ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HÀ ĐĂNG CHIẾN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên, 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 22 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Lê Văn Sơn Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Hà Đăng Chiến 33 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS LÊ VĂN SƠN tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình triển khai, nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy, Cô giáo – Các nhà khoa học trực tiếp giảng dạy truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô, đồng nghiệp bạn bè tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Tơi ln trân trọng biết ơn giúp đỡ Tơi xin chân thành cảm ơn anh, chị cán nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán sở đào tạo thuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Hà Đăng Chiến 55 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu bp Tên tiếng Anh Base pairs CS Tên tiếng Việt Cặp bazơ nitơ Cộng DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate E.coli Escherichia coli EtBr Ethidium bromide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GP5 Glycoprotein IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside kb Kilo base kDa Kilodalton LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MES 2-(N-morpholino)etansulfonic acid OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PRRS Porcine Reproductive and Hội chứng rối loại hô hấp Respiratory Syndrome sinh sản lợn Porcine Reproductive and Virus gây hội chứng rối loại Respiratory Syndrome virus hô hấp sinh sản lợn PRRSV RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate 66 TAE Tris-acetate-EDTA TBS Tris-buffered saline TTBS Tween tris-buffered saline v/p X-gal Vòng/ phút 5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta-D-galacto-pyranoside Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 66 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC vi DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG ix MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu: 3.Nội dung nghiên cứu: Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan PRRS 1.1.1 Khái niệm PRRS .4 1.1.2 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 1.1.3 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRSV) 10 1.2 Protein tái tổ hợp 15 1.2.1 Giới thiệu .15 1.2.2 Glycoprotein (GP5) .15 1.2.3 Sản xuất protein tái tổ hợp dựa ORF5 16 77 1.2.4 Phương pháp nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp 17 88 1.2.5 Vector biểu pET 32a(+) chủng biểu BL21 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.2 Hóa chất mơi trường .22 2.1.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm .23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Tạo dòng gen GP5 .24 2.2.2 Tạo vector tái tổ hợp mang gen GP5 25 2.2.3 Phương pháp biểu tinh protein GP5 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 34 3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 37 3.3 Biểu tinh protein GP5 E.coli 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 Kết luận 44 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen virus PRRS 13 Hình 1.2 Cấu tạo phân tử virion 15 Hình 2.1 Vector tách dòng pBT 20 Hình 2.2 Cấu trúc vector biểu pET 32a(+) 21 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc mang plasmid pBT-GP5 35 Hình 3.2 Kết qủa điện di sản phẩm colony- PCR khuẩn lạc mang gen GP5 35 Hình 3.3 Kết cắt kiểm tra tinh pBT-GP5 36 Hình 3.4 Kết cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) với enzyme cắt giới hạn 38 Hình 3.5 Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn39 Hình 3.6 Kết điện di SDS-PAGE 40 Hình 3.7 Kết phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag 41 Hình 3.8 Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sản phẩm 42 Hình 3.9 Kết điện di kiểm tra GP5 tinh sắc ký lực NiNTA 44 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tên thiết bị thí nghiệm 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 26 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) 26 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối gen 27 Bảng 2.7 Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE) 31 53 Biểu protein GP5 Quy trình ni cấy biểu gen tiến hành theo mô tả phần vật Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 54 liệu, phương pháp Theo lý thuyết GP5 biểu số lượng lớn dạng protein dung hợp với Trx (gọi tắt TrxGP5) protein tạo thành có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa Dịch nuôi chứa E.coli BL21 mang vector pET 32a(+)/GP5 nuôi o 16 tiếng sau tiếp tục ni biểu môi trường LB lỏng 30 C có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ 0.5 mM Kết sau điện di SDS-PAGE (hình 3.6) cho thấy phân đoạn 43 kDa, Phân đoạn không xuất mẫu đối chứng cảm ứng IPTG Hình 3.6 Kết điện di SDS-PAGE M: Thang chuẩn hãng Thermo Giếng 1: E.coli BL21mang plasmid tái tổ hợp pET32/TrxGP5 Giếng DC: E.coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) (đối chứng) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 55 Tế bào E coli BL21 mang vector pET 32a(+) không chứa gen ngoại lai nên khơng có protein tái tổ hợp (đối chứng âm) Trên điện di (Hình 3.6) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 56 giếng (E coli BL21 mang pET32/TrxGP5) có vạch protein khối lượng khoảng 43 kDa đậm tương ứng với kích thước TrxGP5 mà đường chạy đối chứng khơng có Trong giếng số E.coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) không mang gen GP5 nên khơng thấy xuất vạch vị trí có kích thước 43 kDa Do đó, khẳng định protein tái tổ hợp TrxGP5 tổng hợp tế bào E coli có kích thước với kích thước lý thuyết có hàm lượng lớn Để tiến hành tinh chế protein cần phải phá vỡ lượng lớn tế bào nhằm thu protein tổng số loại bỏ thành phần không cần thiết Kiểm tra biểu protein tái tổ hợp Western blot Để xác định protein, biểu tinh GP5/His-tag, tiến hành kỹ thuật lai Western blot sử dụng kháng thể kháng trình tự His-tag với nồng độ pha loãng 1:1000 lần Kết cho thấy dịch chiết tế bào thu băng protein có kích thước 43kDa (hình 3.7) Chứng tỏ GP5 biểu thành công tế bào E.coli BL21 Kết việc sử dụng cột sắc ký lực Ni-NTA cho phép tinh protein tái tổ hợp GP5 Hình 3.7 Kết phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag (pha loãng 1:1000 lần) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 57 M: thang chuẩn hãng Thermo 1: phân đoạn thu mẫu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 58 (-) đối chứng âm Khảo sát nồng độ imidazol để tinh chế protein tái tổ hợp Cột tinh chế protein thiết kế có giá thể gắn với ion kim loại Ni 2+ nhờ phức hợp cua, ion có lực lớn với vòng imidazol histidine Khi cho protein tổng số qua cột, protein có chứa amino acid 2+ histidine giữ lại cột tương tác imidazol - Ni , protein khơng chứa vòng imidazol histidine khỏi cột Ái lực ion kim loại protein mạnh hay yếu phụ thuộc vào protein có nhiều histidine khơng histidine có nằm sát hay khơng Nếu protein có nhiều histidine histidine nằm gần liên kết chúng với ion kim loại mạnh Vector biểu pET 32a(+) thiết kế cho sau dịch mã protein tái tổ hợp có mang histidine (hexa histidine) nên chúng có lực 2+ cao với ion Ni Khi cho mẫu chứa protein tổng số qua cột protein khơng có chứa histidine khỏi cột, lúc cột 2+ protein có histidine liên kết với ion Ni Nhưng mức độ liên kết lại khác protein chứa nhiều amino acid histidine liên kết với ion kim loại mạnh ngược lại Hình 3.8 Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sản phẩm Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 59 (+): đối chứng dương; M: thang chuẩn hãng Thermo Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 60 Giếng 1: 20 mM imidazol; giếng 2: 40 mM imidazol; giếng 3: 60 mM imidazol; giếng 4: 80 mM imidazol; giếng 5: 100 mMimidazol Khảo sát nồng độ imidazol mức 20mM đến 100mM thấy, nồng độ 100mM imidazole thu băng sang đậm Chúng lựa chọn nồng độ 100 mM imidazol thu lượng protein tái tổ hợp lớn, tốn hóa chất dễ dàng để loại muối thẩm tách Tinh protein tái tổ hợp GP5 Do protein nằm pha dịch tế bào nên sau siêu âm phá tế bào tiến hành ly tâm loại bỏ phần xác tế bào lắng xuống, thu lấy phần dịch cho trực tiếp qua cột sắc ký lực Ni-NTA Do GP5 biểu hệ thống vector hiểu pET 32a(+) nên protein tạo dung hợp với trình tự gồm amino acid histidine Trình tự His-tag giúp protein