ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ NHƢ THỦY NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ NHƢ THỦY NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN VĂN RI PGS.TS TẠ THỊ THẢO Hà Nội - Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tôi.Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình trước Lê Thị Nhƣ Thủy LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Tạ Thị Thảo, chủ nhiệm Bộ mơn Hóa Phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà nội tận tình hướng dẫn chuyên môn, phương pháp nghiên cứu tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học thầy, giáo Khoa Hóa- Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành nội dung học tập thực đề tài thuận lợi Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đ ạo cơng ty, Phụ trách quản lý Phòng Thử Nghiệm 1- Công ty CP Chứng nhận Giám định VinaCert đã tạo điề u kiê ̣n , giúp đỡ tơi quá trình triển khai nghiên cứu đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp bạn lớp Cao học Hóa phân tích K26(2015-2017) giúp đỡ động viên hai năm học tập trình làm luận văn Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2017 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ BẢNG CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sử dụng chất tạo màu thức ăn chăn nuôi Việt Nam .3 1.2 Tổng quan Auramin O 1.3 Các phương pháp xác định 1.3.1 Phương pháp quang phổ .6 1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 1.4 Phương pháp tách Auramin O khỏi mẫu 14 1.4.1 Lựa chọn dung môi chiết lỏng-lỏng 14 1.4.2 Chiết pha rắn .15 1.4.3 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu phương pháp mặt mục tiêu tâm xoay 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .18 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị .18 2.2.1 Hóa chất 18 2.2.2 Thiết bị 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu .20 2.3.2 Phương pháp phân tích mẫu .20 2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm xử lý kết 22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích hệ thống UPLC-MS/MS 23 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ MS/MS 23 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện phân tích hệ thống UPLC 25 3.2 Khảo sát giới hạn phát thiết bị (IDL) khoảng tuyến tính xác định phụ thuộc tín hiệu đo vào nồng độ chất phân tích 31 3.2.1 Giới hạn phát thiết bị 31 3.2.2 Khoảng tuyến tính 32 3.3 Tối ưu hóa phương pháp chiết Auramin O khỏi mẫu 33 3.3.1 Khảo sát đơn biến để chọn thông số ảnh hưởng khoảng biến thiên 33 3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu vớipp mặt mục tiêu tâm xoay (RSM) 36 3.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp .45 3.4.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc .45 3.4.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .47 3.4.3 Xây dựng đường chuẩn 48 3.4.4 Độ xác phương pháp phân tích 52 3.4.5 Ước lượng độ không đảm bảo đo .55 3.5 Phân tích mẫu thực tế 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 69 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Điều kiện nguồn Ion hóa ESI + 23 Bảng 3.2 Điều kiện tối ưu hóa MS/MS .24 Bảng 3.3 Chương trình đẳng dòng pha động 26 Bảng 3.4 Chương trình gradient pha động 27 Bảng 3.5 Diện tích pic thay đổi tốc độ dòng .29 Bảng 3.6 Kết tiêm lặp lại lẫn mẫu chuẩn nồng độ 0,02 µg/kg 31 Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi sử dụng ba loại dung môi chiết 33 Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi khảo sát cột chiết pha rắn .35 Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi tỉ lệ dung môi rửa giải khác 36 Bảng 3.10 Khoảng biến thiên yếu tố cần khảo sát 37 Bảng 3.11 Kết thí nghiệm tiến hành theo mơ hình bậc tâm xoay .38 Bảng 3.12 Bảng hệ số thực phương trình hồi quy 39 Bảng 3.13 Phân tích phương sai hiệu suất thu hồi AO 40 Bảng 3.14 Sai số kết thực nghiệm với kết tính từ mơ hình 40 Bảng 3.15 Kết phân tích lần lặp lại điều kiện tối ưu .43 Bảng 3.16 Ion mẹ ion AO .47 Bảng 3.17 Tỉ lệ S/N phân tích lần lặp lại nồng độ 10 µg/kg 47 Bảng 3.18 Sự phụ thuộc diện tích píc nồng độ Auramin O 48 Bảng 3.19 Sự phụ thuộc diện tích píc nồng độ AO .50 Bảng 3.20 Kết phê duyệt độ xác 53 Bảng 3.21 Bảng tính kết độ không đảm bảo đo phương pháp 57 Bảng 3.22 Kết phân tích mẫu thực tế 58 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình hệ thống LC-MS/MS .10 Hình 1.2 Tứ cực 11 Hình 3.1 Sắc đồ mảnh ion điều kiện tối ưu hóa MS/MS .24 Hình 3.2 Cơ chế phân mảnh phổ khối AO 25 Hình 3.3 Sắc đồ chương trình đẳng dòng pha động 26 Hình 3.4 Sắc đồ chương trình 3,4,5 chạy gradient .28 Hình 3.5 Sắc đồ tốc độ dòng 0,1 ml/phút 29 Hình 3.6 Sắc đồ tốc độ dòng 0,2 ml/phút 30 Hình 3.7 Sắc đồ tốc độ dòng 0,3 ml/phút 30 Hình 3.8 Sắc đồ nồng độ 0,02 µg/kg 32 Hình 3.9 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Auramin O .32 Hình 3.10 Cơng thức cấu tạo chất tạo hạt nhồi cột HLB 35 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mặt mục tiêu phụ thuộc thuộc tỉ lệ dung môi chiết khối lượng mẫu thể tích rửa giải 42 Hình 3.12 Các đường đồng mức biểu diễn hiệu suất thu hồi AO phụ thuộc tỉ lệ dung môi chiết khối lượng mẫu thể tích rửa giải 42 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn 46 Hình 3.14 Sắc đồ nồng độ 10 µg/kg 48 Hình 3.15 Đường chuẩn AO dung mơi MeOH 49 Hình 3.16 Đường chuẩn Auramin O mẫu 51 Hình 3.17 Đường chuẩn AO mẫu dung môi MeOH 51 Hình 3.18 Sắc đồ khơng phát pic mẫu phân tích thực tế .59 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng anh Tiếng Việt AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân Communities tích thức AO Auramine O Vàng Ơ TĂCN Animal Feed Thức ăn chăn ni APCI Atmospheric pressure chemical ionization Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí CE Collision Energy Năng lượng va chạm DAD Diode array detector Đầu dò mảng diot ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử HLB Hydrophilic – lipophilic Balance Cân ưa nước-ưa dầu IARC International Agency for Reasearch on Cancer Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế IDL Instrumental detection limit Giới hạn phát thiết bị KPH Not detected Khơng phát MRM Multiple Reaction Monitoring Kiểm sốt đa phản ứng LC-MS/MS Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ mass spectrometry lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng PDA Photo diode array Đầu dò Photo diot QC Qualiy control Mẫu kiểm soát RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCX Strong Cation Exchange Nhựa trao đổi cation mạnh S/N Signal to Noise Tín hiệu nhiễu SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn UPLC WAX Ultra Performance Liquid Chromatography Weak Anion Exchange Siêu sắc ký lỏng hiệu cao Nhựa trao đổi anion axit yếu 30 KM Graya, MJ Walkera, MJS Burna, M Mazura, K Niedzwiedzkaa, K Liszka and D Thorburn Burnsc, (2016), “Illegal Dyes in Food and Spices –A 2006 LGC LC-UV/Visible Method Reviewed andUpdated for 19 Dyes”, Journal of the Association of Public Analysts, 44, pp 18-39 31 LI Jing-Qing, QI Yan, LIAO Gui-Fu, CHEN Man-Ying, (2016), “Rapid determination of dimethyl yellow and auramine O in bean products by QuEChERS method combined with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry”, Journal of Food Safety and Quality, (7),pp.4753-4758 32 Lin Qin, (2007), “Simultaneous Determination of Chrysoidine and Auramine(O) in Food by High Performance Liquid Chromatography”, Chinese Journal of Chromatography, 25(5), pp 776-777 33 Lide D (2008), "Handbook of Chemistry and Physics", CRC Press, (88), pp 330 34 Lin S., Tu H., Sun L.,(2011), "Simultaneous determination of five yellow dyes in foods by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry",Chinese journal of chromatography, 29(1), pp 79-82 35 LI Yun; QIU Guo-yu; BAI He-ming; CHEN Wen-hui; ZHENG jian, (2016), “ Study on detection method for Auramine O in Phellodendri Amuresis Cortex”,Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, (36), pp.2029-2034 36 Meizhong L (2005), "Determination of auramine O in legume-food byhigh performance liquid chromatography-diode array detector", Science and Technology of Food Industry, (8), pp 59-65 37 Mitrowska K, Posyniak A, Zmudzki J, (2005) “Determination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection”,J Chromatogr A; 1089(1-2), pp.187-192 38 M.Satake, Y.Mido (1995), Chemisry of colour,Discovery Publishing Housepp 94-95 65 39 Nadav Amdursky, Dan Huppert, (2012) “Auramine-O as a Fluorescence Marker for the Detection of Amyloid Fibrils”, The Journal of Physical Chemistry B,(45), pp 13389-13395 40 Peng Cao, Xu-Guang Qiao, Xi-Shan Lou, Jin-Pei Geng,(2011) “Simultaneous Determination of Industrial Dyes in Foods by Solid Phase ExtractionUltra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry’’,Chinese Journal of Analytical Chemistry; pp 11-15 41 Pradipbhai D Kalariya, Deepak Namdev, R.Srinivas, S Gananadhamu, (2014), “ Application of experimental design and response surface technique for selecting the optimum RP-HPLC conditions for the determination of moxifloxacin HCl and Ketorolac tromethamine in eye drops”, Journal of Saudi Chemical Society, (21), pp 373-382 42 Roger Wood, Lucy Foster, AndrewDamant and Pauline Key (2004),Analytical methods for food additives, Woodhead Publishing in Food Science and Techology, pp 11-13 43 RongyuanLiu, WenjingHei, PingliHe, ZhenLi,(2011),“Simultaneous determination of fifteen illegal dyes in animal feeds and poultry products by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, pp 879-882 44 Roya Mirzaei, Masoud Yunesian, Simin Nasseri, Mitra Gholami, (2017), “ An optimized SPE-LC-MS/MS method for antibiotics residue analysis in ground, surface and treated water samples by response surface methodology-central composite design”, Journal of Environmental Health Science and Engineering, (15), pp.125-130 45 Sawadogo, diande, Ouedraogo, Mourfou, Gueye, Sangare, Ouattara (2012) “Comparison of Kinyoun, Auramine O, and Ziehl-neelsen staining for diagnosing tuberculosis at the national tuberculosis center in burkina faso”, Medecine et Sante Tropicales,(22), pp 302-306 66 46 Tan Enling, Xiao Jian (2012), “Determination of Basic Orange II Acid Orange II àn Auramine O in Bean Products”, Guandong Chemical Industry, pp.124125 47 Thetford D (2000), Triphenylmethane and related dyes, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology 48 Truant J, Brett W, Thomas W (1962), “Fluorescence microscopy of tubercle bacilli stained with auramine and rhodamine”, Henry Ford Hosp Med Bull (10), pp 287-296 49 Waters Xevo TQ MS Operator’s Overview and Maintenance Guide, pp.41 50 Wang duo-jiao, Yan chun-rong, Gan ning-lan, Xu chun-xiang, Zhou wei, (2014), “Determination of Auramine O and Acid Orange II in Yellow Croaker by LC-MS/MS”, Food Research and Development , pp.94-96 51 WANG Jian-wei, ZHONG Hai-juan, LIANG Chi-quiong, (2010), “ Determination of Chrysoidin and Auramine O in food by Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry”, Analysis and Testing Technology and Instruments, pp 234-239 52 World Health Organization, (1993),“Occupational exposures of hairdressers and barbers and personal use of hair colourants; some hair dyes, cosmetic colourants, industrial dyestuffs and aro- matic amines”, IARC MonoGraphs on the Evaluation of Carcinogenic risks to humans 53 World health organization international agency for research on cancer(2010), IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to humans, Auramine and Auramine production, Some Aromatic Amines, Organic Dyes, and Related Exposures 54 World Health Organization International agency for research on cancer(2012), “Volume 100F Auramine and auramine production, Chemical Agents and Related Occupations”, IARC Monographs Carcinogenic Risks to humans 67 on the Evaluation of 55 Yamaguchi M,Kajimura K,(2015)“Analysis of colorants in foods using liquid chromatography-mass spectrometry”, Journal of the Food Hygienic Society of Japan (1), pp.8-13 56 Yang Suang, Yu ZiXuan; Wang YongFang, Ge BaoKun,(2015),“Rapid determination of chrysoidine II and auramine O in dried bean curd sticks by cryogenic centrifugal purification-high performance liquid chromatography ’’, Joural of Food Safety and Quanlity , pp 427-431 57 Yang MC, Fang JM, Kuo TF, Wang DM, Huang YL, Liu LY, Chen PH, Chang TH (2007), “ Production of antibodies for selective detection of malachite green and the related triphenylmethane dyes in fish and fishpond water’’, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55 (22),pp 8851-8856 58 YU Xin-qi; HE Feng-yan; LIN Rui-chao; MA Shuang-cheng, (2014), “ Study on detection methods for Auramine O in Chineses patent medicines”, Chinese journal of Pharmaceutical Analysis, (34), pp.130-135 59 Zecevic M, Zivanovic L, Agatonivic-Kustrin S, Minic D, (2001), The use of a response surface methodology on HPLC analysis of methyldopa, amiloride and hydrochlorothiazide in tablets, Journal of Pharmaceutical and biomedical analysis, (25), pp 1019-1025 60 Zheng Xiao-yan, (2009),“Simultaneous Determination of Chrysoidine,Auramine O and Safranine T in Foods by Ultra Performance Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry”,Analysis and Testing Technology and Instruments, pp 85-89 68 PHỤ LỤC Phụ lục Hệ thống UPLC-MS/MS-Waters Xevo TQ MS Báo cáo kết điều kiện MS/MS tối ưu hóa tự động xuất từ phần mềm thiết bị phân tích 69 Phụ lục Kết phân tích thí nghiệm theo mơ hình bậc hai tâm xoay 70 71 72 73 74 Phụ lục Kết xác nhận giá trị phƣơng pháp: Độ xác 75 76 77 78 79 ... Nghiên cứu phát triển phƣơng pháp phân tích Auramin O thức ăn chăn nuôi sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)” Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài: Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phân tích đại sắc ký lỏng. .. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ NHƢ THỦY NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số:... trường phát hàng trăm thức ăn chăn nuôi sở sản xuất Việt Nam sử dụng chất t o màu công nghiệp, chủ yếu Auramin O (AO), để t o màu vàng cho thức ăn chăn nuôi Auramin O chất t o màu công nghiệp, vào