MỞ ĐẦU Ung thư bệnh có tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao đứng thứ hai giới với 200 loại ung thư khác Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp Việt Nam vị trí 78 172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong 110/100.000 người, nằm 50 nước thuộc nhóm đồ ung thư giới Tuy nhiên, phần lớn bệnh nhân mắc bệnh ung thư Việt Nam đến khám điều trị giai đoạn khối u chuyển thành ác tính di nên tỷ lệ chữa khỏi bệnh thấp, chi phí điều trị tốn Hiện nay, việc khám chữa bệnh ung thư bệnh viện chủ yếu dựa vào phương pháp truyền thống siêu âm, chụp cộng hưởng từ sinh thiết Kết phương pháp phụ thuộc vào kích thước đặc tính khối u nên thường phát bệnh giai đoạn phát triển không hiệu phát ung thư giai đoạn sớm Các dấu khối u thường sinh từ tế bào ung thư biểu mô có nồng độ cao mức người bình thường Các dấu khối u xác định kỹ thuật truyền thống ELISA, PCR, miễn dịch phóng xạ (RIA), phổ huỳnh quang, phổ khối sắc kí Các kỹ thuật cho phép phát dấu khối u với độ xác độ chọn lọc cao; nhiên yêu cầu thời gian phân tích lâu, chi phí hóa chất cao, phân tích đơn lẻ chất dấu Cảm biến sinh học điện hóa với ưu điểm độ nhạy độ chọn lọc cao, thời gian phân tích ngắn, cho phép phát chất cần phân tích nồng độ thấp, đơn giản rẻ tiền, khả tích hợp thiết bị đo cầm tay ứng dụng phép phân tích chỗ phương pháp ưu tiên lựa chọn để phát dấu khối u Chính vậy, tác giả định chọn đề tài “Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ nhạy cao sử dụng điện cực in bon ứng dụng chẩn đoán bệnh sớm” Mục tiêu nghiên cứu luận án: (1) Phát triển cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa sử dụng điện cực in lưới thương mại với chi phí thấp hướng đến ứng dụng thực tế thiết bị cầm tay (2) Cải tiến phát triển kỹ thuật biến tính bề mặt điện mực in bon nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học tăng cường đáp ứng tín hiệu cảm biến phổ tổng trở điện hóa (3) Chế tạo cảm biến sinh hóa điện hóa có độ nhạy độ chọn lọc cao phát dấu khối u (bao gồm kháng nguyên α-hCG, PSA, AFP) ứng dụng chẩn đoán sớm số bệnh ung thư cảm biến điện hóa enzyme xác định glucose máu Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu luận án phương pháp nghiên cứu thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án: - Về lý luận khoa học: kết thu luận án góp phần làm sáng tỏ chế hoạt động cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên (kháng thể) đầu thu sinh học bán tổng hợp aptamer - Về thực tiễn: kết nghiên cứu luận án hướng tới phát triển cảm biến sinh học có cấu trúc đơn giản, giá thành thấp, thời gian phân tích ngắn, độ nhạy độ chọn lọc cao, cho phép phát dấu khối u giai đoạn sớm bệnh Cảm biến sinh học chế tạo có định hướng ứng dụng thiết bị cầm tay đáp ứng yêu cầu xét nghiệm chỗ Những đóng góp luận án: Luận án đóng góp kết cơng nghệ chế tạo hạt nano vàng phân tán bề mặt điện cực in lưới mực in bon nhằm thay điện cực in lưới mực in vàng Hơn giải pháp công nghệ giúp phân tán đầu thu sinh học bề mặt điện cực, nhờ nâng cao hiệu suất bắt cặp đầu thu dấu sinh học cần phân tích Luận án đóng góp ba giải pháp biến tính bề mặt điện cực in lưới mực in bon hệ vật liệu nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học đáp ứng tín hiệu cảm biến phổ tổng trở điện hóa Hệ vật liệu bao gồm: (i) Polyme dẫn đồng trùng hợp polypyrrole-polypyrrole cacboxyl (PPy-PPa); (ii) Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều polyme đồng trùng hợp PPy-PPa ơxít graphene dạng khử điện hóa (erGO); (iii) Vật liệu lai poly(para-aminothiophenol) hạt nano vàng Ứng dụng thành công đầu thu sinh học bán tổng hợp aptamer chế tạo cảm biến phổ tổng trở điện hóa xác định dấu ung thư tiền liệt tuyến Kết nghiên cứu tiền đề cho định hướng nghiên cứu cảm biến phổ tổng trở điện hóa phát dấu sinh học với chi phí thấp, không yêu cầu điều kiện bảo quản nghiêm ngặt Ứng dụng thành công cấu trúc đa lớp vật liệu polyme ơxy hóa-khử Osmium enzyme cảm biến cảm biến điện hóa enzyme hệ thứ Kết nghiên cứu tiền đề cho định hướng nghiên cứu cảm biến điện hóa đo dòng phát dấu sinh học sở tác nhân sinh học enzyme Xây dựng quy trình chế tạo quy mơ phòng thí nghiệm 06 cảm biến điện hóa sử dụng điện cực in lưới mực in bon cho phép xác định nồng độ dấu khối u ngưỡng phát sớm bệnh ung thư (ung thư u tế bào mầm tinh, ung thư tiền liệt tuyến ung thư gan) Các cảm biến chế tạo có độ nhạy độ chọn lọc cao, yêu cầu lượng mẫu phân tích nhỏ (cỡ 3µL), thời gian phân tích nhanh (khoảng 30 phút), thao tác đơn giản, có khả tích hợp với thiết bị cầm tay Bố cục luận án: Chương Cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng chẩn đốn bệnh sớm Chương Thực nghiệm phương pháp nghiên cứu Chương Cảm biến miễn dịch phát dấu α-hCG ứng dụng chẩn đoán u tế bào mầm tinh Chương Cảm biến aptamer phát dấu PSA ứng dụng chẩn đóa ung thư tiền liệt tuyến Chương Cảm biến miễn dịch phát dấu AFP ứng dụng chẩn đoán ung thư gan Chương Cảm biến điện hóa glucose CHƯƠNG CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HĨA ỨNG DỤNG CHẨN ĐỐN BỆNH SỚM 1.1 Cảm biến sinh học Theo