BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực : TRẦN THỊ NHỚ MSSV: 1151110243 Lớp: 11DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung đồ án thực hướng dẫn trực tiếp cô CN Đỗ Thị Tuyến Tôi cam đoan kết nghiên cứu đưa luận án dựa kết thu q trình thực đề tài, hồn tồn trung thực khơng chép kết nghiên cứu tác giả khác Nội dung đồ án có tham khảo sử dụng số thơng tin, tài liệu từ nguồn sách hay cơng trình nghiên cứu khác được trích dẫn rõ ràng liệt kê danh mục tài liệu tham khảo Nếu có vi phạm quy chế hay gian trá tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Sinh viên thực Trần Thị Nhớ Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc Ban Giám Hiệu thầy cô trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trường tận tình truyền đạt kiến thức năm học tập trường tạo điều kiện cho thực tập để tích lũy kinh nghiệm cho cơng việc sau Để hồn thành tốt khóa luận tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô CN Đỗ Thị Tuyến tận tình hướng dẫn, giúp đỡ quan tâm, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới cho phép tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Bên cạnh cố gắng thân, tơi thầm biết ơn ủng hộ, quan tâm động viên gia đình, bạn bè – người thân u ln chỗ dựa vững cho suốt thời gian qua Cuối tơi xin kính chúc q Thầy, Cô dồi sức khỏe thành công nghiệp cao q Đồng kính chúc Cơ, Chú, Anh, Chị Viện Sinh Học Nhiệt Đới dồi sức khỏe, đạt nhiều thành công tốt đẹp công việc Tôi xin chân thành cảm ơn! TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực Trần Thị Nhớ Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt v Danh mục hình vi Danh mục bảng vii Danh mục sơ đồ viii Danh mục đồ thị viii Chương MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 1.4 Phương pháp nghiên cứu .2 1.5 Kết cấu đồ án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát vi khuẩn Bacillus sp .3 2.1.1 Phân loại .3 2.1.2 Đặc điểm chung chi Bacillus .4 2.1.3 Khả tạo bào tử 2.1.4 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp nuôi trồng thủy sản 2.1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp 2.2 Enzyme protease 2.2.1 Giới thiệu chung protease 2.2.2 Phân loại protease 10 2.2.3 Chức sinh 12 học protease vi sinh vật 2.2.4 Môi trường phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease .13 2.2.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh enzyme protease 15 i Đồ án tốt nghiệp 2.2.6 Ứng dụng protease vi sinh vật 16 2.3 Trùn quế .17 2.3.1 Phân loại đặc điểm trùn quế 17 2.3.2 Đặc tính sinh học trùn quế .18 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.3 Đặc tính sinh lý trùn quế 19 2.3.4 Sự sinh sản phát triển 20 2.3.5 Tác dụng trùn quế 20 2.3.6 Bổ sung Trùn quế BIO – T chăn nuôi .22 2.4 Chế phẩm probiotics 24 2.4.1 Định nghĩa Probiotics 24 2.4.2.Vai trò probiotics chăn ni thủy sản .24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .26 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .26 3.2 Vật liệu, hóa chất dụng cụ nghiên cứu 26 3.2.1 Vật liệu .26 3.2.2 Hóa chất 27 3.2.3 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 28 3.3 Môi trường phân lập, định danh giữ giống 28 3.4 Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1 Sơ đồ tổng quan thí nghiệm .29 3.4.2 Phương pháp phân lập Bacillus sp 30 3.4.2.1 Hoạt hóa giống Bacillus sp 30 3.4.2.2 Phân lập chủng Bacillus sp .30 3.4.2.3 Cấy giữ gống Bacillus sp 30 3.4.2.4 Tăng sinh chủng Bacillus sp 30 3.4.2.5 Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc 31 3.4.3 Phương pháp định danh đặc điểm sinh lý, sinh hóa .31 3.4.3.1 Phương pháp nhuộm Gram 31 3.4.3.2 Test khả di động 33 3.4.3.3 Test catalase 33 3.4.3.4 Thử nghiệm khả sinh Indol 34 3.4.3.5 Thử nghiệm Methyl Red (MR) .35 3.4.3.6 Thử nghiệm khả sử dụng đường 36 ii Đồ án tốt nghiệp 3.