Đang tải... (xem toàn văn)
Tìm hiểu tỉ lệ nhiễm 5 loại E. coli gây tiêu chảy bao gồm EPEC, EHEC, ETEC, EIEC và EAEC ở trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang. Chúng tôi ứng dụng quy trình Multiplex PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu để định danh 5 loại E. coli gây tiêu chảy. Khảo sát trên 213 trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy đến khám và điều trị tại Bệnh viện nhi Trung ương, Bệnh viện Saintpaul và Bệnh viện Thanh nhàn của thành phố Hà nội (nhóm bệnh) và 100 trẻ khỏe mạnh (nhóm chứng). Từ tháng 9 năm 2000 đến tháng 9 năm 2001.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 11 * Số * 2007 Nghiên cứu Y học ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG ĐỊNH DANH CÁC E COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM DƯỚI TUỔI Đỗ Thị Thu Hương*, Nguyễn Vũ Trung*, Lê Văn Phủng** TÓM TẮT Mục tiêu: Tìm hiểu tỉ lệ nhiễm loại E coli gây tiêu chảy bao gồm EPEC, EHEC, ETEC, EIEC EAEC trẻ em tuổi bị tiêu chảy Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang Chúng tơi ứng dụng quy trình Multiplex PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu để định danh loại E coli gây tiêu chảy Khảo sát 213 trẻ em tuổi bị tiêu chảy đến khám điều trị Bệnh viện nhi Trung ương, Bệnh viện Saintpaul Bệnh viện Thanh nhàn thành phố Hà nội (nhóm bệnh) 100 trẻ khỏe mạnh (nhóm chứng) Từ tháng năm 2000 đến tháng năm 2001 Kết quả: Trong nhóm bệnh tỉ lệ phân lập E coli gây tiêu chảy 24,9% EAEC chiếm tỉ lệ cao 15,9%, EPEC (3,8%), EHEC (2,8), EIEC (1,9%) ETEC (0,5%) Trong nhóm lành có trẻ phân lập EAEC (6,0%), trẻ nhiễm ETEC (1%) trẻ nhiễm EPEC (2%) Các triệu chứng lâm sàng bệnh nhi không đặc trưng cho loại E coli ABSTRACT A MULTIPLEX PCR PROTOCOL WAS APPLIED TO DETERMINE THE INCIDENCE OF E COLI DIARRHEA IN CHILDREN UNDER YEARS OLD Do Thi Thu Huong, Nguyen Vu Trung, Le Van Phung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 11 - No - 2007: 31 - 34 Objective: The study determines the incidence of E coli diarrhea in children includes: EAEC, EPEC, EHEC, EIEC and ETEC in the children under years old with acute diarrhea Methods: Cross-sectional study A multiplex PCR protocol using type – specific primers was applied to determine the incidence of E coli diarrheal species in children include: EAEC, EPEC, EHEC, EIEC and ETEC The study examined 213 children under years old with acute diarrhea (patient group) were admitted to Central children hospital, Saint Paul hospital, Thanh Nhan hospital and 100 healthy children (healthy group) from 01 09 2000 to 01.09 2001 Results: Among 213 children of the patient group: 53 cases (24,9%) had E coli diarrhea with 34 cases (15,9%) had EAEC, cases (3,8%) had EPEC, cases (1,9%) had EIEC, case (0,5%) had ETEC and among 100 children of * Khoa Vi sinh – BV Đà Nẵng **Trường Đại học Y - Hà nội the healthy group: case (9,0%) had E coli diarrhea with cases (6,0%) had EAEC, cases (2,0%) had EPEC, case (1,0%) had ETEC No significant difference of clinical symptom were found among children who had species E coli diarrhea (Enterohaemorrhagic) EAEC ĐẶT VẤN ĐỀ (Enteroaggregative) Việc định danh c{c E coli Tiêu chảy vi khuẩn l| chủ yếu dựa v|o định túp huyết thanh, nhiên nguyên nh}n quan trọng g}y tử vong cho trẻ em dựa v|o kh{ng nguyên O, H v| K c{c E coli lứa tuổi tuổi Đứng đầu c{c ph}n th|nh 700 týp huyết nên việc định nguyên vi khuẩn l| c{c E coli gây tiêu chảy, danh E coli gây tiêu chảy kh{ phức tạp(6) chiếm tỉ lệ khoảng 20 – 30%(4) Dựa v|o khả Trong nghiên cứu n|y, ứng dụng g}y tiêu chảy c{c E coli chia th|nh loại phương ph{p Multiplex PCR để chẩn đo{n c{c E gồm EPEC (Enteropathogenic), ETEC coli g}y tiêu chảy, đ}y l| phương ph{p (Enterotoxigenic), EIEC (Enteroinvasive), EHEC 31 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 11 * Số * 2007 Nghiên cứu Y học Ial BfpA pCVD nhanh v| đặc hiệu nhờ sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho loại E coli (2,5) Bệnh cảnh l}m s|ng m| nguyên loại E coli thường là: - EAEC g}y nên x}m lấn dai dẳng lớp niêm mạc ruột non l|m biến đổi hình th{i đ}y, hậu g}y nên tiêu chảy cấp hay kéo d|i v| dẫn đến tình trạng hấp thu c{c chất dinh dưỡng trẻ - EIEC g}y nên c{c tổn thương khu trú l| c{c tổn thương dạng loét niêm mạc đại tr|ng g}y nên hội chứng lỵ bệnh nhi - ETEC g}y bệnh t{c động hai độc tố ruột vi khuẩn g}y nên với tiêu chảy cấp dạng tả với ph}n nhiều nước, kèm nôn mửa - EHEC có hai loại gồm c{c EHEC điển hình (O157: H7) v| khơng điển hình (EHEC non O157) C{c EHEC O157: H7 thường g}y tiêu chảy kèm theo viêm đại tr|ng xuất huyết v| hội chứng tan máu urê huyết cao - EPEC t{c động v|o tế b|o biểu mơ niêm mạc ruột l|m tho{i hóa c{c vi nhung mao l|m rối loạn qu{ trình hấp thu nước v| điện giải đ}y v| g}y tiêu chảy trẻ(3,7) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Kỹ thuật n|y thực 213 mẫu ph}n c{c trẻ bị tiêu chảy đến kh{m v| điều trị bệnh viện l| Viện Nhi trung ương, Bệnh viên Saint – Paul v| Thanh nh|n Th|nh phố H| nội Nhóm chứng thực 100 mẫu ph}n trẻ em nh| trẻ Tp H| nội C{c mẫu bệnh phảm tiến h|nh nuôi cấy môi trường Mac Conkey Sorbitol (SMAC), chọn khuẩn lạc E coli t{ch chiết ADN vi khuẩn nhiệt độ 1000 C/ 20 phút Các ADN t{ch chiết trộn chung với c{c cặp mồi đặc trưng cho loại E coli để thực PCR đa mồi (PCR vòng ngo|i) Trong bảng sau trình bày c{c cặp mồi, đoạn gien đích, kích thước đoạn đặc hiệu loại E coli Đoạn gen đích elt B est A Vt Vt Eae A Mồi Vi khuẩn LT l-r ST12 l-r VT l-r VT2 l-r Eae u-l ETEC ETEC EHEC EHEC EHEC/EPEC Cỡ sản phẩm (bp) 322 147 130 298 376 SHIG 1-2 BfpA u-1 EA 1-2 EIEC EPEC EAEC 320 367 630 Chạy m{y lu}n nhiệt theo chương trình: 96 C/ 4phút; 30 chu kỳ: (940C/20 giây, 550C/20 giây 720C/10giây); 720C/7 phút C{c sản phẩm nhuộm dung dịch ethidium bromide v| điện di đọc kết dương tính chọn đến 10 khuẩn lạc đại diện ria cấy đến 10 vùng kh{c môi trường SMAC, t{ch chiết ADN v| thực PCR đơn mồi hay đặc hiệu (PCR vòng trong) với cặp mồi KẾT QUẢ Tổng số 313 mẫu khảo s{t với 213 trẻ bị tiêu chảy v| 100 trẻ nhóm chứng kết trình b|y bảng Bảng 1: Sự phân bố E coli gây tiêu chảy Các loại E coli ETEC EPEC EHEC EIEC EAEC Tổng cộng Nhóm bệnh Nhóm chứng (n = (n=213) 100) Số dương % Số dương % tính tính 0,5 1,0 3,8 2,0 2,8 0 1,9 0 34 15,9 6,0 53 24,9 9,0 Giá trị p > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 Nhận xét: Trong nhóm bệnh tỉ lệ ph}n lập E coli g}y tiêu chảy l| 24,9% v| nhóm chứng l| 9,0 % kh{c biệt hai tỉ lệ n|y có ý nghĩa thống kê (p0,05 32 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 11 * Số * 2007 EPEC 4,4 0 >0,05 EIEC 1,1 6,7 >0,05 EAEC 32 17,5 6,7 >0,05 Nhận xét: Trong nhóm trẻ từ đến 24 th{ng tuổi ph}n lập loại E coli với EAEC chiếm tỉ lệ cao l| 17,5 %, tiếp đến l| EPEC (4,4%) v| EHEC (3,3%) Trong nhóm trẻ từ 25 đến 60 th{ng tuổi ph}n lập loại E coli EIEC v| EAEC vớI tỉ lệ 6,7%, nhiên c{c kh{c biệt tỉ lệ hai nhóm khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Bảng 3: Sự liên quan E coli gây tiêu chảy với kết soi phân trực tiếp bệnh phẩm Loại E coli Bạch cầu Hồng cầu Kén amibe Dương % Dương % Dươn % tính tính g tính EAEC (n=34) 11 32,4 2,9 14,7 EPEC (n=4) 37,5 12,5 12,5 EIEC (n=7) 75,0 75,0 