Đang tải... (xem toàn văn)
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Thịt gia cầm là một nguồn protein ngày càng có vai trò quan trọng trong cuộc sống hàng ngày. Trên thế giới, sản lượng thịt gia cầm tăng 16% kể từ năm 1995. Ở các nước đang phát triển, mức tăng có thể đến 77% (Anon, 2006). Theo số liệu của Tổng cục Thống kê và giá thực tế, ngành chăn nuôi Việt Nam đang có sản lượng thịt gia cầm đứng thứ 2 khu vực ASEAN trong đó gà chiếm chủ yếu. Tuy ngành công nghiệp chăn nuôi gà đang ngày càng phát triển nhưng vẫn còn gặp không ít khó khăn nhất là vấn đề dịch bệnh trong đó phải kể đến bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà (IB - Infectious Bronchitis). IB là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh và gây thiệt hại kinh tế nặng nề, không những vậy do tính chất phức tạp của mầm bệnh, virus gây bệnh có nhiều serotype, dễ biến đổi nên bệnh rất khó kiểm soát. Những vụ dịch vẫn xảy ra thường là kết quả của sự lây nhiễm với các chủng khác về serotype so với các chủng vacxin (Wang et al., 1996). Vacxin sống đã được phát triển để chống lại một số serotype mới của IBV (Bande et al., 2015). Tuy nhiên, do ngày càng có nhiều biến chủng IBV mới xuất hiện khiến cho việc khống chế bệnh vẫn còn là một vấn đề nan giải. Vì vậy việc điều tra dịch tễ học IB, nghiên cứu và tìm ra những serotype IBV phổ biến lưu hành trong mỗi khu vực là rất quan trọng trong công tác kiểm soát bệnh. Tuy nhiên từ trước tới nay, câu hỏi về đặc điểm dịch tễ học IB, các serotype IBV lưu hành ra sao ở Việt Nam vẫn còn chưa có câu trả lời cụ thể và thỏa đáng. Để có thêm thông tin về các chủng IBV đang lưu hành, sự phân bố của IB ở Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc nơi các đàn gà tập trung chủ yếu (chiếm tới 75% đàn gà cả nước), nghiên cưu cac đăc tinh sinh hoc cũng như sinh học phân tử cua mâm bênh, tìm ra các yếu tố nguy cơ liên quan đến dịch IB nhằm kiểm soát bệnh, nâng cao hiệu quả chăn nuôi, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài này. Đề tài nghiên cứu nhằm giải đáp một số câu hỏi về các vấn đề gồm: - Đặc điểm dịch tễ, sự phân bố IBV trên đàn gà tại môt sô tinh miền Bắc Việt Nam; - Đặc điểm bệnh lý IB và các yếu tố nguy cơ liên quan; - Đặc tính sinh học và sinh học phân tử của những chủng IBV hiện đang lưu hành trên khu vực nghiên cứu. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định được các đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các chủng IBV để làm cơ sở đề xuất các biện pháp phòng chống IB (tiêm phòng vacxin) nhằm tạo điều kiện cho chăn nuôi phát triển bền vững. - Chẩn đoán, phân lâp va khao sat được đăc tinh sinh hoc cua IBV gây bệnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2014–2017.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỀM (INFECTIOUS BRONCHITIS - IB) Ở GÀ NI TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mu ̣c lu ̣c iii Danh mu ̣c các ký hiê ̣u các chữ viế t tắ t vi Danh mu ̣c các bảng viii Danh mu ̣c các hiǹ h ix Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm gà 2.1.1 Lịch sử bệnh viêm phế quản truyền nhiễm giới .4 2.1.2 Tình hình bệnh vấn đề nghiên cứu bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm Việt Nam 2.2 Đặc tính sinh học IBV 2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại 2.2.2 Sức đề kháng, phương thức truyền lây IBV 15 2.2.3 Đặc tính ni cấy IBV 17 2.3 Đặc điểm phân tử virus viêm phế quản truyền nhiễm 19 2.3.1 Gen Glycoprotein S 20 2.3.2 Gen Glycoprotein S1 21 2.3.3 Gen Glycoprotein S2 22 iii 2.3.4 Nghiên cứu dịch tễ học IBV dựa genotype 22 2.4 Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm .24 2.4.1 Dịch tễ học 24 2.4.2 Phương thức truyền lây .24 2.4.3 Cơ chế gây bệnh 25 2.4.4 Triệu chứng lâm sàng 26 2.4.5 Bệnh tích .27 2.5 Vacxin phòng bệnh 32 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 34 3.1 Địa điểm nghiên cứu 34 3.2 Thời gian nghiên cứu 34 3.3 Nội dung nghiên cứu 34 3.3.1 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán phát IBV nghiên cứu biến đổi bệnh lý IB gà 34 3.3.2 Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ IB gà ta ̣i mô ̣t số tin̉ h miền Bắc Việt Nam .34 3.3.3 Phân lập xác định số đặc tính sinh học chủng IBV phân lập 34 3.3.4 Phân tích trình tự gen xây dựng phả hệ 35 3.4 Vật liệu nghiên cứu 35 3.4.1 Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 35 3.4.2 Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 36 3.4.3 Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 36 3.4.4 Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 36 3.5 Phương pháp nghiên cứu 37 3.5.1 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 37 3.5.2 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 40 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 44 3.5.4 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 46 iv Phần Kết thảo luận 49 4.1 Ứng dụng kỹ thuật rt-pcr để chẩn đoán phát IBV nghiên cứu biến đổi bệnh lý IB 49 4.1.1 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán phát IBV 49 4.1.2 Kết nghiên cứu số biến đổi bệnh lý IB gà 55 4.2 Đặc điểm dịch tễ ib gà số tỉnh miền bắc Việt Nam 67 4.2.1 Tình hình mắc IB gà số tỉnh miền Bắc Việt Nam 67 4.2.2 Xác định số yếu tố liên quan đến bệnh IB 73 4.3 Phân lập xác định số đặc tính sinh học chủng IBV phân lập 82 4.3.1 Phân lập IBV trứng gà có phơi 82 4.3.2 Xác định số đặc tính sinh học chủng IBV phân lập .86 4.4 Phân tích trình tự gen xây dựng phả hệ 91 4.4.1 Phân tích trình tự gen S1 xây dựng phả hệ 91 4.4.2 Phân tích trình tự gen S chủng IBV phân lập từ thực địa .99 4.4.3 Phân tích đặc điểm chủng IBV lưu hành miền Bắc Việt Nam 107 Phần Kết luận đề nghị 114 5.1 Kết luận .114 5.2 Đề nghị 114 Danh mục cơng trình cơng bố liên quan đến luận án 116 Tài liê ̣u tham khảo 117 Phụ lục 133 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ aa Amino acid BPL Betapropiolactone BHK-21 Baby hamster kidney-21 CAM Chorioallantois membrane cDNA Complementary deoxyribonucleic acid CEK Chicken embryo kidney CEL Chicken embryo liver CI Confidence interval CK Chicken kidney CPE Cytopathic effect E Envelop E.coli Escheriachia coli EID50 Embryo infection dose 50% ELD50 Embryo lethal dose 50% ED50 Embryo (infection or lethal) dose 50% ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay DNA Deoxyribonucleic acid HI Haemagglutination inhibition HVR Hypervariable region IB Infectious bronchitis IBV Infectious bronchitis virus IFA Indirect immunofluorescent assay kb Kilo base kDa Kilo dalton M Membrane MAb Monoclonal antibodies mRNA Messenger ribonucleic acid N Nucleocapsid nt Nucleotide vi OIE World organisation for Animal health ORF Open reading frame ORT Ornithobacterium rhinotracheale PCR Polymerase chain reaction PBS Phosphate-buffered saline RFLP Restriction fragment length polymorphism RNA Ribonucleic acid RNP Ribonucleoprotein RR Relative risk hay Risk ratio RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction S Spike sM Small membrane SPF Specific pathogen free TAE Tris-acetate-ethylendiamin tetraacetic acid TOC Tracheal organ culture UTR Untranslated region VN Virus neutralization VNT Virus neutralization test vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1 Thành phần phản ứng PCR 39 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 39 3.3 Bảng 2x2 quan hệ yếu tố khảo sát với IB theo đàn 43 4.1 Kết chẩn đoán IB phương pháp RT-PCR 54 4.2 Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng chủ yếu gà mắc IB 57 4.3 Kết nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể gà mắc IB 61 4.4 Sản lượng trứng gà đẻ mắc IB 62 4.5 Kết nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể gà mắc IB 64 4.6 Tỉ lệ gà mắc IB địa bàn nghiên cứu 68 4.7 Tỷ lệ gà mắc IB theo lứa tuổi gà địa bàn nghiên cứu 69 4.8 Tỷ lệ gà mắc IB theo mùa địa bàn nghiên cứu 71 4.9 Yếu tố nguy phương thức chăn nuôi 73 4.10 Yếu tố nguy quy mô chăn nuôi 75 4.11 Yếu tố nguy tiêm phòng vacxin IB 76 4.12 Yếu tố nguy nguồn gốc giống 78 4.13 Yếu tố nguy vị trí trang trại 79 4.14 Yếu tố nguy vệ sinh chuồng trại 80 4.15 Thông tin chủng IBV phân lập 85 4.16 Kết kiểm tra thích nghi chủng IBV phơi gà 86 4.17 Kết tổng hợp số phôi chết số phôi nhiễm IBV nồng độ gây nhiễm 89 4.18 Kết tính EID50/ml ELD50/ml 90 4.19 Các chủng IBV tham chiếu sử dụng so sánh với chủng VNUA-HN01 94 4.20 Mức độ tương đồng nucleotide amino acid chủng VNUA-HN01 so sánh với chủng tham chiếu 95 4.21 So sánh mức độ tương đồng nucleotide amino acid gen S chủng IBV phân lập Việt Nam chủng IBV tham chiếu khác 101 viii DANH MỤC CÁC HÌ NH TT Tên hình Trang 2.1 Hình ảnh IBV kính hiển vi điện tử 10 2.2 Tổ chức hệ gen IBV với điểm nóng đột biến, mối quan hệ với sửa đổi glycoprotein spike nucleoprotein virus tầm quan trọng liên quan đến đặc tính sinh học miễn dịch học IBV 12 2.3 Tổ chức gen điển hình coronavirus gia cầm 20 2.4 Gà bị nhiễm IBV 26 2.5 Bất thường hình dạng kích cỡ trứng gà bị nhiễm IBV (a) 27 2.6 Khí quản tiết dịch nhầy, tắc nghẽn tăng trương lực (a); vùng tập trung viêm phổi nhẹ (b) 28 2.7 Thận sưng sung huyết IBV 29 2.8 Bệnh tích đại thể phủ tạng gà nhiễm IBV (a) tích tụ lòng đỏ trứng xoang bụng; (b) gan sưng, nhợt nhạt dễ vỡ; (c) xuất huyết nhiều bề mặt dày tuyến, (d) dày (e) ruột non 30 2.9 Sự giãn nở toàn ống dẫn trứng 30 2.10 Bằng chứng chất tiết niêm mạc tế bào biểu mô (a) xâm nhập tế bào lympho biểu mô (b) 31 3.1 Thu hoạch nước xoang niệu nang sau phân lập IBV phôi gà 44 4.1 Kết kiểm tra tính bắt cặp nucleotide cặp mồi với trình tự gen IBV GenBank - Tóm tắt đồ hoạ 49 4.2 Kết kiểm tra tính bắt cặp nucleotide cặp mồi với trình tự gen IBV GenBank - Các trình tự tạo bắt cặp có ý nghĩa 50 4.3 Kết kiểm tra tính bắt cặp nucleotide cặp mồi với trình tự gen IBV GenBank - Sự bắt cặp 50 4.4 Kết kiểm tra tính bắt cặp nucleotide cặp mồi với trình tự gen chủng virus vacxin IB 4-91 51 4.5 Kết kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng RT-PCR chẩn đoán IB 52 4.6 Kết kiểm tra độ nhạy phản ứng RT- PCR để chẩn đoán IB 53 4.7 Kết chẩn đoán IB gà phương pháp RT- PCR 54 4.8 Các triệu chứng lâm sàng gà mắc IB 56 ix 4.9 Bệnh lý đại thể gà mắc IB (A, B, C, D G, H) hình dạng trứng gà dị dạng, vỏ lụa, lòng trắng lỗng IB (E, F, I) 60 4.10 Hình ảnh bệnh lý vi thể gà mắc IB 67 4.11 Kết diện di sản phẩm RT-PCR từ mẫu sau phân lập đời P5 M:Maker 83 4.12 Kết gây nhiễm IBV phôi gà 84 4.13 Kết nhân gen S1 (1.7 kb) chủng virus ck/VN/VNUA-HN01/2014 phản ứng RT-PCR 92 4.14 Kết phân biệt plasmid DNA mang gen S1 (làn 2, 3, 5) không mang gen S1 (làn 1, 4, 6) 93 4.15 So sánh trình tự amino acid chủng IBV ck/VN/VNUA-HN01/2014 với chủng tham chiếu 96 4.16 Cây phả hệ phân tích mối tương quan gen S1 chủng IBV ck/VN/VNUA-HN01/2014 với chủng tham chiếu 98 4.17 Sắp xếp trình tự chuỗi amino acid gen S1 (16 chủng) gen S2 (8 chủng) 103 4.18 Cây phả hệ xây dựng dựa trình tự nucleotide gen S1 105 4.19 Cây phả hệ xây dựng dựa trình tự nucleotide gen S2 106 4.20 Cây phả hệ phân tích mối tương quan chủng phân lập Việt Nam chủng tham chiếu khác dựa trình tự gen S hồn chỉnh IBV 108 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Thị Loan Tên Luận án: Nghiên cứu dịch tễ học bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis - IB) gà nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đặc điểm dịch tễ, phân bố chủng IBV để làm sở đề xuất biện pháp phòng chống IB (tiêm phòng vacxin) nhằm tạo điều kiện cho chăn ni phát triển bền vững - Chẩn đốn, phân lâ ̣p và khảo sát đă ̣c tính sinh ho ̣c của IBV gây bệnh số tỉnh miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2014–2017 Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu gồm: Các đặc điểm dịch tễ IB số đặc tính sinh học IBV gây bệnh số tỉnh miền Bắc Việt Nam, 2014–2017 Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học dịch tễ học mô tả, hồi cứu, thống kê sinh học Phương pháp mổ khám gà Thomas Carlyle Jones, phương pháp lấy mẫu theo QCVN 01-83: 2011/BNNPTNT Phương pháp làm tiêu vi thể tẩm đúc paraffin nhuộm Haematoxylin – Eosin theo quy trình Bộ mơn Bệnh lý, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phương pháp phân lập virus phơi gà 10 ngày tuổi theo quy trình OIE (2018) Phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh học IBV: gây nhiễm IBV trứng gà SPF xác định hiệu giá EID50/ml ELD50/ml phương pháp Spearman and Karber Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng bao gồm: phương pháp RT-PCR giải trình tự gen Phân tích so sánh trình tự gen sử dụng phần mềm DNASTAR Lasergene BioEdit 6.0 Cây phả hệ xây dựng dựa vào thuật tốn Neighbor-joining algorithms chương trình PHYLIP suite phần mềm MEGA 7.0 Kết kết luận xi ... gây bệnh số tỉnh miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 201 4–2 017 Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu gồm: Các đặc điểm dịch tễ IB số đặc tính sinh học IBV gây bệnh số tỉnh miền Bắc Việt Nam, 201 4–2 017... truyền nhiễm (Infectious Bronchitis - IB) gà nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu -... tượng nghiên cứu - Các đàn gà nuôi số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam; - Các chủng IBV phân lập từ đàn gà mắc IB 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ IB gà tỉnh thành miền Bắc Việt