Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện nay, biến đổi khí hậu đang diễn ra ngày càng phức tạp và có xu hướng lan rộng trên toàn cầu. Hiện tượng bất thường của thời tiết như nắng nóng, lạnh, lũ lụt, hạn hán diễn ra với mức độ ngày càng thường xuyên và gay gắt hơn. Không chỉ tác động đến hoạt động sống của con người mà các sinh vật cũng bị xáo trộn. Cây trồng, đối tượng cung cấp lương thực chính cho con người, đang phải đối mặt trực tiếp với những thay đổi bất thường của khí hậu, và chúng cần có những thay đổi để thích ứng trong cuộc sống sinh tồn. Việc thích ứng với những bất thường của khí hậu thông qua sự thay đổi hệ thống quản lý và kỹ thuật lại không đủ để duy trì năng suất. Mặc dù trong chăn nuôi đã có những tiến bộ đáng kể trong việc phát triển các dòng chịu nhiệt, nhưng cơ sở di truyền và tính đa dạng của khả năng chịu nhiệt ở thực vật lại vẫn chưa được biết đến nhiều. Các nhà khoa học đang tìm cách giúp cho cây trồng có khả năng thích ứng mạnh mẽ hơn trong các điều kiện bất lợi. Sàng lọc gen có khả năng chống chịu với stress nhiệt độ và đưa nó vào cây trồng là một trong những cách tiếp cận được nhiều khoa học đang tiến hành. Tuy nhiên sự tương tác giữa nhiệt độ với các quá trình hóa sinh trong cây diễn ra rất phức tạp, không chỉ ở một hay một nhóm gen mà còn có sự tác động qua lại giữa chúng. Chính vì vậy, việc triển khai các nghiên cứu nhằm chọn tạo được các giống cây trồng nông nghiệp có khả năng chống chịu được các điều kiện bất lợi của môi trường đang là vấn đề cấp bách trong giai đoạn hiện nay. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen chịu nhiệt HSP101 trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc Bắc Giang, ngày…tháng…năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thùy Linh Khóa luận tốt nghiệp 4A i Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nơng học LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Hoàng Thị Thao tận tình hướng dẫn bảo tơi suốt q trình nghiên cứu thực đề tài khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS Nguyễn Tiến Dũng giảng viên khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tận tình giúp đỡ tạo điều kiện q trình thực thí nghiệm nghiên cứu đề tài khóa luận Trong q trình thực đề tài nhận giúp đỡ nhiệt tình tập thể cán phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh học, khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin cảm ơn thầy cô giáo cán khoa Nông học, Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang động viên dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận Bằng tình cảm chân thành, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè bên, động viên giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Bắc Giang, ngày…tháng…năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thùy Linh Khóa luận tốt nghiệp 4A ii Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN vii DANH MỤC HÌNH ẢNH TRONG KHĨA LUẬN viii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Gen chịu nhiệt HSP đặc điểm gen chịu nhiệt HSP101 .3 1.1.1 Gen chịu nhiệt HSP 1.1.2 Đặc điểm gen chịu nhiệt HSP101 .4 1.2 Tính chống chịu stress thực vật .5 1.2.1 Khái niệm tính chống chịu stress thực vật .5 1.2.2 Tính chất tác nhân gây stress 1.2.3 Phản ứng thực vật với Stress 1.3 Ảnh hưởng stress đến sinh trưởng phát triển trồng 1.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ cao (tính chịu nóng) đến sinh trưởng phát triển trồng 1.3.2 Ảnh hưởng tính chịu hạn đến sinh trưởng phát triển trồng 1.3.3 Ảnh hưởng tính chịu mặn đến sinh trưởng phát triển trồng .10 1.