ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ THANH HƯƠNG PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC - 8/ 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ THANH HƯƠNG PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Số hóa Trung tâm Học liệu - 8/ 2014 tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2014 Tác giả Trần Thị Thanh Hương Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn - Tác giả Trần Thị Thanh Hương Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ORF: Open read frame ORCAs: Octadecanoid - responsive Catharanthus AP2/ERF domain MIA: Monoterpenoid indole alkaloids DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid TIA: Terpenoid indole alkaloids FDA: Food and Drug Administration JA: Jasmonic acid MeJA: Methyl ester jasmonic acid JRE: Jasmonate responsive element ERF: Ethylene response factor PCR: Polymerase chain reaction Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Những chữ viết tắt iii Mục lục .iv Danh mục bảng luận văn vi Danh mục hình luận văn vii MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 CÂY DỪA CẠN 1.1.1 Giới thiệu chung 1.2 NGHIÊN CỨU ALKALOID Ở THỰC VẬT VÀ Ở CÂY DỪA CẠN .5 1.2.1 Alkaloid thực vật 1.2.1.1 Trạng thái thiên nhiên .5 1.2.1.2 Sự phân bố .5 .6 1.2.2 Alkaloid dừa cạn .8 1.2.2.1 Các vinca alkaloid 1.2.2.2 Một số gen chức liên quan đến trình tổng hợp alkaloid dừa cạn .11 1.2.2.3 A 12 16 1.3.1 ORCA3 16 1.3.1.1 Con đường sinh tổng hợp TIA 17 1.3.1.2 Cơ chế điều khiển ORCA3 19 Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ 1.3.1.3 Cấu trúc protein ORCA3 .21 22 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 27 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.2 Hóa chất thiết bị 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 27 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 27 2.2.2.1 Phương pháp tách chiết mRNA 27 28 2.2.2.3 Phương pháp nhân gen ORCA3 kĩ thuật RT-PCR .28 2.2.2.4 Kĩ thuật tách dòng gen 29 31 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32 DỪA ÊN 32 ORCA3 .32 3.1.2 Kết nhân đoạn gen ORCA3 từ mRNA 33 3.1.3 Kết tách dòng đoạn gen ORCA3 .34 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 Hình 3.3 Hình 3.3 cho thấy, trình tự đoạn gen ORCA3 251249 10 vị trí nucleotide: 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 601 sai khác với trình tự có mã số EU072424 vị trí nucleotide: 601 (bảng 3.2) Bảng 3.2 Bảng tổng hợp vị trí nucleotide khác đoạn gen ORCA3 Vị trí Nucleotide 564 565 566 567 568 569 570 571 572 601 AJ251249 T T C T T C T T C A EU072424 - - - - - - - - - A TN - - - - - - - - - G Bảng 3.2 cho thấy, giống dừa cạn TN1 Thái Nguyên có vùng từ nucleotide số 564 đến nucleotide số 572 (9 nucleotide) bị khuyết so với trình tự có mã số AJ251249 (trình tự dùng để thiết kế mồi), nhiên vùng khuyết lại giống với trình tự có mã số EU07 , có hồng giống dừa cạn TN1 Thái Nguyên màu hoa đoạn gen ORCA3 mang mã số EU072424 phân bố nhóm đoạn gen ORCA3 mang mã số AJ251249 phân bố nhóm Như vậy, ORCA3 đoạn gen TN1 Protein ORCA3 suy diễn từ trình tự đoạn gen ORCA3 giống dừa cạn Thái Ngun mà chúng tơi phân lập có 200 amino acid Trong đó, amino acid loại serin có số lượng lớn (32) chiếm tỷ lệ 15, 92%, amino acid loại histidin có số lượng thấp (2) chiếm tỷ lệ 1,00% Số lượng tỷ lệ loại amino acid cụ thể minh họa bảng 3.3 Hình 3.4 TN1 NCBI Kết so sánh vùng tương đồng trình tự amino acid cho thấy protein suy diễn AJ251249, mã số CAB96899, tương đồng 98% so với protein suy diễn giống dừa cạn Thái Nguyên, protein suy diễn EU072424, mã số ABW77571, tương đồng 99% so với protein suy diễn giống dừa cạn Thái Nguyên Bảng 3.4 thể vị trí sai khác (188, 189, 190, 201) trình tự amino acid protein suy diễn giống dừa cạn Thái Nguyên so với protein CAB96899 ABW77571 Bảng 3.3 Tỷ lệ số lượng loại amino acid ORCA3 Acid amin Số lượng Tỷ lệ (%) Cys 1,49 Asp 10 4,98 Glu 19 9,45 Phe 3,48 Gly 16 7,96 His 1,00 Ile 4,48 Lys 11 5,47 Leu 11 5,47 Met 1,49 Asn 10 4,98 Pro 11 5,47 Gln 1,49 Arg 15 7,46 Ser 32 15,92 Thr 3,48 Val 2,99 Trp 2,49 Tyr 1,99 Ala 16 7,96 Bảng 3.4 Các vị trí sai khác trình tự amino acid 96899, ABW77571 Vị trí 188 189 190 201 CAB96899 S S S R ABW77571 - - - R TN1 - - - G Như vậy, trình tự amino acid giống dừa cạn TN1 Thái Nguyên khác amino acid so với CAB96899, khác amino acid so với ABW77571 Nguyên nhân trình tự nucleotide dừa cạn TN1 Thái Nguyên EU072424 bị khuyết đoạn nucleotide so với AJ251249, đoạn mã hóa cho amino acid loại serin trình tự amino acid dừa cạn Thái Nguyên ABW77571 amino acid so với trình tự amino acid AJ251249 Chúng tơi giả định rằng, trình sinh trưởng phát triển dừa cạn xảy đột biến đoạn nucleotide dẫn đến giảm amino acid loại serin, điều khiến cho điều hòa phiên mã thay đổi theo hướng tích cực Ở vị trí 601, AJ251249 EU072424 nucleotide loại A, điều làm thay đổi amino acid vị trí số 201 từ loại arginin thành loại glicine Như phần tổng quan có đề cập tới, theo [20] C giàu serin có chức điều hòa tiêu cực hoạt hóa phiên mã tế bào thực vật bị ức chế nhóm serin định vị đầu C protein ORCA3 Nếu loại bỏ 24 amino acid có chứa 11 gốc serin từ đầu tận C ORCA3 gây tăng hoạt hóa trans Ở chúng tơi nhận thấy, hai trình tự amino acid dừa cạn TN1 Thái Nguyên EU072424 amino acid loại serin đầu tận C so với trình tự AJ251249 đồng thời hai trình tự phân lập từ giống dừa cạn có màu hồng Cây dừa cạn hoa màu hồng có hàm lượng vinbastine vincristine cao tượng khuyết amino acid loại serin đầu tận C phải có liên quan đến khác hàm lượng alkaloid giống dừa cạn Đây vấn đề đặt cho nghiên cứu cần tiếp tục phân lập gen ORCA3 giống dừa cạn có hoa màu khác để làm sở so sánh phân tích mối liên quan trình tự gen ORCA3 với tổng hợp aklaloid giống dừa cạn Hình 3.5 Vùng AP-2 protein ORCA3 bám DNA [37] So sánh vùng AP2 đoạn gen ORCA3 Thái Nguyên trình tự Ngân hàng gen giống dừa cạn TN1 NCBI cho thấy, vùng AP2 trình tự giống 100%, trình tự có vùng AP2 dài 60 amino acid có 11 điểm bám với promoter vị trí amino acid số 101, 102, 104, 106, 108, 110, 114, 116, 124, 126, 129 Như vậy, đoạn gen ORCA3 liên quan đến sinh tổng hợp alkaloid phân lập thành công từ dừa cạn, mẫu TN1 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Đoạn gen ORCA3 phân lập Ngun tách dòng thành cơng xác định trình tự nucleotide ORCA3 1.2 603 nucleotide, mã hóa 200 amino acid đoạn gen ORCA3 TN1 so đoạn gen ORCA3 mang mã số EU0 98% 1.3 đoạn TN1 gen so 775 ORCA3 mino acid 99% tương đồng 98% so 96899 1.4 Vùng chức AP2 trình tự amino acid amino acid 96899 ĐỀ NGHỊ đoạn gen ORCA3 trắng, hoa màu trắng để có sở so sánh xác định xác thị phân tử liên quan tới việc điều khiển sinh tổng hợp alkaloid đoạn gen ORCA3 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Viện dược liệu (2001), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 1, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr 57-89 Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận, Vương Chí Hùng, Nguyễn Tiến Hùng, Study on the dynamic variation of 10-DAB and taxol contents of Taxus wallichiana needles cultivated in Lam Dong province PHARMA INDOCHINA VI The development of indochina pharmacy in the context of global economic recession 15-18/12/2009, tr.621-624 Tiếng Anh Aerts RJ, Stoker A, Beishuizen M, van de Heuvel M, van der Meijden E, Verpoorte R, (1992), “Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua“, J Chem Ecol, 18:1955–1964 Benoit St Bierr, Bierr Laflammer, Anne Marie Alarco, Vincenzo Deloca, (1998), “The terminal O–acetyltransferase involved in vindoline biosynthesis define a new class of protein responsible forr coenzyme A-dependent acyl transfer”, The Plant journal, 14(6) 703-713 Bhumika Shokeen, Shalu Choudhary, Niroj Kumar Sethy and Sabhyata Bhatia,(2011), Development of SSR and gene-targeted markers for construction of a framework linkage map of Catharanthus roseus, Ann Bot.; 108(2): 321– 336 Canel C, Lopes-Cardoso M, Whitmer S, van der Fits L, Pasquali G, et al., (1998), Effects of overexpression of strictosidine synthase and tryptophan decarboxylase on alkaloid production by cell cultures of Catharanthus roseus, Planta, 205: 414–419 Contin A, van der Heijden R, Lefeber AWM, Verpoorte R, (1998), The iridoid glucoside secologanin is derived from the novel triose phosphate/pyruvate pathway in Catharanthus roseus cell culture, FEBS Lett, 434:413–416 Leslie van der Fits and Johan Memelink, (2001), The jasmonate-inducible AP2/ERF-domain transcriptionactor ORCA3 activates gene expression via interaction witha jasmonate-responsive promoter element, The Plant Journal, 25(1) 43 - 53 Luijendijk TJC, van der Meijden E, Verpoorte R, (1996), Involvement of strictosidine as a defensive chemical in Catharanthus roseus, J Chem Ecol, 22:1355–1366 10 Meijer AH, Verpoorte R, Hoge JHC (1993a) Regulation of enzymes and genes involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus, J Plant Res, 3:145–164 11 Memelink J., Gantet P., ( 2007), Transcription factors involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus, Springer Science, 11101-006-9051 12 Menke FLH, Champion A, Kijne JW, Memelink J, (1999), A novel jasmonateand elicitor-responsive element in the periwinkle secondary metabolite biosynthetic gene Str interacts with a jasmonate- and elicitor-inducible AP2domain transcription factor, ORCA2, Embo J, 18 4455–4463 13 Montiel G, Zarei A, Körbes AP, Memelink J, (2011), The jasmonate-responsive element from the ORCA3 promoter from Catharanthus roseus is active in Arabidopsis and is controlled by the transcription factor AtMYC2, Plant Cell Physiol 52(3):578-587 Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ 14 Moreno PRH, van der Heijden R, Verpoorte R, (1995), Cell and tissue cultures of Catharanthus roseus (L.) G.Don: a literature survey II Updating from 1988 to 1993, Plant Cell Tiss Org Cult, 42: 1–25 15 Mustafa NR, Verpoorte R, (2007), Phenolic compounds in Catharanthus roseus, Phytochem Rev, 6: 243–258 16 Ouwerkerk PBF, Memelink J, (1999), A G-box element from the Catharanthus roseus strictosidine synthase (Str) gene promoter confers seed-specific expression in transgenic tobacco plants, Mol Gen Genet, 261:635–643 17 Pan Q, Wang Q, Yuan F, Xing S, Zhao J, Choi YH, Verpoorte R, Tian Y, Wang G, Tang K ,(2012), Overexpression of ORCA3 and G10H in Catharanthus roseus plants regulated alkaloid biosynthesis and metabolism revealed by NMRmetabolomics, PLoS One 7(8):e43038 18 Pauw B, Memelink J, (2005), Jasmonate-responsive gene expression, J Plant Growth Regul, 23:200–210 19 Pearce HL, Miller MA, (2005), The evolution of cancer research and drug discovery at Lilly Research Laboratories, Adv Enzyme Regul, 45: 229–255 20 Pré M, Sibéril Y, Memelink J, Champion A, Doireau P, Gantet P, (2000), Isolation by the yeast one-hybrid system of cDNAs encoding transcription factors that bind to the G-box element of the strictosidine synthase gene promoter from Catharanthus roseus, Int J Bio-chrom, 5:229–244 21 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 22 Santosh Kumar, Ajaswrata Dutta, Alok K Sinha, Jayanti Sen, (2007), Cloning, characterization and localization of a novel basic from Catharanthus roseus, FEBS J 274(5):1290-1303 Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ peroxidase gene 23 Sibéril Y, Benhamron S, Memelink J, Giglioli-Guivarc‟h N, Thiersault M, Boisson B, Doireau P, Gantet P, (2001), Catharanthus roseus G-box binding factors and act as repressors of strictosidine synthase gene expression in cell cultures, Plant Mol Biol, 45:477–488 24 Sottomayor M, Lopes Cardoso I, Pereira LG, Ros Barceló A, (2004), Peroxidase and the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G Don, Phytochem Rev, 3:159–171 25 Van der Fits L, Memelink J, (2000), ORCA3, a jasmonate-responsive transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism, Science, 289: 295–297 26 Van der Fits L, Memelink J., (2001), The jasmonate-inducible AP2/ERFdomain transcription factor ORCA3 activates gene expression via interaction with a jasmonate-responsive promoter element Plant J., 25: 43–53 27 Van der Heijden R, Jabos D, Snoeijer W, Hallard D, Verpoorte R, (2004), The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology, Curr Med Chem, 11: 607–628 28 Van der Heijden R, Verpoorte R, Ten Hoopen HJG, (1989), Cell and tissue cultures of Catharanthus roseus (L.) G Don: a literature survey Plant Cell Tissue Organ Cult, 18: 231–280 29 Verpoorte R, van der Heijden R, Moreno PRH, (1997), Biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus cells, The Alkaloids G.A Cordell (Editor) Academic Press, 221–299 30 Vom Endt D, Kijne JW, Memelink J, (2002), Transcription factors controlling plant secondary metabolism: what regulates the regulators?, Phytochemistry, 61:107–114 Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ 31 Vom Endt D, Soares e Silva M, Kijne JW, Pasquali G, Memelink J, (2007), Identification of a Bipartite Jasmonate-Responsive Promoter Element in the Catharanthus roseus ORCA3 Transcription Factor Gene That Interacts Specifically with AT-Hook DNA-Binding Proteins, Plant Physiol., 144(3): 1680-1689 32 Wang CT, Liu H, Gao XS, Zhang HX, (2010), Overexpression of G10H and ORCA3 in the hairy roots of Catharanthus roseus improves catharanthine production, Plant Cell Rep, 29(8): 887-894 33 Wang Q, Yuan F, Pan Q, Li M, Wang G, et al, (2010), Isolation and functional analysis of the Catharanthus roseus deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase gene promoter, Plant Cell Rep, 29: 185–192 34 Xu B, Timko M, (2004), Methyl jasmonate induced expression of the tobacco putrescine N -methyltransferase genes requires both G-box and GCC-motif elements, Plant Mol Biol, 55: 743-761 35 Zhang H, Hedhili S, Montiel G, Zhang Y, Chatel G, Pré M, Gantet P, Memelink J, (2011), The basic helix-loop-helix transcription factor CrMYC2 controls the jasmonate-responsive expression of the ORCA genes that regulate alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus, Plant J., 67(1): 61-71 36 Zhao J, Verpoorte R, (2007), Manipulating indole alkaloid production by Catharanthus roseus cell cultures in bioreactors: from biochemical processing to metabolic engineering, Phytochem Rev, 6: 435–457 TRANG WEB 37 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/8980313?report=graph Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ ... tài: Phân lập gen ORCA3 liên quan đến tổng hợp alkaloid từ dừa cạn (Catharanthus roseus (L. ) G Don) MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ORCA3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10 ORCA3 K tách dòng cDNA gen ORCA3 11 ( 2) Phân. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ THANH HƯƠNG PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L. ) G Don) Chuyên ngành: Di truyền... công bố phân lập Van der Fits Memelink (200 0) đối tượng dừa cạn (Catharanthus roseus L) Các nghiên cứu gen ORCA3 tập trung vào mối liên quan gen ORCA3 tới trình sinh tổng hợp alkaloid dừa cạn lựa