BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP VÀ LACTOBACILLUS SPP ĐỐI VỚI MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1515100007 : LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG Lớp: 15HSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực PhẩmMôi Trường trường Đại Học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác với hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin chịu tồn trách nhiệm đồ án TP.HCM, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên thực Lê Ngô Vũ Phượng i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người ni nấng dạy dỗ khuyến khích tạo điều kiện cho học tập để có thành ngày hơm Trong suốt khoảng thời gian học trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em thây, cô khoa Cơng Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Mơi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trình học tập trường trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến q Thầy, Cơ nhờ có thầy, trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Hương, tận tình hướng dẫn, bảo em suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương thực hiện, hoàn thành đồ án Em xin cám ơn Thầy, Cơ phòng thí nghiệm bạn bè quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn Thầy, Cô Hội Đồng Phản Biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe TP HCM, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên thực Lê Ngô Vũ Phượng ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TÔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm: 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Độc tố nấm tiết .4 1.1.3 Tác hại nấm 1.1.3.1 Tác hại nấm gây cho người động vật 1.1.3.2 Tác hại nấm gây cho thực vật 1.1.4 Một số chủng nấm gây hại thực phẩm 1.2 Tổng quan hợp chất kháng nấm: 1.2.1 Hợp chất kháng nấm hóa học 10 1.2.2 Tác hại hợp chất kháng nấm hóa học .10 1.2.3 Hợp chất kháng nấm sinh học 13 1.2.3.1 Hợp chất kháng nấm từ thực vật: 13 1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: 17 a Khả kháng nấm mốc Bacillus spp 17 b Khả kháng nấm mốc Lactobacillus spp 19 1.3 Các phương pháp sàng lọc chủngVSV kháng nấm mốc: 21 1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy đường vi khuẩn) 21 1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) 23 1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa lớp): 25 iii Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Địa điểm nghiên cứu: 26 2.2 Thời gian nghiên cứu: 26 2.3 Vật liệu nghiên cứu: 26 2.3.1 Giống vi sinh vật: 26 2.3.1 Hóa chất mơi trường sử dụng 26 2.3.1.1 Hóa chất: 26 2.3.1.2 Môi trường nuôi cấy: 26 2.4 Thiết bị dụng cụ: 27 2.4.1 Thiết bị: 27 2.4.2 Dụng cụ: 28 2.5 Phương pháp luận: 28 2.6 Phương pháp nghiên cứu: 29 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.6.2 Khảo sát tăng trường nấm mốc: 30 2.6.3 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria đường vi khuẩn chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: 30 2.6.4 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch khuếch tán chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: 35 2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa lớp chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: 39 2.6.6 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa số chủng vi khuẩn 43 2.6.6.1 Nhuộm gram 43 2.6.6.2 Nhuộm bào tử 44 2.6.6.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 44 iv Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 3.1 Định danh sơ khảo sát sinh lý - sinh hóa số chủng vi khuẩn 45 3.1.1 Nhuộm Gram: 45 3.1.2 Nhuộm bào tử: 46 3.1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 47 3.2 Khảo sát tăng trưởng nấm mốc: 48 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria đường vi khuẩn chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc: 50 3.4 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch khuếch tán chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc: 66 3.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa lớp chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc 81 3.6 So sánh khả đối kháng nấm mốc 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) 90 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactobacillus spp NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth MT Môi trường PDA Potato dextrose agar VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học sử dụng để bảo quản hạt giống Bảng 1.2.Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) 18 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng Bacillus spp 45 Bảng 3.2 Một số phản ứng sinh hóa chủng Bacillus spp 47 Bảng 3.3 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp cấy đường vi khuẩn 53 Bảng 3.4 So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 54 Bảng 3.5 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp cấy đường vi khuẩn 62 Bảng 3.6 So sánh số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 63 Bảng 3.7 Thống kê số liệu vòng ức chế chủng nấm mốccủa chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 68 Bảng 3.8 So sánh sô liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 69 Bảng 3.9 Thống kê số liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 76 vii Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 77 Bảng 3.11 Thống kê số liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp đỗ dĩa lớp 84 Bảng 3.12 Sắp xếp sơ liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp nhóm theo phương pháp đõ dĩa lớp 85 Bảng 3.13 Sắp xếp số liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp đỗ dĩa lớp 89 Bảng 3.14 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp nhóm theo phương pháp đỗ dĩa lớp 90 Bảng 3.15 Thống kê điểm chủng vi khuẩn Bacillus spp theo phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 91 Bảng 3.16 Thống kê điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp theo phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 92 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Metalaxyl 10 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Manocozeb 11 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Hexacoconazole 11 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học Pyrones 14 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học Viridines 15 Hình 1.6 Phương pháp cấy ria đường thể đối kháng vi khuẩn LAB nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) 20 Hình 1.7 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương pháp ria đường vi khuẩn 21 Hình 1.8 Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể đối kháng vi khuẩn Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) 22 Hình 1.9 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 23 Hình 1.10 Phương pháp đối kháng che phủ Bacillus spp với loại nấm (trích từ Kumar cộng sự,2009) 24 Hình 1.11 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương pháp đỗ dĩa .25 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả dối kháng chủng vi khuẩn có lợi nấm mốc 29 Hình 2.2 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria đường 31 ix Error Mean Square 10.13419 Critical Value of t 2.07387 Least Significant Difference 5.3905 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N DN2 A 52.743 (CS1b) B 43.500 (D9) B 39.387 DCNYSTAT D 35.280 (VK4) 32.197 (Paenibacillus) B C C C D E D E D E D 30.657 (CS1a) E F 29.283 10 (NT1.3) E F E F 27.403 (NT 2.3) 25.007 (NT 1.4) F 25.007 (NT 3.3) G 16.787 3 (NT CS1+) E F F F 17 HCP2: TI LE UC CHE NAM HCP2 21:09 Thursday, July 23, 2016 24 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels HCP2 Values 11 10 DCNYSTAT Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 TI LE UC CHE NAM HCP2 21:09 Thursday, July 23, 2016 25 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Squares Mean Square Model 10 6163.394539 616.339454 Error 22 292.956067 13.316185 Corrected Total 32 F Value Pr > F 46.28 F HCP2 10 6163.394539 616.339454 46.28 F 10 1702.384685 170.238468 10.01 F CDP1 10 1702.384685 170.238468 10.01 F Model 178.8207833 35.7641567 5.24 0.0088 Error 12 81.8926667 Corrected Total 17 260.7134500 Source 6.8243889 R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.685890 10.69751 2.612353 13.97167 DF Anova SS 22 Mean Square F Value Pr > F DN3 VONG UC CHE NAM DN3 178.8207833 35.7641567 21:52 Thursday, July 29, 2016 5.24 0.0088 23 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 6.824389 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 4.6474 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N DN3 A 20.723 1(L5) B 14.500 3(LN2-5) 12.723 4(LN2-7) 12.110 6(LN3-7) 11.997 2(L6) 11.777 5(LN3-5) B B B B B B B B 23 DN2: VONG UC CHE NAM DN2 21:52 Thursday, July 29, 2016 25 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values DN2 ONG UC CHE NAM DN2 6 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 21:52 Thursday, July 29, 2016 26 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF Model Source DN2 Squares 122.1141611 Mean Square F Value 24.4228322 2.59 Error 12 113.3172000 Corrected Total 17 235.4313611 Pr > F 0.0824 9.4431000 R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.518683 10.00231 3.072963 12.80278 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 122.1141611 24.4228322 2.59 0.0824 VONG UC CHE NAM DN2 21:52 Thursday, July 29, 2016 27 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 24 12 9.4431 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 5.4668 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N DN2 A 18.223 1(L5) 13.557 3(LN2-5) 12.110 5(LN3-5) 11.390 6(LN3-7) 10.777 2(L6) 10.760 4(LN2-7) A B A B B B B B B B B 25 CDP1: VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 33 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels CDP1 Values Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 34 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 292.3496444 58.4699289 18.24 F 292.3496444 58.4699289 18.24 F Model 66.6432444 13.3286489 0.78 0.5830 Error 12 205.1190000 17.0932500 Corrected Total 17 271.7622444 Source CDP2 R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.245226 10.88958 4.134398 13.38444 DF Anova SS Mean Square 66.64324444 VONG UC CHE NAM CDP2 F Value 13.32864889 Pr > F 0.78 0.5830 21:52 Thursday, July 29, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 28 12 17.09325 2.17881 7.355 39 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CDP2 A 17.277 1(L5) 13.943 3(LN2-5) 13.090 6(LN3-7) 12.720 4(LN2-7) 11.890 5(LN3-5) 11.387 2(L6) A A A A A A A A A A 29 HCP2: VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels HCP2 Values Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF Squares Mean Square Model 40.53496111 8.10699222 Error 12 44.08193333 3.67349444 Corrected Total 17 84.61689444 Source HCP2 F Value Pr > F 2.21 0.1213 R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.479041 10.49861 1.916636 13.21944 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 40.53496111 8.10699222 2.21 0.1213 VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 30 12 3.673494 2.17881 3.409 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N HCP2 A 15.947 1(L5) 13.613 4(LN2-7) 13.590 3(LN2-5) 13.113 5(LN3-5) 11.667 2(L6) 11.387 6(LN3-7) A B A B A B A B A B A B B B B  Chạy tương tự với nhóm cơm mẻ cảu chủng Lactobacillus spp nhóm Bacillus spp với nấm khác 31 ... Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: 35 2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa lớp chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: ... 3.1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 47 3.2 Khảo sát tăng trưởng nấm mốc: 48 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria đường vi khuẩn chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng. .. nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa lớp chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc 81 3.6 So sánh khả đối kháng nấm mốc 20 chủng vi khuẩn