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ thấp (tính chịu lạnh) đến sinh trưởng phát triển trồng .11 1.4 Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu nhiệt độ cao thực vật 12 Khóa luận tốt nghiệp 4A iii Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học 1.4.1 Các nghiên cứu nâng cao tính chống chịu nhiệt độ cao thực vật giới .12 1.4.2 Các nghiên cứu nâng cao tính chống chịu nhiệt độ cao thực vật nước 14 1.5 Chuyển gen thực vật 15 1.5.1 Khái niệm chuyển gen thực vật 15 1.5.2 Các phương pháp chuyển gen cho trồng 16 1.5.3 Một số nghiên cứu chuyển gen thuốc .23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 25 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.2 Hóa chất 25 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 26 2.2.2 Phương pháp chuyển gen thuốc .29 2.2.3 Phương pháp phân tích chuyển gen 31 2.2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 31 2.2.3.2 Phân tích chuyển gen phương pháp PCR 32 2.2.3.3 Phương pháp điện di kiểm tra gel agarose 33 2.2.4 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang gen chịu nhiệt HSP101 35 3.2 Kết chuyển gen HSP101 vào giống thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 37 3.3 Chọn lọc phân tích hiệu chuyển gen .39 3.4 Phân tích biểu gen chuyển HSP101 thuốc .41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .46 Kết luận 46 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Khóa luận tốt nghiệp 4A iv Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học 1.Tài liệu tiếng việt 47 Tài liệu tiếng anh 48 Khóa luận tốt nghiệp 4A v Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADP AS ATP BAP bp CNSH cs CTAB Thuật ngữ Tiếng Anh Adenosine diphosphat Acetylseringone Adenosine triphosphat Benzylaminopurine Base pair HSP Kb Cetyltrimethylammonium bromide Deoxynucleic acid DeoxyNucleoside Triphosphate Ethylene diamine tetra acetic acid Heat Shock Protein Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani MAS MCS MS Maker- assisted selection Multi Cloning Site Murashige Skoong (1962) NAA α- naphthalenneacetic Acid Nicotinamide adenine dinucleotide Optical density Polymerase Chain Reaction Quantitative trait loci DNA dNTPs EDTA NAD OD PCR QTL RMOP Regeneration Medium for Organogenesis Plant Khóa luận tốt nghiệp 4A vi Thuật ngữ Tiếng Việt Adenosine diphosphat Acetylseringone Adenosine triphosphat Benzylaminopurine Cặp bazo nito Công nghệ sinh học Cộng Cetyltrimethylammonium bromide Axit deoxynucleic DeoxyNucleoside Triphosphate Axit acetic Ethylene diamine tetra Protein sốc nhiệt Đơn vị trọng lượng phân tử Đơn vị trọng lượng phân tử Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn Vùng gắn gen chuyển vào Môi trường theo Murashige Skoong (1962) Axit α- naphthalenneacetic Nicotinamide adenine dinucleotide Mật độ quang học Phản ứng chuỗi trùng hợp Locus tính trạng định lượng Mơi trường tái sinh Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học RNA ROS SDS TAE T-DNA TE Ti - plasmid UV v/p Ribonucleic Acid Reactive oxygen species Sodium dodecyl sufate Tris bazơ - Axit acetic EDTA Tranfer - DNA Tris HCl - EDTA, pH = Tumor inducing plasmid Ultraviolet Khóa luận tốt nghiệp 4A vii Axit ribonucleic Reactive oxygen species Sodium dodecyl sufate Tris bazơ - Axit acetic EDTA Đoạn DNA chuyển Plasmid gây khối u Tia cực tím UV Vòng/phút Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học DANH MỤC BẢNG TRONG KHĨA LUẬN Bảng 2.1 Thống kê trình tự mồi sử dụng nghiên cứu .25 Bảng 2.2 Thành phần môi trường sử dụng chuyển gen 30 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR .32 Bảng 2.4 Chương trình thực phản ứng PCR 33 Bảng 3.1 Kết chuyển gen HSP101 thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 38 Bảng 3.2 Kết chọn lọc chuyển gen môi trường bổ sung Kanamycin 25mg/l 39 Bảng 3.3 Kết đánh giá hiệu chuyển gen HSP101 thuốc .42 Khóa luận tốt nghiệp 4A viii Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học DANH MỤC HÌNH ẢNH TRONG KHĨA LUẬN Hình 1.1 Cấu trúc Ti – Plasmid 18 Hình 1.2 Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 20 Hình 2.1: Sơ đồ kiểm tra có mặt gen HSP101 chuyển gen 31 Hình 3.1 Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng vector chuyển gen 35 Hình 3.2 Kết kiểm tra khuẩn lạc PCR enzyme cắt giới hạn 37 Hình 3.3.Hình ảnh giai đoạn trình biến nạp tái sinh tạo thuốc chuyển gen 41 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi HSP101 .44 Khóa luận tốt nghiệp 4A