Hiệp hội Quốc tế Hóa học Hóa học ứng dụng (IUPAC – Internatonal Union of Pure and Applied Chemistry), cảm biến sinh học (biosensor) thiết bị tích hợp có khả cung cấp thơng tin, phân tích định lượng bán định lượng chất cần phân tích thơng qua việc sử dụng đầu thu sinh học cố định lên phận chuyển đổi tín hiệu [101, 168] Cấu tạo cảm biến sinh học bao gồm ba phần chính: đầu thu sinh học, phận chuyển đổi phận xử lý đọc tín hiệu 1.2 Cảm biến sinh học điện hóa Cảm biến sinh học điện hóa cảm biến hoạt động dựa nguyên tắc chuyển đổi tín hiệu tương tác sinh học thành tín hiệu điện hệ điện hóa (tín hiệu dòng, tín hiệu điện áp, tín hiệu độ dẫn, tín hiệu tổng trở) [123, 263] Cảm biến loại có ưu điểm thời gian đáp ứng nhanh, độ nhạy độ chọn lọc cao ứng dụng phép phân tích y sinh y tế, cơng nghệ sinh học thực phẩm kiểm sốt thơng số mơi trường [24, 188, 207] Cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa dựa nguyên tắc nhận biết tương tác sinh học xảy bề mặt điện cực làm thay đổi trở kháng phức hệ điện hóa Phép đo phổ tổng trở khảo sát dung dịch điện ly có cặp chất ơxy hóa-khử gọi phổ tổng trở Faradaic (EIS faradaic); dung dịch điện ly khơng có cặp chất ơxy hóa-khử gọi phổ tổng trở không Faradaic (EIS nonfaradaic) [31] Mơ hình mạch tương đương Randles áp dụng hệ điện hóa khảo sát dung dịch điện ly có cặp chất ơxy hóa-khử, bao gồm thành phần Rs điện trở dung dịch điện ly, Rct điện trở truyền điện tích, Cdl điện dung lớp kép, trở kháng Warburg ZW 1.2.1 Điện cực điện hóa mm (a) (b) Tiếp xúc thiết bị Điện cực làm việc cácbon (2,64 mm2) Vùng mặt nạ không thấm nước Điện cực đối 12,5 mm Điện so sánh Ag/AgCl Điện cực làm việc vàng (3,67 mm2) Hình 1.18 Điện cực in lưới màng dày hãng BioDevice Technology (Nhật Bản) (a) điện cực làm việc mực in bon; (b) điện cực làm việc mực in vàng Điện cực in lưới màng dày có nhiều ưu điểm như: giá thành thấp, cho phép sản xuất hàng loạt, thiết kế linh hoạt, độ lặp lại cao, nguồn nguyên liệu phong phú Điện cực làm việc sử dụng mực in cácbon hay kim loại (vàng platin), điện cực so sánh sử dụng mực in Ag/AgCl Mực in cácbon với ưu điểm dòng phơng thấp giá thành rẻ khả tương thích sinh học cao nên lựa chọn cảm biến sinh học [151] 1.2.2 Phân loại cảm biến sinh học điện hóa 1.2.2.1 Cảm biến đo dòng 1.2.2.2 Cảm biến đo điện 1.2.2.3 Cảm biến đo độ dẫn 1.2.2.4 Cảm biến đo phổ tổng trở 1.3 Ung thư số điểm khối u 1.3.1 Chỉ dấu hCG ung thư tế bào mầm tinh hCG (Human chorionic gonadotropin) thuộc họ nội tiết glycoprotein sản sinh từ cộng bào nuôi thai tế bào mầm khối u [31] Nồng độ hCG người bình thường nam nữ không mang thai nằm khoảng ÷ mIU/mL; phụ nữ tiền mãn kinh thấp 9,5 mIU/mL Khi nồng độ dấu hCG tăng bệnh nhân mắc bệnh lý liên quan đến u nuôi thời kì thai nghén nữ, u tế bào mầm xuất quan sinh dục nam nữ [12, 18, 68, 153] 1.3.2 Ung thư tiền liệt tuyến kháng nguyên PSA PSA glycoprotein mã hóa gen KLK3 (Kallikrein-3) tiết tế bào biểu mô tuyến tiền liệt bình thường mơ bướu [14, 128] Nồng độ PSA huyết thường thấp ng/mL gia tăng ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) số bệnh lý khác phì đại tuyến tiền liệt, viêm tuyến tiền liệt Giá trị nồng độ PSA nằm “vùng xám” có giá trị từ đến 10 ng/mL có nguy mắc UTTLT 1.3.3 Chỉ dấu sinh học AFP ung thư gan nguyên phát AFP dấu sinh học ứng dụng chẩn đoán điều trị ung thư gan nguyên phát Người bình thường có AFP thấp 10 ng/mL AFP tăng cao phần lớn bệnh nhân ung thư gan nguyên phát bệnh viêm gan siêu vi Ở người có khối u bướu gan mà khơng có bệnh lý gan trước đó, ngưỡng AFP tăng cao 100 ng/mL có giá trị chẩn đốn ung thư gan ngun phát 1.4 Nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát dấu khối u CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp điện hóa 2.1.1 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) Phổ tổng trở điện hóa cơng cụ hiệu cho phép nghiên cứu tượng hóa lý xảy bề mặt phân chia rắn-lỏng Nguyên lý EIS dựa việc phân tích trở kháng phức thu nhận đặt điện áp xoay chiều lên hệ điện hóa với tần số thay đổi liên tục từ giá trị cao đến thấp Ưu điểm cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở điện áp đặt điện cực nhỏ nên khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính thành phần sinh học Phổ trở kháng phức thực nghiệm mơ mơ hình mạch tương đương Randles 2.1.2 Phương pháp quét tuần hoàn (CV) Nguyên lý phương pháp CV áp đặt điện biến đổi tuần hoàn lên điện cực làm việc ghi lại dòng tuân theo định luật Nernst Phương pháp cho phép điều khiển trình phản ứng điện hóa thơng qua thơng số điện áp, tốc độ quét Trong nội dung luận án, tác giả sử dụng phương pháp CV để tổng hợp hạt nano vàng điện cực SPCE, tổng hợp vật liệu polyme, khử điện hóa graphene oxít điện cực SPCE Ngồi ra, phương pháp CV giúp cho việc phân tính tính chất lớp vật liệu polyme biến tính bề mặt điện cực đánh giá tương tác kháng nguyên – kháng thể thông qua việc xác định thông số đặc trưng Epa, Epc, Ipa, Ipc 2.2 Phương pháp khảo sát tính chất hình thái học vật liệu 2.3 Công nghệ vi lưu ly tâm 2.3.1 Giới thiệu 2.3.2 Thiết kế quy trình chế tạo chíp vi