tái tổ hợp kết bám vào cột sắc ký, protein khác bị loại bỏ băng dung dịch rửa chứa Imidazol 100 mM Kết thu điện di SDS-PAGE cho thấy protein GP5 tái tổ hợp thu lại dạng tinh sạch, có kích thước 43 kDa, tương ứng với kích thước tính tốn lý thuyết Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 61 Hình 3.9 Kết điện di kiểm tra GP5 tinh sắc ký lực Ni-NTA Kết điện di SDS-PAGE GP5 tinh M: Thang chuẩn hãng Thermo Giếng 1: GP5 tinh imidazol 100 mM Giếng 2: đối chứng (+) Giếng 3: đối chứng (-) Trên hình 3.9 cho thấy với nồng độ 100 mM imidazol protein tái tổ hợp thu với lượng lớn tinh Như thấy, để tinh chế protein TrXGP5 dùng imidazol với nồng độ 100 mM KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Gen GP5 tạo dòng thành cơng - Vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5 thiết kế - Protein tái tổ hợp GP5 biểu tinh cột sắc ký lực Ni-NTA với kích thước 43 kDa Kiến nghị Với kết thu trên, đưa số định hướng nghiên cứu sau: - Tiếp tục thử nghiệm protein tái tổ hợp làm làm nguyên liệu để sản xuất hợp chất có dược tính sinh học vaccine hệ - Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên GP5 để tạo kháng thể đặc hiệu nhằm chuẩn đốn nhanh bệnh dịch PRRSV Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Tiêu Quang An, Nguyễn Hữu Nam (2011), “ Xác định số vi khuẩn kế phát gây chết lợn vùng dịch lợn Tai xanh huyện Văn Lâm tỉnh Hưng Yên năm 2010”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(3), tr 56- 64 Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Ngọc Tiến (2008), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (Bệnh Tai xanh), Nxb Nông nghiệp - Hà Nội, tr 7- 21 Đặng Xuân Bình, Nguyễn Thị Kim Dung, Nguyễn Thị Hà, Lê Bá Hiệp (2010), “Khảo sát lưu hành vi khuẩn Pasteurella multocida gia súc số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 17(2), tr 53- 57 Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Tùng, Nguyễn Đăng Thọ, Tống Hữu Hiến (2011), “Điều tra lưu hành Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) đàn lợn số tỉnh Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr 21-30 Cục Thú y (2008), Báo cáo chẩn đoán nghiên cứu virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Việt Nam từ tháng 3/2007 đến 5/2008, Hội thảo khoa học phòng chống Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Nguyễn Tiến Dũng (2011), “Những vấn đề thời Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr 5- 11 Đậu Ngọc Hào, Văng Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang Ân (2008), “Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn từ cuối tháng đến đầu tháng 7/2008 môt số tỉnh nước”, Khoa học kỹ thuật thú y, 15(5), tr 14-20 46 Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam (2013), “Nghiên cứu chọn chủng virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) để sản xuất vaccine phòng bệnh Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 20(1), tr 5-15 Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hương, Trần Quang Vui, Phạm Cơng Hoạt, Nguyễn Bá Hiên (2009), “ Phân tích gen M mã hóa protein màng vỉus gây PRRS Việt Nam so sánh với chủng Trung Quốc, giới”, Tạp chí Khoa học phát triển, 7(3), tr 282- 290 10 Lý Thị Liên Khai, Võ Thị Cẩm Giàng (2012), “Khảo sát tình hình nhiễm ghép Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản với dịch tả heo tỉnh Bạc Liêu Sóc Trăng”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 19(6), tr 2939 11 Phạm Ngọc Thạch (2007), Một số tiêu lâm sàng, tiêu máu lợn mắc Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (bệnh Tai xanh) số đàn lợn tỉnh Hải Dương Hưng Yên, Hội thảo khoa học Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản bệnh liên cầu gây lợn 10/2007, Trường Đại học Nông nghiệp, Hà Nội, tr 25-34 12 Khuất Hữu Thanh (2006), Kĩ thuật gen - nguyên lý ứng dụng, NXB KHKT, Hà Nội 13 Tô Long Thành (2007), “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 14 (3), tr 81-88 14 Nguyễn Như Thanh (2007), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản, Hội thảo PRRS bệnh liên cầu khuẩn gây lợn tháng 10/2007, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 15 Cao Văn Thật, Trần Thị Dân, Trần Thị Bích Liên, Thái Quốc Hiếu, Nguyễn Văn Hân, Hồ Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Mến (2012), “Mức độ 47 nhiễm virus PRRS ảnh hưởng nhiễm ghép PRRSV-Leptospira lên suất sinh 47 sản heo nái tỉnh Tiền Giang”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 19(6), tr 17- 23 16 Nguyễn Ngọc Tiến (2011), “Tình hình dịch lợn Tai xanh (PRRS) Việt Nam cơng tác phòng chống dịch”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr 12- 20 17 William T.Christianson, Han Soo Joo (2001), “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, (2), tr 74- 87 Tài liệu tiếng Anh 18 Albina E., Madec F., Cariolet R., Torrison J (1994), “Immune response and persistence of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected pigs and farm units”, Vet Rec 134, pp 567-573 19 Alasdair D I., Bruun R T (2000), Promoter, patent WO 0078975 20 Anonymous (1992), “Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS or blue-eares pig disease)”, Vet Rec 130, pp 87-89 21 Ansari I H., Kwon B., Osorio F.A., Pattnaik A K (2006), “Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respirattory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies”, J Virol 80, pp 3994-4004 22 Collins J E., Benfield D A., Christianson W T., Harris L., Hennings J C., Shaw D P., Goyal S M., McCullough S., Morrison R B., Joo S H., Gorcyca D., Chladek D (1992), “Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR- 2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs”, J Vet Diagn Invest 4, pp 117- 126 48 23 Han J., Wang Y., Faaberg K S (2006), “ Complete genome analysis of RFLP 184 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Virus Research 122(1-2), pp 175-183 24 Jiang W., Jiang P., Wang X., Li Y., Tang J., Wang X., Ma S (2006), “Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice” Vet Immunol Immunopathol 113, pp 169-180 25 Jiang W., Jiang P., Wang X., Li Y., Wang X., Du Y (2007), “Influence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 glycoprotein Nlinked glycans on immune responses in mice” Virus Genes 35, pp 663671 26 Kegong Tian, Yu X (2007), Emergence of Fatal PRRSV Varants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark, PloS ONE 2(6) International PRRS Symposium 27 Lin P K T., Brown D.M (1992), “Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing deGenrate bases and their use as primers in the Polymerase chain reaction”, Nucleic Acids Res 19, pp 5149-5152 28 Meulenberg J J., Petersen den Besten A., de Kluyver E., van Nieuwstadt A., Wensvoort G and Moormann RJ., (1997), “Molecular characterization of Lelystad virus”, Vet Microbiol 55, pp 197 – 202 29 Montpetit M L., Cassol S., Salas T., and O'Shaughnessy M V (1992), “OLIGOSCAN: A computer program to assist in the design of PCR primers homologous to multiple DNA sequences”, J Virol Methods 36, pp 119-128 30 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular cloning a Laboratory Manual, 3rd, ed Cold spring harbor laboratory press, cold springhabor NY 49 31 Wensvoort G., Terpstra C., Pol J M A (1991), “Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus”, The Veterinary Quarterly, Vol 13, pp 121-130 Internet 32 http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi 33.Nguyen Van D., Ken I., Phan Xuan T (2010), Nucleotide Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, GeneBank databases Acc No HQ540655, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/311909479, ngày 17/10/2010 34 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Hội_chứng_rối_loạn_sinh_sản_và _hô_hấp_ở_lợn_(PRRSV) ... tinh protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) vius gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRSV) Mục đích nghiên cứu: - Thiết kế vector biểu protein tái tổ hợp GP5 - Biểu tinh protein tái tổ hợp. .. 1.1.2 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 1.1.3 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRSV) 10 1.2 Protein tái tổ hợp 15 1.2.1 Giới thiệu .15 1.2.2 Glycoprotein. .. trùng hợp PRRS Porcine Reproductive and Hội chứng rối loại hô hấp Respiratory Syndrome sinh sản lợn Porcine Reproductive and Virus gây hội chứng rối loại Respiratory Syndrome virus hô hấp sinh sản