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 36 3.4.4.1 Khả kháng khuẩn 36 3.4.4.2 Phương pháp định tính khả sinh enzyme protease 37 3.4.4.3 Phương pháp nuôi cấy môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease .37 3.4.4.4 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease .38 3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cho trùn quế 38 3.4.5.1 Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu 38 3.4.5.2 Phương pháp định lượng khoáng tổng số quang phổ kế .39 3.4.5.3 Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng Nitơ tổng số) .40 3.4.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease phương pháp Anson cải tiến .41 3.4.5.5 Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin 44 3.4.6 Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động chế phẩm protease 45 3.4.6.1 Xác định nhiệt độ tối ưu 45 3.4.6.2 Xác định pH tối ưu 45 3.4.7 Khảo sát chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế 46 3.4.7.1 Khảo sát nồng độ chất 46 3.4.7.2 Khảo sát nồng độ enzyme .47 3.4.7.3 Khảo sát thời gian thủy phân 47 3.4.8 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm 48 3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý số liệu 49 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .50 4.1 Kết phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp .50 4.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp từ chế phẩm Probiotic 50 4.1.2 Nhuộm Gram 52 4.1.3 Kiểm tra đặc tính sinh hóa 52 4.1.3.1 Khả di động 52 4.1.3.2 Khả sinh catalase 53 Đồ án tốt nghiệp 4.1.3.3 Khả sinh indol 54 4.1.3.4 Thử nghiệm methyl red 54 4.1.3.5 Khả lên men loại đường .55 4.2 Đánh giá hoạt tính sinh học 58 4.2.1 Đánh giá khả kháng khuẩn 59 4.2.2 Định tính khả sinh enzyme protease .59 4.3 Xác định thành phần sinh hóa trùn quế 60 4.4 Kết xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme thu từ chế phẩm 61 4.4.1 Kết xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động protease 61 4.4.2 Kết xác định pH tối ưu cho hoạt động protease 62 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên trình thủy phân 63 4.6 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bổ sung vào trình thủy phân 65 4.7 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình thủy phân 67 4.8 Thủy phân trùn quế với điều kiện tối ưu chọn 70 4.9 Quy hoạch thực nghiệm 71 4.10 Đánh giá hiệu sản phẩm .77 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .78 5.1 Kết luận 78 5.2 Kiến nghị .79 TÀI LIỆU THAM KHẢO .80 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT OD Optical density UI Unit International MR Methyl red CFU Colonies Form Unit TCA Trichloroacetic acid EDTA Etilendiamin tetraaxetic axit NL Nguyên liệu CPE Chế phẩm enzyme Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Bacillus sp Hình 2.2 Quá trình tạo bào tử .5 Hình 2.3 Cấu trúc 3D protease Hình 2.4 Trùn quế .18 Hình 2.5 Trùn quế chăn nuôi 22 Hình 3.1 Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập .26 Hình 3.2 Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP HCM 27 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập từ mẫu 50 Hình 4.2 Hình ảnh nhuộm Gram chủng 1, .52 Hình 4.3 Kết thử khả di động chủng 1, 53 Hình 4.4 Kết thử khả tạo catalase chủng 1, 53 Hình 4.5 Kết thử nghiệm khả sinh indol chủng 1, .54 Hình 4.6 kết thử nghiệm methyl red chủng 1, 54 Hình 4.7 Kết thử khả lên men loại đường chủng .55 Hình 4.8 Kết thử khả lên men loại đường chủng .56 Hình 4.9 Kết thử khả lên men loại đường chủng .57 Phụ lục 22 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình thủy phân thịt trùn dùng enzyme thương phẩm ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by THOI GIAN SS Beou tw W itT o 21 45 DM f1 ea 02 26 23 F P 7- -0 Summary Statistics h2 h4 h6 8h 1h 01 21 41 61 82 T0 o C o3 3 3 3 3 3 3 S A St St u9 v3 a 0an 73 65 12 88 22 91 39 73 01 14 13 40 11 46 92 21 14 12 31 44 11 41 74 93 31 54 21 31 44 93 0128.2 12 23 Phụ lục 23 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình thủy phân thịt trùn dùng enzyme thương phẩm Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by THOI