lưu ly tâm Chíp vi lưu ly tâm kiểu cấu trúc van xi phông phương pháp khuôn đúc sử dụng vật liệu polydimethylsiloxane (PDMS) ứng dụng kết hợp với điện cực thương mại hãng DropSens mã DRP-110 DRP-AUTR10 Việc thu nhỏ kích thước buồng phản ứng giảm đáng kể lượng dung dịch hóa chất mẫu phân tích tiêu hao từ 100 µL phương pháp nhỏ giọt giảm xuống µL Tấm cố định Chip vi lưu Điện cực Giá đỡ Hình 2.8 Thiết kế giá đỡ gắn với trục quay máy ly tâm: a) Thứ tự lắp ghép chíp vi lưu điện cực; b) Vị trí bốn hệ chíp vi lưu-điện cực cố định đồng thời giá đỡ 2.4 Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến 2.4.1 Tổng hợp hạt nano vàng điện cực làm việc SPCE Tiến hành tổng hợp hạt nano vàng điện cực SPCE phương pháp quét tuần hoàn Tiến hành nhỏ 35 µL dung dịch HAuCl4 100 µM pha dung dịch đệm PBS 100 mM lên bề mặt SPCE cho bao phủ điện cực (bao gồm Ag/AgCl, điện cực đối điện cực làm việc) Tiến hành quét tuần hoàn từ -0,6 V ÷ +0,5 V vs Ag/AgCl, tốc độ quét 50 mV/s bước nhảy 10 mV 2.4.2 Màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) alkanethiol - Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (MHDA): Axít 16-mercaptohexadecanoic (MHDA) axít hữu chuỗi mạch dài gồm 16 nguyên tử bon, có đầu nhóm cacboxyl (-COOH) đầu lại nhóm thiol (-SH) Ngâm tồn phần điện cực làm việc cảm biến 100 µL dung dịch MHDA nồng độ mM phân tán dung mơi ethanol nhiệt độ phòng 12 Sau bước bề mặt điện cực hình thành màng SAM có nhóm chức cacboxyl hướng lên bề mặt - Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (p-ATP): Phân tử p-ATP có cấu trúc mạch vòng benzen có gắn nhóm chức thiol (-SH) nhóm chức amin (-NH2) vị trí para Điện cực làm việc cảm biến ngâm 100 µL dung dịch p-ATP nồng độ 25 mM phân tán dung mơi ethanol ủ nhiệt độ phòng khoảng thời gian từ đến 24 Như vậy, sau bước bề mặt điện cực cảm biến hình thành màng SAM có nhóm amin hướng lên bề mặt 2.4.3 Tổng hợp vật liệu polyme phương pháp trùng hợp điện hóa 2.4.3.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa 2.4.3.2 Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều polyme đồng trùng hợp PPyPPa erGO 2.4.3.3 Vật liệu lai poly(p-ATP) hạt nano vàng 2.4.4 Cố định đầu thu sinh học liên kết cộng hóa trị 2.4.4.1 Liên kết cộng hóa trị thơng qua nhóm amin đầu thu sinh học Hình 2.11 Cơ chế phản ứng tạo liên kết nhóm amin (NH2) đầu thu sinh học nhóm cacboxyl (-COOH) bề mặt điện cực sử dụng hợp chất NHS EDC [260] 2.4.4.2 Liên kết cộng hóa trị thơng qua nhóm cacboxyl đầu thu sinh học Hình 2.12 Cơ chế phản ứng tạo liên kết nhóm cacboxyl (-COOH) kháng thể nhóm amin (NH2) bề mặt điện cực sử dụng EDC [260] 2.5 Khảo sát hoạt động cảm biến phổ tổng trở điện hóa Bước Chuẩn bị mẫu dấu sinh học cần phân tích Bước Phản ứng đặc hiệu đầu thu sinh học dấu sinh học phân tích Bước Khảo sát phổ tổng trở điện hóa Vật liệu biến tính điện cực SPCE Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM Vật liệu polyme Mơ hình Mạch điện tương đương Rs , Rct , Z C = Cdl C Warburg dl Rs Rct ZW CPE Warburg Phẩn tử mạch điện Rct ZW 2.6 Quy hoạch số liệu thực nghiệm ZW = j Cdl , ( j )1/ W Rs , Rct , Z CPE = CPE Rs ZW = 1 ( j ) Q ( j )1/ W n , CHƯƠNG CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH 3.1 Mở đầu 3.2 Thực nghiệm (a) (b) Hình 3.1 (a) Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM MHz ghép nối với tạo dao động QCM25 hãng Stanford Research Systems, (b) Hệ thiết bị khảo sát hoạt động QCM chế độ đo động (b) (a) (c) Hình 3.2 (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in vàng, (b) Điện cực mực in vàng SPAuE hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa AutoLab PGSTAT 12 3.2.3 Quy trình cố định mAb α-hCG điện cực vàng OH OH O S S OH O S SPAuE S O S O N O OH OH O OO N O O O (EDC) R1-N=C=N-R2 (NHS) S S O O N OO N OO N O O O O S SPAuE O S O S O O N O NH O O -NH2 (Kháng thể) Cố định kháng thể S S O NH O S SPAuE O N O O O S O S NH NH O (Ethanolamine) Loại bỏ liên kết không đặc hiệu NH O S S NH O S NH O S NH O O S SPAuE Hình 3.3 Quy trình cơng nghệ cố định mAb α-hCG lên điện cực vàng thông qua màng SAM 3.2.4 Khảo sát hoạt động cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA)/QCM Cảm biến dựa linh kiện QCM khảo sát chế độ đo pha lỏng động, độ dòng chảy dung dịch mL/giờ, độ pH dung dịch đo 7,4 [64] Sự suy giảm tín hiệu tần số cộng hưởng linh kiện QCM ghi nhận trình bơm dung dịch Thời gian cho phép phân tích khảo sát tương tác kháng nguyên-kháng thể 80 phút 3.2.5 Khảo sát hoạt động cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA) /SPAuE Cảm biến tiến hành đo phổ trở kháng phức dung dịch gồm có 0,1 M KCl mM [Fe(CN)6]3-/4- dải tần số từ 100 kHz đến 50 mHz chiều 0,16V xoay chiều 10 -Z (Ω) mV Sử dụng phần mềm khớp (fit) phổ tổng trở với mơ hình mạch tương đương Randles xác định giá trị phần tử mạch Xây dựng đồ thị phụ thuộc giá trị Rct vào nồng độ kháng nguyên α-hCG Khi phản ứng miễn dịch xảy kháng nguyên kháng thể bề mặt điện cực hình R ∆R Z (Ω) thành khối điện mơi cản trở q trình Hình 3.5 Ngun lý hoạt động cảm truyền điện tích đến điện cực, Rct tăng biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa theo lượng kháng nguyên bắt cặp với kháng thể 3.3 Kết thảo luận 3.3.1 Cảm biến miễn dịch nhạy khối lượng mAb α- hCG/SAM(MHDA)/QCM 3.3.1.1 Hiệu suất cố định kháng thể Cdl im RS W ZW RCT [Fe(CN)6]3-/4- [Fe(CN)6]3-/4- [Fe(CN)6]3-/4- [Fe(CN)6]3-/4- e- e- e- S CT re Linh kiện QCM -100 -100 Độ dịch tần số f (Hz) Độ dịch tần số f (Hz) -200 -300 SAM (MHDA)/QCM -400 NHS-EDC/SAM (MHDA)/QCM -500 -200 -300 -400 -500 -600 mAb hCG/NHS-EDC/SAM (MHDA)/QCM -600 -700 10 20 30 Thêi gian (phót) 40 50 10 15 20 25 30 Nồng độ kháng nguyên -hCG (ng/mL) Hỡnh 3.6 dịch tần sau bước chế tạo cảm biến nhạy khối lượng sử dụng QCM MHz Hình 3.8 Đường đặc trưng chuẩn cảm biến nhạy khối lượng Hiệu suất cố định kháng thể đánh giá theo công thức (Nkháng thể/NNHS) x 100%; kết thu 2,88% cao so với nghiên cứu Wang 0,14% [299] Như thấy quy trình cố định kháng thể chúng tơi nghiên cứu hồn toàn phù hợp 3.3.1.2 Đặc trưng chuẩn cảm biến Khảo sát thống kê với 03 cảm biến độc lập với quy trình chế tạo, tần số suy giảm mạnh khoảng nồng độ kháng nguyên từ 100 pg/mL đến 7,0 ng/mL suy giảm không đáng kể nồng độ kháng nguyên tăng khoảng từ 12 đến 27 ng/mL 3.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb α-hCG/SAM(MHDA) /SPAuE 30 25 R (k) = 16,65 + 0,22*C (ng/mL) ct LOD = 9,35 ng/ml 40 (k) 20 50 ct 15 30 R -Z" (k) 60 Nång ®é kháng nguyên -hCG 20 ng/mL 30 ng/mL 100 pg/mL 70 ng/mL ng/mL 100 ng/mL 10 ng/mL 20 10 10 Z' (k) 0 10 20 30 40 50 60 Hình 3.10 Phổ trở kháng phức đáp ứng cảm biến với kháng nguyên α-hCG có nồng độ 0÷100 ng/mL 20 40 60 80 100 Nång độ kháng nguyên -hCG (ng/mL) Hỡnh 3.11 ng c trng chuẩn cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA) /SPAuE Khảo sát với mẫu trắng mẫu cảm biến độc lập ứng với điểm nồng độ Kết cho thấy Rct thay đổi tuyến tính khoảng nồng độ kháng nguyên từ đến 100 ng/mL, giới hạn phát cảm biến 9,35 ng/mL với diện tích điện cực làm việc 3,67 mm2 3.4 Kết luận Tối ưu qui trình cơng nghệ cố định màng kháng thể màng SAM dựa linh kiện QCM Cảm biến nhạy khối lượng hoạt động tốt dải nồng độ thấp sai số nhỏ 5% Cảm biến miễn dịch điện hóa khơng đánh dấu sử dụng điện cực mực in vàng (SPAuE) có giá thành rẻ nhiều so với QCM, yêu cầu lượng nhỏ dung dịch mẫu, dễ tích hợp với thiết bị cầm tay sở cho việc chế tạo cảm biến sinh học sử dụng lần Kết cho thấy cảm biến mAb hCG/MHDA/SPAuE đáp ứng yêu cầu xét nghiệm bệnh liên quan đến dấu α-hCG CHƯƠNG CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN 4.1 Mở đầu 4.2 Thực nghiệm 10 (b) (a) (c) Hình 4.2 (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in bon, (b) Điện cực mực in bon SPCE hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa Vertex Invium 4.3 Kết thảo luận 4.3.1 Cảm biến aptamer phổ tổng trở điện hóa Do DNA aptamer có kích thước nhỏ kháng thể mang điện tích âm nên tín hiệu cảm biến giải thích liên quan đến hai chế xảy đồng thời Đối với cảm biến aptamer tăng hay giảm giá trị Rct phụ thuộc vào chế chiếm ưu [Fe(CN)6]3-/4- [Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4- [Fe(CN)6]3-/4- [Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4- eS AuNP AuNP S SPCE [Fe(CN)6]3-/43-/4- [Fe(CN)6] [Fe(CN)6] OH S S S S S S S [Fe(CN)6] [Fe(CN)6] S S S S OH OH S S S OH S S S S [Fe(CN)6]3-/4e- e- PSA S [Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4- [Fe(CN)6]3-/4- 3-/4- 3-/4- OH S S SPCE (b) 3-/4- S AuNP S OH S S OH S S PSA S S S S S AuNP OH S S S AuNP OH S S S OH S S S OH OH S OH S S e- S S (a) OH S S SPAuE S S S S S S S OH OH S S S S S SPAuE COOH PSA Kháng nguyên PSA; Aptamer; Ethanolamine; S SAM Axit 16-Mercaptohexadecanoic Hình 4.5 Mơ hình q trình động học xảy bề mặt điện cực phép đo trở kháng phức Faradaic sử dụng cặp chất dò [Fe(CN)6] 3-/4-;(a) điện cực SPAuE, (b) điện cực AuNPsSPCE Cơ chế hàng rào tĩnh điện: Aptamer cố định bề mặt điện cực hình thành hàng rào điện âm cản trở điện tử truyền đến bề mặt điện cực Nếu kháng nguyên mang điện tích dương phản ứng với aptamer làm giảm hàng rào tĩnh điện giúp cho chuyển điện tử đến điện cực dễ dàng điện trở Rct giảm [100, 115] Cơ chế hiệu ứng không gian: Khi kháng nguyên liên kết đặc hiệu với aptamer tạo thành khối điện môi bề mặt điện cực, tạo thành vùng không gian cản trở q trình truyền điện tích đến điện cực dẫn tới Rct tăng [39, 57, 108, 175] 11 4.3.2 Cảm biến PSA-Aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE 4.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau bước công nghệ 10 10 PSA-Aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE (b) (d) §iÖn cùc SPCE AuNPs-SPCE SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE Aptamer (5 g/mL)/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE PSA (10 ng/mL)/Aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE -Z''(k) -Z''(k) PSA/aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE §iƯn cùc SPAuE SAM (MHDA)/SPAuE Aptamer (5 g/mL)/SAM (MHDA)/SPAuE PSA (10 ng/mL)/Aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE (c) (b) 2 (d) (e) (a) (c) (a) 0 10 12 14 16 18 20 22 Z'(k) Hình 4.6 Phổ EIS sau bước công nghệ chế tạo cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/SPAuE 10 12 Z'(k) Hình 4.11 Phổ EIS sau bước công nghệ chế tạo cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE Kết phép đo phổ tổng trở cho thấy aptamer cố định thành công bề mặt điện cực thông qua màng SAM MHDA xảy tương tác đặc hiệu aptamer kháng nguyên PSA bề mặt điện cực cảm biến Với điện cực AuNPs-SPCE, hiệu suất cố định aptamer 56% điện cực SPAuE 72% Tuy nhiên, độ nhạy cảm biến cảm biến sử dụng AuNPs-SPCE đạt 73% giá trị đạt 18% cảm biến sử dụng điện cực planar SPAuE Việc sử dụng điện cực AuNPs-SPCE giúp phân tán aptamer tăng hiệu suất bắt cặp aptamer kháng nguyên PSA 4.3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ aptamer lên tín hiệu cảm biến điện cực SPAuE Trên điện cực SPAuE xác suất cố định aptamer điện cực vàng lớn nên hiệu ứng chắn tĩnh điện chiếm ưu Tín hiệu cảm biến thăng giáng không theo quy luận định Đường chuẩn cảm biến khơng đáp ứng u cầu tuyến tính dải nồng độ thuộc “vùng xám” xét nghiệm chẩn đoán UTTLT 12 PSA-aptamer/SAM/SPAuE PSA-aptamer/SAM/SPAuE -1 RCT (k) RCT (k) -2 -5 -3 Nång ®é aptamer cè ®Þnh -10 100 g/mL 50 g/mL g/mL Nång ®é aptamer cố định -4 -15 50 g/mL g/mL -5 10 12 14 16 Nång ®é PSA (ng/mL) 10 12 14 16 Nång ®é PSA (ng/mL) Hình 4.7 Khảo sát phụ thuộc ∆Rct hàm nồng độ PSA cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE với nồng độ aptamer 5, 10, 100 µg/mL 4.3.3 Cảm biến PSA-Aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE 4.3.3.1 Phân tán aptamer AuNP – CVs AuNP – 10 CVs AuNP – 15 CVs AuNP – 20 CVs Hình 4.8 Ảnh SEM bề mặt điện cực SPCE sau tổng hợp hạt nano vàng phương pháp quét vòng với số vòng quét: 5, 10, 15, 20 vòng Hình 4.9 Phổ EDS điện cực AuNPs-SPCE với cac hạt nano vàng tổng hợp phương pháp quét điện tuần hồn 20 chu kỳ 4.3.3.2 Đặc tính điện hóa sau bước cơng nghệ 13 4.3.3.3 Đặc trưng cảm biến 4.0 (a) PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE 0.6 (b) PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE 3.5 Nồng độ kháng nguyên PSA ng/mL, ng/mL ng/mL, 10 ng/mL ng/mL, 12 ng/mL ng/mL, 14 ng/mL 2.5 0.5 0.4 Rct (k) -Z" (k) 3.0 2.0 1.5 0.3 0.2 Rct(k)=0,0275+0,0518*PSA(ng/mL) 1.0 0.1 R =0,9845 0.5 0.0 0.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Z' (k) 5.5 6.0 6.5 7.0 10 Nång ®é PSA (ng/mL) 12 14 Hình 4.12 a) Đáp ứng phổ tổng trở cảm biến nồng độ kháng nguyên PSA từ ng/mL đến 14 ng/mL; b) Đường đặc trưng chuẩn cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE Rct (k) Các kết nghiên cứu ảnh hưởng mật độ hạt vàng nồng độ aptamer cố định cho thấy tín hiệu cảm biến đạt kết tốt với 10 vòng quét tổng hợp hạt nano vàng 0.6 −hCG nồng độ aptamer Protein TAU amylin µg/mL Đường kính bán cung 0.5 PSA phổ EIS tăng nồng độ 0.4 kháng nguyên PSA tăng, hiệu ứng không gian chiếm ưu Cảm 0.3 biến có tính chọn lọc độ tuyến 0.2 tính cao dải nồng độ PSA từ đến 10 ng/mL, giới hạn phát 0.1 LOD= 1,95 ng/mL đáp ứng 0.0 yêu cầu phát dấu PSA ứng 10 12 14 Nång ®é (ng/mL) dụng chẩn đốn sớm ung thư Hình 4.14 Độ chọn lọc cảm biến PSAtiền liệt tuyến Aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE 4.4 Kết luận Hạt nano vàng tổng hợp điện cực SPCE cho phép phát triển màng SAM alkanethiol giống điện cực SPAuE Kết có ý nghĩa, điện cực SPCE với giá thành thấp biến tính hạt nano vàng bề mặt cho phép sử dụng điện cực vàng Bên cạnh đó, hạt nano vàng giúp phân tán đầu thu sinh học cố định bề mặt điện cực Các kết đáp ứng phổ tổng trở điện hóa hai loại cảm biến điện cực SPAuE AuNPs-SPCE giải thích cách khoa học đầy đủ hiệu ứng không gian hiệu ứng chắn tĩnh điện Các lý giải giải thích mâu thuẫn kết cơng bố nhóm tác giả Be Liu (2012) Jolly Pawan (2015) 14 CHƯƠNG CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ GAN 5.1 Mở đầu 5.2 Thực nghiệm 5.2.2 Cố định mAb AFP lên điện cực PPy-PPa/SPCE PPy-PPa/erGO-SPCE O Pyrrole-2-carboxylic axit (Pa) OH N N H Pyrrole (Py) N H n SPCE Polyme O O O NH O (EDC) R1-N=C=N-R2 (a) N H N H O -NH2 n N H SPCE N H n SPCE Cố định kháng thể (NHS) SPCE O N N H Polyme SPCE N H N H n SPCE Graphene oxit (GO) NH O O erGO O O OH (b) N H SPCE n O -NH2 Cố định kháng thể Pyrrole-2-carboxylic axit (Pa) (NHS) N H N H n SPCE Pyrrole (Py) Hình 5.1 Quy trình cố định kháng thể AFP liên kết cộng hóa trị nhóm amin kháng thể nhóm cacboxyl polyme PPy-PPa: (a) điện cực SPCE; (b) điện cực erGO-SPCE 5.2.3 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính màng SAM(p-ATP) NH2 S SPCE SPCE SPCE Tạo màng SAM Tạo hạt nano vàng O (EDC) R1-N=C=N-R2 + R3-C-OH (Ab) Xử lý EDC Cố định kháng thể Kháng thể AFP Kháng nguyên AFP NH NH NH NH AuNP S S SPCE SPCE Ethanolamine NH2 Phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể 4-Aminothiolphenol (p-ATP) SH Hình 5.2 Quy trình cơng nghệ cố định kháng thể AFP liên kết cộng hóa trị nhóm cacboxyl kháng thể nhóm amin SAM (p-ATP) điện cực AuNPs-SPCE 5.2.4 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính vật liệu lai poly(pATP) hạt nano vàng 15 NH2 S SPCE SPCE SPCE Tạo hạt nano vàng Tạo màng SAM Tạo màng polymer N S AuNP S S H N H AuNP AuNP N H S AuNP AuNP S AuNP S S AuNP AuNP AuNP S S NH2 NH2 N H N N H H H N SPCE N H H H N Xử lý EDC Cố định kháng thể SPCE H H SPCE O (EDC) R1-N=C=N-R2 + R3-C-OH (Ab) Phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể NH2 Kháng thể AFP Kháng nguyên AFP Ethanolamine AuNP 4-Aminothiolphenol (p-ATP) SH Hình 5.3 Quy trình cơng nghệ cố định kháng thể AFP liên kết cộng hóa trị nhóm cacboxyl kháng thể nhóm amin vật liệu lai polyme (p-ATP) hạt nano vàng điện cực AuNPs-SPCE 5.3 Kết thảo luận 5.3.1 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/SPCE 5.3.1.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa điện cực SPCE 5.3.1.2 Tối ưu hóa tỷ số hợp phần monome Pa với Py 40 I / A 20 10 - COO SPCE Tû sè Pa / Py mM : 160 mM 40 mM : 120 mM 80 mM : 80 mM 120 mM : 40 mM 160 mM : mM Dao ®éng đặc tr-ng Py PPy-PPa/SPCE vị trí khác (1) C-êng ®é (a.u.) 30 -10 (2) (3) -20 G-band (4) D-band -30 điện cực SPCE trần -40 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 300 0.6 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 -1 Sè sãng (cm ) E / V vs Ag/AgCl Hình 5.6 Đáp ứng dòng-thế điện cực tổng hợp màng PPy-PPa/SPCE với tỷ lệ Pa so với Py thay đổi từ đến 100% mol Hình 5.5 Phổ Raman màng polyme đồng trùng hợp PPy-PPa điện cực SPCE (b) Tỷ lệ hợp phần Pa với Py 1:3 (40mM:120 mM) cho màng polyme có đáp ứng điện hóa tốt (Hình 5.6) Màng polyme có dạng bơng súp lơ phát triển đa tầng bề mặt điện cực (Hình 5.4b) Phép đo quang phổ Raman thực bước sóng kích thích 632,8 nm, vạch phổ số sóng 1398 đến 1400 cm-1 khẳng định có mặt 16 Hình 5.4b Ảnh SEM bề mặt màng polyme PPy-PPa điện cực SPCE nhóm cacboxyl cấu trúc màng polyme đồng trùng hợp 5.3.1.3 Đặc trưng chuẩn cảm biến 4.0 4.0 a) 2.0 2.5 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 LOD = 2,46 ng/mL 3.0 Rct(k) 2.5 mAb AFP/PPy-PPa/SPCE 3.5 Nång ®é AFP ng/mL ; ng/mL 10 ng/mL; 20 ng/mL 30 ng/mL; 40 ng/mL 50 ng/mL; 60 ng/mL 70 ng/mL; 80 ng/mL 90 ng/mL; 100 ng/mL 3.0 -Z"(k) b) mAb AFP/PPa-PPy/SPCE 3.5 R2 = 0,984 Rct (k) = 0,312 + 0,04*AFP (ng/mL) n sè mÉu = 10 20 40 100 80 60 Nång ®é AFP(ng/mL) Z'(k) Hình 5.7 Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng n samples = độ kháng nguyên AFP thay đổi từ đến 100 ng/mL 40 a) mAb AFP/PPa-PPy/SPCE 14 b) 30 mAb AFP/PPy-PPa/SPCE 12 20 Ipc(A) I / A 10 10 -10 Nång ®é AFP ng/mL; -20 -30 ng/mL 10 ng/mL; 20 ng/mL 40 ng/mL; 60 ng/mL 80 ng/mL; 100 ng/mL Ipc() = 0,37 + 0,158*AFP (ng/mL) R2 = 0,99 -40 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 E / V vs Ag/AgCl 20 40 60 80 100 Nång ®é AFP (ng/mL) Hình 5.8 Đáp ứng dòng cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng độ kháng R = 0,984 nguyên AFP thay đổi từ đến 100 ng/mL 5.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE 5.3.2.1 Khử điện hóa GO SPCE 20 SPCE GO-SPCE erGO-SPCE 30CVs a) 18 16 -Z" (k) 14 40 2.0 1.0 SPCE GO-SPCE erGO-SPCE -0.4 -0.2 20 0.5 12 10 I / A 0.0 10 -10 -20 b) 30 1.5 -30 10 15 20 25 30 Z' (k) 35 40 45 -40 50 0.0 0.2 0.4 E / V vs Ag/AgCl 0.6 Hình 5.10 Đặc trưng điện hóa điện cực erGO-SPCE khảo sát dung dịch đo gồm mM [Fe(CN)6] 3-/4- KCl 0,1 M a) Đáp ứng phổ EIS, b) Đáp ứng dòng-thế tốc độ quét 50 mV/s 17 Điện cực sau phủ GO có độ dẫn kém, sau khử điện hóa erGO-SPCE với 30 vòng quét cho đáp ứng dòng cao so với điện cực SPCE ban đầu Độ dẫn tốc độ truyền điện tử cải thiện sử dụng điện cực erGO-SPCE Tỷ số IG/ID giảm số vòng quét tăng, Tỷ số cách biệt 10 20 vòng quét CV sai khác nhỏ số vòng quét 20 30 Điều kiện tối ưu khử điện hóa GO 30 vòng quét G-band D-band C-êng ®é a.u ID/IG = 1,02 800 (a) GO ID/IG = 2,21 (b) erGO 10CVs ID/IG = 2,67 (c) erGO 20CVs ID/IG = 2,70 (d) erGO 30CVs 1000 1200 1400 1600 1800 Sè sãng (cm-1) Hình 5.11 Phổ Raman màng GO erGO điện cực SPCE 5.3.2.2 Hình thái học bề mặt điện cực a) SPCE b) c) erGO/SPCE d) GO/SPCE PPa-PPy/erGO/SPCE Hình 5.12 Ảnh SEM a) bề mặt điện cực SPCE trần, b) có nhỏ phủ GO, c) điện cực SPCE biến tính erGO d) điện cực tổng hợp vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều PPy-PPa erGO Hình thái bề mặt erGO-SPCE khác biệt hẳn so với điện cực ban đầu với nếp gấp giúp tăng diện tích bề mặt riêng điện cực Màng PPy-PPa tổng hợp điện cực erGO/SPCE nhiều nếp nhăn tựa cấu trúc vỏ não người; hình thái hoàn toàn khác biệt so với cấu trúc dạng súp lơ polyme PPy-PPa điện cực SPCE 5.3.2.3 Đặc trưng chuẩn cảm biến 18 a) mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE 1.2 -Z''(k) b) mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE 0.9 0.6 LOD=0,34 ng/mL 0.3 Rct(k) Nång ®é AFP ng/mL ; 0,1 ng/mL ng/mL; ng/mL 10 ng/mL; 20 ng/mL 30 ng/mL; 40 ng/mL 50 ng/mL; 60 ng/mL 70 ng/mL; 80 ng/mL 90 ng/mL; 100 ng/mL 0.0 R2 = 0,996 Rct (k) = 0,375 + 0,057*AFP (ng/mL) n sè mÉu = 0 10 Z'(k) 12 14 20 40 60 80 Nång ®é AFP (ng/mL) 100 Hình 5.13 Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/erGO-SPCE với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ đến 100 ng/mL Rct() Vùng đáp ứng tuyến tính cua cảm biến mở rộng từ 0,1 ng/mL đến 100 ng/mL Độ nhạy cảm biến đạt 57 /ng.mL-1 cao 1,4 lần so với cảm biến sử dụng polyme PPy-PPa (40 /ng.mL-1) 5.3.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/SAM(p-ATP)/ AuNPs-SPCE 5.3.3.1 Ảnh hưởng mật độ hạt nano vàng 5.3.3.2 Ảnh hưởng thời gian tạo màng SAM Thời gian tạo màng đơn lớp định đến tính ổn định 3000 giê 12 giê độ bền màng SAM 18 giê 2500 24 giê Với thời gian tạo màng SAM 2000 18 24 đáp ứng tín hiệu Rct khơng ổn định 1500 điện cực SPCE ngâm lâu 1000 môi trường ethanol ảnh hưởng đến chất lượng 500 điện cực Chúng chọn điều kiện tối ưu để tổng hợp màng 10 50 100 Nång ®é AFP (ng/mL) SAM điện cực 20 CVs Hình 5.18 Đáp ứng tín hiêu Rct cảm biến với AuNPs-SPCE 12 thời gian tổng hợp màng SAM 6, 12, 18, 24 5.3.3.3 Đặc trưng điện hóa sau bước công nghệ 19 4.0 mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE 3.5 SPCE AuNPs-SPCE 3.0 poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE antigen AFP (5 ng/mL) -Z" (k) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 10 12 14 Z' (k) Hình 5.19 Phổ EIS sau bước công nghệ chế tạo cảm biến mAb AFP/SAM(pATP)/AuNPs-SPCE Hình 5.24 Phổ EIS sau bước cơng nghệ chế tạo cảm biến mAb AFP/poly(p-APT)/AuNPs-SPCE 5.3.3.4 Đặc trưng chuẩn cảm biến 4.0 3.5 mAb AFP/SAM p-ATP/AuNPs-SPCE a) 3.5 2.5 2.0 b) mAb AFP/SAM p-ATP/AuNPs-SPCE LOD = 1,41 (ng/mL) 2.5 Rct (k) 3.0 -Z" (k) 3.0 Nång ®é AFP (ng/mL) ng/mL, ng/mL 10 ng/mL, 20 ng/mL 30 ng/mL, 40 ng/mL 50 ng/mL, 60 ng/mL 70 ng/mL, 80 ng/mL 90 ng/mL, 100 ng/mL 2.0 1.5 R2 = 0,987 1.0 1.5 RCT (k) = 0,19 + 0,035*AFP (ng/mL) 0.5 1.0 0.5 0.0 0.0 -0.5 n samples = 3 Z' (k) 20 40 60 AFP (ng/mL) 80 100 Hình 5.20 Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa cảm biến mAb AFP/SAM(p-ATP)/SPCE với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ đến 100 ng/mL Đáp ứng tính hiệu tốt so với PPy-PPa/SPCE, nhiên thấp so với cấu trúc vật liệu lai hai chiều PPy-PPa/erGO-SPCE 5.3.4 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE 5.3.4.1 Poly(p-ATP) kết hợp hạt nano vàng điện cực AuNPs-SPCE 5.3.4.2 Phổ Raman màng poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE b) Hình 5.21b SEM bề mặt màng polyme (p-ATP) Hình 5.23 Phổ Raman màng poly(pATP) điện cực SPCE 20 Phức chất nano vàng monome p-ATP cho mạng polyme phát triển theo cấu trúc 3D Trên đặc trưng quang phổ Raman xuất hai píc tương ứng với vạch phổ G band (tại số sóng 1350 cm-1) vạch D band (tại số sóng 1580 cm1 ) vật liệu bon điện SPCE Các píc số sóng 1081 cm-1, 1143 cm-1, 1181 cm-1, 1403 cm-1 tương ứng với dao động liên kết đặc trưng poly(p-ATP) [98, 178, 316] 5.3.4.3 Đặc trưng điện hóa sau bước công nghệ 5.3.4.4 Đường trưng chuẩn cảm biến 60 90 a) 80 40 30 30 ng/mL, 50 ng/mL, 70 ng/mL, 40 ng/mL 60 ng/mL 80 ng/mL 90 ng/mL, 100 ng/mL b) mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE LOD = 0,13 (ng/mL) 70 60 RCT (k) 50 -Z" (k) mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE Nång ®é AFP (ng/mL) ng/mL, ng/mL 10 ng/mL, 20 ng/mL 50 40 30 20 R2 = 0,985 20 10 RCT (k) = 3,27 + 0,73*AFP (ng/mL) 10 n samples = 0 20 40 60 80 Z' (k) 20 40 60 AFP (ng/mL) 80 100 Hình 5.25 Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa cảm biến mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ đến 100 ng/mL Cảm biến mAb AFP/poly(p-ATP)/SPCE có LOD=0,13 ng/mL độ nhạy 730 /ng.mL-1 Độ nhạy cảm biến lớn 21 lần so với cảm biến sử dụng màng SAM (p-ATP) lớn 13 lần so với cảm biến sử dụng vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều polyme PPy-PPA/erGO-SPCE 5.4 Kết luận Quy trình khử điện hóa graphene oxít tạo erGO SPCE khơng sử dụng hóa chất độc hại thời gian rút ngắn nhiều so với phương pháp hóa học xây dựng thành công Lớp erGO SPCE giúp cải thiện độ dẫn làm tăng diện tích bề mặt riêng điện cực, qua cải thiện đặc tính nhạy cảm biến Cấu trúc lai poly(p-ATP) hạt nano vàng đóng vai trò liên kết chéo mạng polyme giúp tăng tốc độ truyền điện tử đến điện cực tăng độ nhạy cảm biến CHƯƠNG CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE 6.1 Glucose đường huyết 6.2 Cảm biến điện hóa enzyme GOx 6.3 Polyme ơxy hóa khử Osmium cảm biến GOx Polyme Ossmium (Os(dmbpy)2PVI) dạng phức chất Tris đóng vai trò chất trung gian giúp vận chuyển điện tử từ vùng hoạt động FAD enzyme GOx đến bề mặt điện cực cảm biến theo chuỗi phản ứng 21 Glucose Gluconolactone Polymer oxy hóa khử Osmium Glu cos e + GOx( FAD) → Gluconolactone + GOx ( FADH ) (6.11) GOx( FADH ) + 2Os 3+ 2Os 2+ → GOx( FAD) + 2Os + H 2+ → 2Os 3+ + 2e− + (6.12) OsIII OsII OsII OsIII (6.13) [Os(4,4′-dimethyl-2,2′bipyridine)2(polyvinylimidazole)10Cl]+/2+ e- Hình 6.3 Nguyên lý hoạt động cảm biến điện hóa Glucose/(GOx/Osmium)n/AuNPs-SPCE 6.4 Thực nghiệm 6.5 Kết thảo luận 6.5.1 Khảo sát hình thái bề mặt cấu trúc đa lớp (GOx/Osmium) AuNPs-SPCE Osmium/AuNPs-SPCE a) b) (GOx-Osmium)/AuNPs-SPCE (GOx-Osmium)4/AuNPs-SPCE c) d) Hình 6.5 Ảnh hiển vi điện tử quét SEM (a) bề mặt điện cực AuNPs-SPCE, (b) Osmium/AuNPs-SPCE (c) (GOx/Osmium)/AuNPs-SPCE, (d) (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE 6.5.2 Khảo sát ảnh hưởng số lớp (GOx/Osmium) Số lớp (GOx/Osmium) tăng làm tăng số lượng enzyme bề mặt điện cực cảm biến làm tăng tín hiệu cảm biến Khi số lớp lớn 4, màng đa lớp cản trở trình truyền điện tích đến điện cực, tín hiệu dòng cảm biến có xu hướng giảm 22 500 Sè líp (GOx/Osmium) 150 100 Mật độ dòng (A/cm2) Mật độ dòng (A/cm2) 200 50 400 Số lớp (GOx/Osmium) 300 200 100 Điện áp -0,02 V (vs Ag/AgCl) -50 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 20 40 60 80 100 Nồng độ glucose (mM) Điện áp vs Ag/AgCl (V) Hình 6.6 (a) Đáp ứng dòng-thế cảm biến với số lớp (GOx/Osmium) từ đến môi trường dung dịch glucose nồng độ 10 mM pha đệm PBS pH 7,4; (b) Đường đặc trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng độ glucose cảm biến với số lớp (GOx/Osmium) khác điện áp -0,02V (vs Ag/AgCl) 6.5.3 Đáp ứng dòng-thế cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE C¶m biÕn (GOx-Os)4/AuNPs/SPCE 160 Glucose (mM) 120 80 40 10 C¶m biÕn (GOx-Os)4/AuNPs/SPCE 500 Glucose (mM) Mật độ dòng (A/cm2) Mật độ dòng (A/cm2) 200 400 20 30 300 40 50 60 200 70 80 90 100 100 0 -40 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 Điện áp vs Ag/AgCl (V) Điện áp vs Ag/AgCl (V) Hỡnh 6.7 Đặc trưng dòng - cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE khảo sát dung dịch glucose nồng độ - 100 mM với tốc độ quét mV/s Trên đường đặc trưng dòng xuất rõ rệt píc ơxy hóa điện áp -0,02 V vs Ag/AgCl Trong dải nồng độ từ đến 10 mM, mối quan hệ đáp ứng dòng nồng độ đường tuyến tính với phương trình J(µA/cm2) = 20,83 + 16,47*C (mM), C nồng độ glucose dung dch, vi R2 = 0,99 500 Mật độ dòng (A/cm2) 6.6 Kết luận Cảm biến điện hóa phát glucose sở cấu trúc đa lớp polyme oxy hóa - khử Osmium enzyme GOx có độ nhạy đạt 18,72 µA/mM.cm2 với diện tích điện cực 2,64 mm2, cho phép cảm biến hoạt động điện áp thấp (-0,02 V vs Ag/AgCl) 400 300 250 J (A/cm2) = 20,83 + 16,47* Glucose(mM) R2=0,9964 200 200 150 100 100 50 0 20 40 60 80 10 12 100 Nång ®é glucose (mM) Hình 6.8 Đặc trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng độ glucose cảm biến (GOx-Os)4/AuNPs-SPCE làm việc điện áp -0,02V (vs Ag/AgCl) 23 KẾT LUẬN Làm chủ cơng nghệ tạo lớp hạt vàng kích thước nano phân tán bề mặt điện cực SPCE phương pháp quét điện tuần hoàn Điện cực SPCE với giá thành rẻ biến tính hạt nano vàng cho phép sử dụng tương tự điện cực mực in vàng giá thành cao Bên cạnh đó, hạt nano vàng giúp phân tán đầu thu sinh học cố định bề mặt điện cực, giúp nâng cao hiệu suất bắt cặp đầu thu sinh học dấu sinh học cần phân tích Kết có ý nghĩa khoa học nghiên cứu cảm biến sinh học Nghiên cứu thành cơng ba giải pháp biến tính bề mặt điện cực SPCE vật liệu cấu trúc nano giúp nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học cải thiện đáp ứng tín hiệu cảm biến phổ tổng trở điện hóa (i) Polyme đồng trùng hợp polypyrrole- polypyrrole cacboxyl (PPy-PPa); (ii) Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều polyme đồng trùng hợp PPy-PPa ơxít graphene dạng khử điện hóa (erGO); (iii) Vật liệu lai polyme poly(paraaminothiophenol) hạt nano vàng Thành công việc xây dựng đưa quy trình cơng nghệ tối ưu giúp cố định đầu thu sinh học liên kết cộng hóa trị nhóm chức amin cacboxyl đầu thu sinh học với nhóm chức biến tính bề mặt điện cực Đã phát triển thành công 06 loại cảm biến phổ tổng trở điện hóa Faradaic sở điện cực in lưới màng dày có độ nhạy độ đặc hiệu cao dấu khối u: α-hCG, PSA, AFP ➢ Cảm biến mAb hCG /SAM (MHDA) /SPAuE: dải tuyến tính phát dấu α-hCG từ ÷ 100 ng/mL với LOD = 9,35 ng/mL ➢ Cảm biến PSA-aptamer /SAM (MHDA) /AuNPs-SPCE: dải tuyến tính phát dấu PSA từ ÷ 10 ng/mL với LOD = 1,95 ng/mL ➢ Cảm biến mAb AFP /PPa-PPy /SPCE: dải tuyến tính phát dấu AFP từ ÷ 80 ng/mL với LOD =2,46 ng/mL độ nhạy 40 /ng.mL-1 ➢ Cảm biến mAb AFP /PPa-PPy /erGO-SPCE: dải tuyến tính phát dấu AFP từ 0,1 ÷ 100 ng/mL với LOD = 0,34 ng/mL độ nhạy 57 /ng.mL-1 ➢ Cảm biến mAb AFP /SAM (p-ATP) /AuNPs-SPCE: dải tuyến tính phát phát dấu AFP từ ÷ 80 ng/mL với LOD=1,41 ng/mL độ nhạy 35 /ng.mL-1 ➢ Cảm biến mAb AFP /poly(p-ATP) /AuNPs-SPCE: dải tuyến tính phát phát dấu AFP từ ÷ 100 ng/mL có LOD=0,13 ng/mL độ nhạy 730 /ng.mL-1 Bước đầu chế tạo thành cơng cảm biến điện hóa enzyme glucose hệ thứ sở vật liệu polyme ơxy hóa-khử Osmium Cảm biến hoạt động điều kiện điện áp thấp (-0,02 V vs Ag/AgCl) cho phép loại bỏ tín hiệu khơng đặc hiệu axít ascobic, axít uric có mẫu máu bệnh phẩm Cảm biến hoạt động tốt dải nồng độ glucose từ đến 10 mM (R2 = 0,99) 24 ... thiết kế linh hoạt, độ lặp lại cao, nguồn nguyên liệu phong phú Điện cực làm việc sử dụng mực in cácbon hay kim loại (vàng platin), điện cực so sánh sử dụng mực in Ag/AgCl Mực in cácbon với ưu... PSA ứng dụng chẩn đóa ung thư tiền liệt tuyến Chương Cảm biến miễn dịch phát dấu AFP ứng dụng chẩn đoán ung thư gan Chương Cảm biến điện hóa glucose CHƯƠNG CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HĨA ỨNG DỤNG CHẨN... Chương Cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng chẩn đốn bệnh sớm Chương Thực nghiệm phương pháp nghiên cứu Chương Cảm biến miễn dịch phát dấu α-hCG ứng dụng chẩn đoán u tế bào mầm tinh Chương Cảm