25,0 Nhận xét: 75% trường hợp nhiễm EIEC có hiển diện bạch cầu hồng cầu phân Các trường hợp nhiễm EAEC có 14,7% có nhiễm kèm với kén amibe 32,4% có diện bạch cầu phân Bảng 4: Sự liên quan loại E coli với số triệu chứng lâm sàng Sốt 37 Loại E coli Số ca (%) EAEC 14 (51,8) (n=27) EPEC (n=7) (57,1) EHEC (n=6) (66,6) Mất nước độ B Nôn Số ca (%) 14 (14,8) (51,8) (57,1) (28,5) (66,6) (66,6) Số ca (%) Kèm với bệnh viêm đường hô hấp cấp Số ca (%) KẾT LUẬN Từ 213 mẫu bệnh phẩm ph}n 213 trẻ em tuổi bị tiêu chảy, ph}n lập 53 chủng E coli g}y tiêu chảy chiếm tỉ lệ l| 24,9% EAEC đóng vai trò quan trọng chiếm tỉ lệ l| 15,9%, l| EPEC (3,7%); EHEC (2,8%); EIEC (1,9%) ETEC 0,5% Đặc biệt c{c chủng EHEC ph}n lập l| c{c chủng EHEC non – O157 nên bệnh cảnh l}m s|ng bệnh nhi l| c{c tiêu chảy đơn Trong nhóm tiêu chảy g}y nên EAEC có 35,4% trường hợp có tiêu chảy kéo d|i hai tuần v| 50% bệnh nhi bị nhiễm EAEC có kèm với bệnh viêm đường hô hấp C{c trường hợp tiêu chảy EIEC thường biểu hội chứng lỵ, nhiên c{c triệu chứng l}m s|ng bệnh nhi không đặc trưng cho loại E coli Các E coli g}y tiêu chảy đề kh{ng với Chloramphenicol v| Co-trimoxazole mức 70% TÀI LIỆU THAM KHẢO (42,8) (16,6) Bảng 5: Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng E coli Chloramphenicol Co- trimoxazole Nalidixic acid Amikacin Cefotaxime Ciprofloxacin Nhận xét: Trong bảng cho thấy hai kh{ng sinh bị c{c chủng E coli đề kh{ng mức 70% l| Chloramphenicol Co-trimoxazole, nhiên bốn kh{ng sinh lại vi khuẩn nhạy cảm mức 80% 15 (55,5) Nhận xét: C{c triệu chứng l}m s|ng không đặc hiệu cho loại E coli g}y tiêu chảy, nhiêm điều đ{ng lưu ý l| có 50% bệnh nhi bị nhiễm EAEC có kèm với bệnh viêm đường hơ hấp Kháng sinh Nghiên cứu Y học Nhạy cảm Trung gian Đề kháng % % % 26,8 73,2 12,2 87,7 92,7 7,3 97,6 2,4 82,9 17,1 100 0 Võ thị Dương Huy, Nguyễn Thanh Bảo (1991) “Tiêu chảy cấp Escherichia coli”, Tạp chí vệ sinh phòng dịch, 1(2) tr 29 - 33 Lê Văn Phủng (2000), “Một số ứng dụng PCR vi sinh vật”, Tạp chí Y học thực hành, (393) tr 25 - 27 Ho|ng thị Thu Thủy (1988), “Góp phần nghiên cứu chủng Escherichia coli gây tiêu chảy cấp trẻ em tạI Hà nộI”Luận văn phó tiến sĩ Y học, Trường đại học Y H| nội Chu Văn Tường (1991), “Tiêu chảy cấp”, Bách khoa thư bệnh học,tr 174 – 175 Biswas R., Nelson E.A., Lewindon P.J., (1996) “Molecular Epidemiology of Escherichia coli diarrhea in children in Hongkong” J,Clin Microbio., 34(12) pp 3233 – 3234 Echeverria P., Savarino S.J., Yamamoto T (1993) “Escherichia coli diarrhoea”, Bacillier Clin Gastroenterology, 7(2), pp 243- 260 Nataro J.P., Kaper J.B (1998), “Diarrheagenic Escherichia coli”Rev Clin M icrobiolo 11(2), pp 142 – 201 Schimidt H., Knop C., Franke S (1995) “Development of PCR for screening of Enteroaggregative Escherichia coli”, J Clin M icrobiolo 33 (3), pp 701 - 705 Sjukhus H (2000), “ETEC, EHEC, EIEC, EPEC and other verotoxigenic enterobacterriaceae detection with PCR and agarose gel electrophoresis of the PCR products”, Kliniskt Bakteriologiska Labo., 9, pp 1-9 33 ... l-r ST12 l-r VT l-r VT2 l-r Eae u-l ETEC ETEC EHEC EHEC EHEC/EPEC Cỡ sản phẩm (bp) 322 147 130 298 376 SHIG 1-2 BfpA u-1 EA 1-2 EIEC EPEC EAEC 320 367 630 Chạy m{y lu}n nhiệt theo chương trình:... Franke S (1995) “Development of PCR for screening of Enteroaggregative Escherichia coli , J Clin M icrobiolo 33 (3), pp 701 - 705 Sjukhus H (2000), “ETEC, EHEC, EIEC, EPEC and other verotoxigenic... EPEC and other verotoxigenic enterobacterriaceae detection with PCR and agarose gel electrophoresis of the PCR products”, Kliniskt Bakteriologiska Labo., 9, pp 1-9 33