GIAN Method: 95.0 percent LSD C MH o o 33e X h2 321 X h4 322 X h6 337 X h8 13 X 1h 346 X 02 341 X 81 21 61 Phụ lục 24 34 344 344 345 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình thủy phân thịt trùn enzyme chếTphẩmThí h % so với ( n đ g g ố 30 , 30 , 30 , 30 16 , 30 16 , 30 16 , 30 19 , 30 18 , 30 19 , 30 21 , 30 21 , 30 21 , 30 26 , 30 26 , 30 23 , 30 27 , 30 28 10 , 30 27 , TBĐC , 2 TBTN Trung bình 3 3 3 3 3 3 3 12 14 16 18 20 Phụ lục 25 9 9 9 1 1 1 9 9 3 3 5 3 3 3 3 3 3 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình thủy phân thịt trùn dùng enzyme chế phẩm ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by THOI GIAN SS Beou tw W itT o 77 92 DM F f1 e - 02 73 23 P -0 Summary Statistics C A St St S 0o ve a 0a 9u h2 54 h4 61 05 h6 92 12 86 h8 21 214 37 h 01 21 41 61 82 T o 3 24 93 23 35 33 22 34 Phụ lục 26 59 78 02 85 92 76 593 37 45 38 99 310 171 99 6182 643 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình thủy phân thịt trùn dùng enzyme chế phẩm Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by THOI GIAN Method: 95.0 percent LSD C MH o o 33e X h2 311 X h4 316 X h6 392 XX 1h 12 X 08 324 X 1h 352 X 22 339 X 01 332 X X 41 332 X 81 333 Phụ lục 27 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm tối ưu hóa thực nghiệm N Thí g % so với t n đ h g ố 28 6 28 2 3 28 TBĐC TBTN Trung bình 7 7 7 7 8 8 8 7 9 3 3 3 8 6 8 9 5 7 5 7 7 8 2 2 4 4 4 5 8 6 9 6 7 4 4 9 9 9 3 9 9 9 9 8 Phụ lục 28 9 2 8 8 9 8 9 9 9 1 1 7 4 2 8 3 3 3 3 3 8 2 3 3 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by YEU TO KHAO SAT SSu Beom tw W 14 itT 52 o DM f1 ea 63 31 45 F P -9 -0 Summary Statistics C S A St St o 7u v2 a an 17 32 3 37 42 1 47 24 55 51 1 67 82 41 85 16 45 77 92 41 98 62 1 13 47 01 28 02 12 11 11 74 91 21 28 22 31 59 38 41 19 03 63 51 19 03 57 61 14 13 02 T7 11 28 565 o 14 Phụ lục 29 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by YEU TO KHAO SAT Method: 95.0 percent LSD C MH N o 1eXo T N 81 X T N 92 X T N 32 X T N 42 X T N 24 X T N 52 X T N 62 X NT 26 X X TN 72 X T N T N T N T N T N T N T N T Phụ lục 30 T hí G G 2 , 2 , 2 , 2 2 Phụ lục 32 m , , , X Kết hàm lượng độ ẩm thịt trùn tươi Phụ lục 31 Thí n g 3 38 03 03 13 48 04 2 4 G 2 2 đ T ộ B 72 , 868 , 80 , Kết hàm lượng khoáng thịt trùn tươi khoáng TS P0 (g) P1 (g) P2 (g) ( % 2 2 2 Kết Nitrogen tổng số protein tổng thịt trùn tươi V % H N TB ( %Pr 10 tổng 101 6 11 TB Phụ lục 33 Hình ảnh thiết bị Hình Nồi hấp khử trùng Hình 17 Máy ly tâm Hình Lò nung Hình 18 Cân phân tích số Hình Hệ thống vơ hóa mẫu Hình Hệ thống chưng cất bán tự động Hình Kính hiển vi Hình Máy lắc Hình Máy đo pH Hình Tủ ấm Hình Bình hút ẩm Hình 10 Cân kỹ thuật Hình 11 Tủ sấy Hình 13 Bể điều nhiệt Hình 15 Máy đo OD Hình 12 Tủ cấy Hình 14 Bếp điện Hình 16 Máy nghiền Phụ lục 34 Hình ảnh thí nghiệm Hình 19 Kết khả kháng vi khuẩn E Coli chủng 1, Hình 20 Kết khả kháng vi khuẩn Salmonella sp chủng 1, Hình 21 Kết khả kháng vi khuẩn S aureus chủng 1, 6 Hình 22 Vòng phân giải chủng 1, sau 48 Hình 23 Mẫu trước sau vơ hóa Hình 28 Mẫu đo hàm lượng acid amin dịch sau thủy phân Hình 24 Thịt trùn quế Hình 26 Chế phẩm Bacillus sp sau lên men Hình 25 Dịch tăng sinh Bacillus sp Hình 27 Ni cấy Bacillus sp mơi trường bán rắn Hình 29 Pha lỗng dịch tăng sinh nước muối sinh lý ... tối ưu cho trình thủy phân trùn quế enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp 1.3 Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng Bacillus sp từ chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy. .. tài Tối ưu hóa q trình thủy phân trùn quế ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp thức ăn chăn nuôi thủy sản 1.2 Mục đích nghiên cứu Chọn lọc chủng Bacillus sp có khả sinh enzyme... sánh khả thủy phân enzyme protease thương phẩm enzyme protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp Tối ưu hóa thực nghiệm trình thủy phân trùn quế 1.4 Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương