loài thích ứng với vùng nóng hạn Thuận Hải, Tạp chí Lâm nghiệp Lâm Cơng định (1991), Giới thiệu xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) nhập nội vào vùng cát nóng hạn Phan Thiết – Tuy Phong, Sở Nông – Lâm nghiệp Thuận Hải Nguyễn Công Hào, Phan Phước Hiền ctv (1998), “Công nghệ chế tạo chế phẩm từ thuốc cá Derris elliptica Benth, Tuyền tập cơng trình nghiên cứu năm năm 1993 – 1998, Viện Sinh học nhiệt ñới, Trung tâm KHTN&CNQG, Viện Sinh học nhiệt ñới, tr -43 Trần Quang Hùng (1999), Thuốc bảo vệ thực vật, NXBNN, Hà Nội, tr 1-63 Võ Văn Kim 2005, “Nghiên cứu ứng dụng thành phần neem làm thuốc bảo vệ thực vậtt” , Hội thảo – Các biện pháp sinh học phòng chống bệnh hại trồng nông nghiệp, Bộ NN&PTNT, Viện Bảo vệ Thực vật, đà Lạt, tr 250 – 252 Trần đình Phả (1999), Nghiên cứu công nghệ nuôi nhân hàm hoạt số lồi trùng họ ngài đêm, cánh vy (Lepidotera: Noctuidae) thức ăn nhân tạo phòng thí nghiệm, Chun đề tốt nghiệp tiến sĩ nơng nghiệp, Viện KH & KTNN Việt Nam, Hà Nội 10 Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Kim Linh, Thái Xuân Du, Akiko Hirano (1999-2000), “Bước ñầu khảo sát ảnh hưởng dầu neem lên phát triển bọ hà (Cylas formicarius f.) Trên ruộng trồng khoai lang (Ipomoea batatas L.)”, Tuyển tập Công trình nghiên cứu Khoa học Cơng nghệ, Viện Sinh học nhiệt ñới, tr 137 – 140 11 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Tiến Thắng, Akiko Hiran (1999-2000), “Bước ñầu khảo sát ảnh hưởng dầu neem lên phát triển bọ hà trưởng thành (Cylas formicarius f.) Trên ruộng trồng khoai lang (Ipomoea batatas L.)”, Tuyển tập Cơng trình nghiên cứu Khoa học Cơng nghệ, Viện Sinh học nhiệt ñới, tr.141 – 147 12 Tiêu chuẩn Việt Nam (2010), Thuốc bảo vệ thực vật chứa hoạt chất Azadirachtin – yêu cầu kỹ thuật phương pháp thử TCVN 8383: 2010 13 Dương Tuấn Anh ctv (2002), “Azadirachtin – hoạt chất gây ngán ăn mạnh ñối với sâu khoang ñược phân lập từ hạt neem (Azadirachta indica họ Meliaceae) di thực vào Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hóa Hữu tồn quốc lần thứ 2, tr 333 – 336 Phần Tiếng Anh 14 Ae-Jin Choi et al (2011), “Characterization of Capsaicin-Loaded Nanoemulsions Stabilized with Alginate and Chitosan by Self-assembly” Food Bioprocess Technol (2011) 4, pp.1119–1126 15 Agnihotri S.A (2004), “Recent advances on chitosan-base micro and nanoparticles in drug delivery” J Control Release, 2004 Nov 5; 100 (1): – 28 16 Andrew P Javis, Morgan E D., Edwards C (1999), “Rapid separation of triterpenoids from neem seed extracts”, Phytochem Anal., 10, pp 39 - 43 17 Benge M D (1989), “Cultivation and propagation of the neem tree”, Claredon Press, Oxford, UK 18 Biswas Kausik, Chattopadhyay Ishita,Banerjee R K And Bondyopadhyay Uday (2002), “Biological activities and medecinal properties of neem (Azadirachta indica)”, Current Science, Vol.82, No.11 19 Brook W M et al (1996), “The extation and determination of azadirachtin from oil and insects by supercritical fluid extraction”, J Testing Eval., 24,pp 149-153 20 CIBA – GEIGY (1992), Manual for field trials plant protection, CIBA – GEIGY limited, Basle, Swizerland, pp 36-37 21 Dreyer M (1983), “Effects of aqueous neem extracts and neem oil on tha main pests of curcubita pepo in togo”, Natural pesticides from the neem tree h (Azadirachta indica A.Juss) and the other tropical plants, Proc 2t Int Neem Conf., Rauischholzhausen, pp.435 - 443 22 Eileen A Buss and Sydney G.Park- Brow (2002),” Natural products for insec pests management”, Extention Servive, Institude of Food and Argicultural Sciences, University of Florida, Christine Taylor Waddill, Dean 23 Govindachari T R Et al (1995), “Structure-related insect antifeedant and growth- activities of some limonoids”, J Chem Ecol., 21, pp.1585-1600 24 Isman M B (1997), “ Neem and other botanical insecticides: barriers to commercialization”, Phytoparasitica, 25, pp 339-344 25 Jitendra Kumar and Balraj S Parmar (1999), “ Stabilization of azadirachtin A in neem formulations: effect of some solid carriers, neem oil and stabiliziers”, J Agric Food Chem., 47,pp 1735-1739 26 Khan M and Wassilew S M (1987), “ The effect of raw material from the neem tree, neem oil and neem extracts on fungi pathogenic to human” In: Schmutterer, H., Ascher, K.R.S (eds) Natural pesticides from neem tree (Azadirachta indica A Juss) and other tropical plants , Proceedings of the Third International Neem Conference, Nairobi, Kenya, pp 645 – 650 27 Koul O (1996), “Mode of action of azadirachtin in insects”, in: NEEM, (eds) N.S Randhawa, B.S Parmar, New age International (p) limited, publishers, New Delhi, pp 160 – 166 28 Kumar A R V Et al (2003), “Azadirachtin use efficiency in commercial neem formulations”, Current Science, Vol.84, No.11, pp 1459 – 1464 29 Lange W (1983), “Piperonyl butoxide: Synergistic effect on different neem seed extracts and influence on degradation of an endriched extract by ultraviolet light”, Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A th Juss) and other tropical plants, Proc Int Neem Conf., Rauischholzhausen, pp 129 - 140 30 Lauriden E.B , Kanchanaburgura C., Boonsermsuk S (1991), “Neem (Azadirachta indica A Juss) in Thailand”, Forest Genet Resour Inf 19, pp 25 – 33 31 Morgan E D (1981), “Strategy in the isolation of isnect control subtance from plants” In: Schmetterer, H., Ascher, K.R.S (eds) Natural pesticides from the neem tree (Azadiracta indica A.Juss)”, Proceedings of the First International Neem Conference, Rottach- Egern, Germany, pp.43 – 52 32 Parmar B.S and Ketkar C.M (1996), “Comerciallisation”, in: Collection, Processing and Comercial Utilisation of Neem, (eds) Alok Lehri, H.M Behl, D.P Singh, Fragrance & Flavour Development Center, India, pp 318 – 332 33 Randhawa N.S., Parmar B.S (1993), NEEM, New Age International (P) limited, Peblishers, New Dehli , pp 210 – 203 34 Rembold H, Uhl M and Muller T.H (1986), “Effect of Azadiractin a on hormone titers during the gonadotrophic cycle of Locusta moratoria”, Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A Juss) and other plants, th Proc Int Neem Conf., Nairobi pp 289 – 298 35 SaiRam M et al (2000), “Anti-microbial activity of a new vaginal contraceptive NIM-76 from neem oil (Azadirachta indica)” Journal of Ethnopjarmacology, 71, pp 377 – 382 36 Schluter U (1986), “Effect of Azadiractins on developing tissues of various insect larvae” Natural pesticides from the neem tree(Azadirachta indica A th Juss) and other tropical plants, Proc Int Neem Conf., Nairobi, pp 331 348 37 Schneider B.H and Ermel K (1986), “Quantitative determination of Azadirachtin from neem seeds using high performance liquid chromatography”, Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica th A Juss) and other tropical plants, Proc Int Neem Conf., Nairobi, pp 161 - 170 38 Simmonds M.S.J and Blaney W M (1983), “Some neurophysiological effect of Azadiachtin on lepidopterous larvae and their feeding response”, Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A.Juss) and the h other tropical plants, Proc 2t Int Neem Conf., Rauischholzhausen, pp 163 – 180 39 Stefan Schutz et al (1997), “Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for azadirachtins”, J Agric Food Chem., Vol 45, No.6, pp 2363 – 2368 40 Wilps H., Nasseh O and Krall S (1993), “The effects of various neem formulation on mortality rate and motphogenetic defects upon Schistocera gregaria (Forskal) Larvae”, World Neem Conference, India, pp 221 – 236 70 ... hải sản kết hợp với chất có hoạt tính sinh học ñể tạo nên thuốc bảo vệ thực vật thân thiện với mơi trường bước q trình tiến hành đề tài: Tạo hạt Nano từ Chitosan, ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ. .. thuốc bảo vệ thực vật thử độc tính sâu khoang Mục tiêu chuyên ñề tốt nghiệp: Chiết tách, tinh Azadirachtin nhân hạt Neem Tạo hạt Nano từ Chitosan, ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật chứa hoạt... có nhân hạt Neem đánh giá hiệu diệt sâu chế phẩm phòng thí nghiệm Ý nghĩa thực tiễn đề tài: Xây dựng quy trình sản xuất thuốc bảo vệ thực vật mới, góp phần tạo thêm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn