ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ MINH TƢƠI PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG PATULIN TRONG CÁC LOẠI NƢỚC UỐNG TRÁI CÂY BẰNG Demo Version - Select.Pdf SDK PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU THỪA THIÊN HUẾ, 2018 ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ MINH TƢƠI PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG PATULIN TRONG CÁC LOẠI NƢỚC UỐNG TRÁI CÂY BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chun ngành: HóaSDK Phân Tích Demo Version - Select.Pdf Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ VĂN TỨ THỪA THIÊN HUẾ, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu ghi luận văn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Minh Tƣơi Demo Version - Select.Pdf SDK Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS Ngô Văn Tứ giao đề tài, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn này, đồng thời bổ sung cho nhiều kiến thức chuyên môn kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy khoa Hóa trường Đại học Sư phạm Đại học Khoa học – Đại học Huế giảng dạy, giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian học Cao học thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm Thực phẩm Thừa Thiên Huế giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi thực luận văn Bằng tình cảm chân thành, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn Demo Version - Select.Pdf SDK bè động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Thừa Thiên Huế, năm 2018 Nguyễn Thị Minh Tươi MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU NỘI DUNG 10 CHƢƠNG TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 10 1.1 Giới thiệu trái 10 1.2 Giới thiệu nước uống trái 11 1.3.Tổng quan độc tố nấm mốc 13 1.4 Độc tố Patulin 14 1.4.1 Lịch sử nghiên cứu patulin 14 1.4.2 Giới thiệu patulin 15 1.4.3 Cấu tạo hóa học, danh pháp 16 Demo Version - Select.Pdf SDK 1.4.4 Nguồn phát patulin 16 1.4.5 Tính chất vật lý 16 1.4.6 Tính chất hóa học 17 1.4.7 Độc tố patulin 19 1.4.8 Tiêu chuẩn cho phép hàm lượng patulin 20 1.4.9 Biện pháp kiểm soát 21 1.5 Các phương pháp xác định Patulin 22 1.5.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 22 1.5.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ 23 1.5.3 Phương pháp sắc ký điện di mao quản 23 1.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 24 1.5.5 Phát triển cảm biến sinh học alkaline phosphatase sở biến tính điện cực ống carbon nano để xác định độc tố nấm mốc patulin 24 1.6 Giới thiệu phương pháp HPLC 25 1.6.1 Nguyên tắc phương pháp HPLC 25 1.6.2 Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC 25 1.6.3 Detector UV 26 1.6.4 Cách đánh giá peak, phương pháp định lượng phương pháp HPLC 27 1.7 Kết luận chung phần tổng quan lý thuyết 31 CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Nội dung nghiên cứu 32 2.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 32 2.1.2 Đánh giá độ tin cậy phương pháp 32 2.1.3 Xây dựng quy trình phân tích áp dụng quy trình phân tích mẫu thực tế 32 2.2 Dụng cụ hóa chất 32 2.2.1 Dụng cụ 32 2.2.2 Hóa chất 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 33 Demopháp Version SDK 2.3.1 Phương lấy mẫu- Select.Pdf chuẩn bị mẫu 33 2.3.2 Chọn kỹ thuật xử lý mẫu 33 2.3.3 Chuẩn bị mẫu trắng 33 2.3.4 Khảo sát điều kiện phân tích 34 2.3.5 Đánh giá độ tin cậy phương pháp phân tích 34 2.3.6.Áp dụng phương pháp để định lượng patulin loại nước uống trái địa bàn thành phố Huế 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết khảo sát điều kiện phân tích theo phương pháp HPLC 40 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chạy sắc ký 40 3.1.2 Ảnh hưởng thành phần pha động 41 3.1.3 Ảnh hưởng tốc độ dòng pha động 42 3.2 Quy trình xử lý mẫu 44 3.3 Đánh giá độ tin cậy phương pháp HPLC xác định Patulin 45 3.3.1 Độ ổn định hệ thống HPLC sử dụng detector UV 45 3.3.2 Tính đặc hiệu phương pháp 46 3.3.3 Khoảng tuyến tính phương pháp định lượng 47 3.3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 48 3.3.5 Xác định độ lặp lại phương pháp 49 3.3.6 Xác định độ phương pháp 51 3.4 Xây dựng quy trình phân tích 52 3.5 Áp dụng quy trình định lượng Patulin số mẫu nước uống trái thành phố Huế 54 3.5.1 Mẫu phân tích 54 3.5.2 Phân tích đánh giá hàm lượng patulin số mẫu nước uống trái địa bàn thành phố Huế 55 3.5.3 Đánh giá kết phân tích hàm lượng patulin so với hàm lượng bảng thành phần thực phẩm Việt Nam Bộ Y tế 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 I Kết luận 63 Demo Version - Select.Pdf SDK II Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Stt Ký hiệu AOAC Tên tiếng Anh Association Tên tiếng Việt Official Hiệp hội nhà hóa phân tích of Analytical Chemists thức CCD Charge coupled device Cảm biến CCD DPA Acid desoxypatulinic Acid desoxypatulinic DNA Deoxyribonucleic acid ĐKTN Experimental condition GC - MS HPLC HPLC-DAD IUPAC 10 IDH Isoepoxydon Dehydrogenase Isoepoxydon Dehydrogenase 11 LOD Limit of detection Giới hạn phát 12 LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng Gas chromatography truyền Điều kiện thực nghiệm with Mass Spectrometer Detector High performance liquid chromatography High performance Sắc ký khí khối phổ Sắc ký lỏng hiệu cao liquid Sắc ký lỏng hiệu cao sử Demo Version - Select.Pdf SDK dụng detector mảng diode chromatography - diode array International Union Of Pure And Applied Chemistry Liquid 13 Phân tử mang thông tin di chromatography- LC-ESI-MS electrospray ionization mass spectrometry 14 MEKC 15 16 Hiệp hội Hóa Học Quốc Tế Đo phổ khối ion hóa sắc ký lỏng Micell Capillary Electro – Điện di mao quản điện động Kinetic Electrophoreses học Micell PAT Patulin Patulin ppm Part per million Phần triệu 17 ppb Part per billion Phần tỷ 18 PVPP-F Polyvinylpolypyrrolidone- Polyvinylpolypyrrolidone- florisil florisil 19 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối 20 Rev Recovery Độ thu hồi 21 SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn 22 TCVN Viet Nam Standard Tiêu chuẩn Việt Nam 23 TLC Thin-layer chromatography Sắc ký lớp mỏng 24 UV - Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại – Khả kiến 25 USDA 26 VSATTP United States Department of Agriculture Hygiene and food safety Demo Version - Select.Pdf SDK Bộ Nơng nghiệp Hoa Kỳ Vệ sinh an tồn thực phẩm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Ảnh hưởng SO2 patulin 18 Bảng 1.2 Giới hạn an toàn cho phép ô nhiễm PAT thực phẩm .21 Bảng 1.3 Diện tích peak nồng độ 29 Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm để phân tích ANOVA yếu tố .38 Bảng 2.2 Bảng phân tích phương sai theo ANOVA yếu tố 39 Bảng 3.1 Kết hệ số đối xứng tỷ lệ hệ dung môi pha động 42 Bảng 3.2 Các thông số tốc độ dòng khác 43 Bảng 3.3 Các thông số sắc ký peak patulin .46 Bảng 3.4 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 48 Bảng 3.5 Kết xác định giới hạn phát giới hạn định lượng 49 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại .50 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp phân tích patulin .50 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ mẫu nước uống trái .51 Bảng 3.9 Thông tin mẫu nước uống trái lấy đợt 54 Demo Select.Pdf Bảng 3.10 Thông tinVersion mẫu- nước uống tráiSDK lấy đợt 54 Bảng 3.11 Thông tin mẫu nước uống trái lấy đợt 55 Bảng 3.12 Kết phân tích hàm lượng patulin mẫu nước uống trái (đợt 1) 56 Bảng 3.13 Kết phân tích hàm lượng patulin mẫu nước uống trái (đợt 2) 57 Bảng 3.14 Kết phân tích hàm lượng patulin mẫu nước uống trái (đợt 3) 58 Bảng 3.15 Kết phân tích ANOVA yếu tố hàm lượng PAT mẫu nước uống trái theo thời gian lấy mẫu 59 Bảng 3.16 Kết đánh giá theo phương pháp ANOVA yếu tố mẫu nước uống trái thời gian lấy mẫu khác .60 Bảng 3.17.Kết phân tích hàm lượng Patulin 06 mẫu nước uống trái 61 Bảng 3.18 Kết kiểm tra hàm lượng Patulin 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số loại trái 10 Hình 1.2 Một số loại nƣớc uống trái 11 Hình 1.3 Nấm mốc A clavatus 16 Hình 1.4 Cấu tạo hóa học patulin 16 Hình 1.5 Các đƣờng tổng hợp patulin 17 Hình 1.6 Ảnh hƣởng SO2 nhiệt độ patulin .18 Hình 1.7 Phản ứng PAT với Cysteine 19 Hình 1.8 Cấu trúc patulin, ( E ) - ascladiol, ( Z ) - ascladiol 22 acid desoxypatulinic (DPA) 22 Hình 1.9 Giới thiệu hệ thống HPLC .26 Hình 1.10 Nguyên tắc cấu tạo detector UV 27 Hình 1.11 Chuẩn hố điểm 28 Hình 1.12 Đồ thị phƣơng pháp đƣờng chuẩn 29 Hình 1.13 Đồ thị phƣơng pháp thêm chuẩn đƣờng chuẩn 30 Demo Version - Select.Pdf SDK Hình 1.14 Phƣơng pháp chuẩn nội xác định chất phân tích 30 Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động 41 Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động 43 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu phƣơng pháp mẫu trắng 47 Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu phƣơng pháp mẫu chuẩn 0,5 ppm .47 Hình 3.5 Đƣờng hồi quy tuyến tính biểu diễn liên hệ nồng độ C diện tích peak S 48 Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát độ phƣơng pháp thêm chuẩn patulin 52 Hình 3.7 Quy trình phân tích mẫu nƣớc uống trái theo phƣơng pháp HPLC .53 Hình 3.8 Biểu đồ hàm lƣợng patulin số loại nƣớc uống trái 62 MỞ ĐẦU Độc tố nấm mốc hợp chất độc tạo nhiều loại nấm mốc Nhiễm độc tố nấm mốc xảy nơi sản xuất trình bảo quản Khi nấm gặp phải nhiệt độ độ ẩm thích hợp, chúng nhân lên sản sinh mycotoxin [1] Độc tố nấm mốc gây ngộ độc cấp tính, gây hại thể từ từ làm người ta khơng để ý Nhưng phát triệu chứng quan, phận thể bị ảnh hưởng nghiêm trọng Tùy theo loại nấm mốc độc tố chúng mà tác động lên phần khác nhau, tổng hợp chung lại tất độc tố nấm mốc tác động lên hầu hết phận thể tác động vào gan thận gây viêm, kéo dài gây ung thư (Aflatoxin, Ochratoxin…); tác động vào hệ tuần hoàn gây xuất huyết mãn tính, ngưng kết hồng cầu, giảm lượng kháng thể (Aflatoxin…), tác động lên hệ hô hấp (Aspergillus fumigatus)[1] Patulin (4-hydroxy-4H-furo[3,2c]pyran-2[6H]-one) độc tố nấm mốc phân lập lần từ Aspergillus clavatus nghiên cứu vào đầu Version - Select.Pdf năm Demo 1940 Mối quan tâm ban đầu vàoSDK phân tử hoạt tính kháng khuẩn nó, Selman Waksman, Howard Florey Ernest Chain người tiên phong việc thử nghiệm tác nhân kháng khuẩn Tuy nhiên, vào năm 1950, người ta phát PAT độc hại thực vật động vật Vì vậy, việc sử dụng loại thuốc để điều trị bệnh vi khuẩn bị loại kể từ người ta tập trung nghiên cứu vào việc làm để loại bỏ độc tố [26] Patulin độc tố nấm mốc sản sinh số loài Penicillium, Aspergillus Byssochlamys Patulin phát triển nhiều loại thực phẩm khác bao gồm ngũ cốc, trái mát [27] Patulin tìm thấy phổ biến loại trái bị hỏng, thường nước trái đáng ý nước uống táo; điều dẫn đến quy định mức độ chấp nhận cho phép tối đa hầu hết quốc gia Các mức đặt mức 50 ppb Hoa Kỳ, nước tiêu thụ táo giới Mức độ tương tự thiết lập Liên minh châu Âu, với mức tối đa 10 ppb ... PHẠM NGUYỄN THỊ MINH TƢƠI PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG PATULIN TRONG CÁC LOẠI NƢỚC UỐNG TRÁI CÂY BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: HóaSDK Phân Tích Demo Version - Select.Pdf... quy trình định lượng Patulin số mẫu nước uống trái thành phố Huế 54 3.5.1 Mẫu phân tích 54 3.5.2 Phân tích đánh giá hàm lượng patulin số mẫu nước uống trái địa bàn thành... 2.3.4 Khảo sát điều kiện phân tích 34 2.3.5 Đánh giá độ tin cậy phương pháp phân tích 34 2.3.6.Áp dụng phương pháp để định lượng patulin loại nước uống trái địa bàn thành phố Huế