ix Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nơng học MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, biến đổi khí hậu diễn ngày phức tạp có xu hướng lan rộng toàn cầu Hiện tượng bất thường thời tiết nắng nóng, lạnh, lũ lụt, hạn hán diễn với mức độ ngày thường xuyên gay gắt Không tác động đến hoạt động sống người mà sinh vật bị xáo trộn Cây trồng, đối tượng cung cấp lương thực cho người, phải đối mặt trực tiếp với thay đổi bất thường khí hậu, chúng cần có thay đổi để thích ứng sống sinh tồn Việc thích ứng với bất thường khí hậu thơng qua thay đổi hệ thống quản lý kỹ thuật lại khơng đủ để trì suất Mặc dù chăn ni có tiến đáng kể việc phát triển dòng chịu nhiệt, sở di truyền tính đa dạng khả chịu nhiệt thực vật lại chưa biết đến nhiều Các nhà khoa học tìm cách giúp cho trồng có khả thích ứng mạnh mẽ điều kiện bất lợi Sàng lọc gen có khả chống chịu với stress nhiệt độ đưa vào trồng cách tiếp cận nhiều khoa học tiến hành Tuy nhiên tương tác nhiệt độ với q trình hóa sinh diễn phức tạp, không hay nhóm gen mà có tác động qua lại chúng Chính vậy, việc triển khai nghiên cứu nhằm chọn tạo giống trồng nông nghiệp có khả chống chịu điều kiện bất lợi môi trường vấn đề cấp bách giai đoạn Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen chịu nhiệt HSP101 thuốc (Nicotiana tabacum) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả chuyển gen chịu nhiệt HSP101 thuốc Khóa luận tốt nghiệp 4A Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang gen chịu nhiệt HSP101 Mục đích phân lập, tách dòng gen thu nhận DNA mã hóa cho protein mang tính trạng quan tâm sử dụng vào việc chuyển gen để cải tiến giống trồng Để chuyển gen cách dễ dàng có hiệu điều cần thiết thiết kế vector chuyển gen phù hợp Trong nghiên cứu này, từ vector tách dòng gen pBluescriptpUBQ14::HSP101 Nguyễn Xuân Vũ cs (2017) hồn thiện Chúng tơi tiến hành thiết kế vector chuyển gen để ứng dụng trồng Vector chuyển gen mang gen chuyển HSP101 phát triển từ vector chuyển gen pER8 bao gồm: Tạo cấu trúc chứa gen đích gắn cấu trúc mang gen đích thiết kế vào vector chuyển gen f1 (-) ori lacZ ampicillin MCS P lac pUC ori Hình 3.1 Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng vector chuyển gen (A)-vector nhân dòng pBluescipt cắt mở vòng chèn đoạn gen pUBQ14::HSP101 vị trí enzyme cắt giới hạn AscI SpeI vùng MCS (B)-vector chuyển gen pER8 chèn cấu trúc pUBQ14::HSP101 có gen thị chọn lọc kanamycin vùng RB LB Khóa luận tốt nghiệp 4A 35 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học Gen HSP101 đưa sang vector chuyển gen pER8 kích thước 11,9kb có vị trí enzyme cắt giới hạn AscI SpeI Thực cắt đồng thời pBluescript::HSP101 pER8 vector với enzyme AscI SpeI ghép nối enzyme T4 DNA ligase theo sơ đồ mô tả hình 3.1A 3.1B Sản phẩm phản ứng ghép nối biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc nhân dòng nhờ colony-PCR.Vi khuẩn sau biến nạp cấy trải đĩa thạch có kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l Trên môi trường nuôi cấy qua đêm 37oC xuất nhiều khuẩn lạc vi khuẩn E.coli Tiến hành kiểm tra xem khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp hay không, việc quan trọng để chọn vật liệu xác cho thí nghiệm Chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc, ni lỏng tách chiết DNA plasmid, điện di gel agarose 1% , sau kiểm tra PCR enzyme cắt giới hạn Kết kiểm tra ngẫu nhiên khuẩn lạc PCR sử dụng cặp mồi AtHSP101-F pER8-R cho thấy khuẩn lạc có kích thước gen khoảng 1,63 kb (hình 3.2A) tương ứng với đoạn gen khuếch đại cặp mồi AtHSP101-F pER8-R Trong đó, khuẩn lạc số 1, có thêm băng khơng đặc hiệu khoảng 5kb loại bỏ khuẩn lạc Để chắn, tiến hành nuôi tăng sinh khuẩn lạc số sau tách plasmid DNA để kiểm tra enzyme cắt hạn chế Kết cắt enzyme AscI SpeI cho thấy, điện di xuất băng kích thước khoảng 11.9kb 3.7kb (hình 3.2C) tương ứng với kích thước vector pER8 đoạn chèn promoter-gene pUBQ14::HSP101 Từ kết thu chứng tỏ gen HSP101 gắn thành công vào vector chuyển gen pER8 Để đánh giá khả biểu gen AtHSP101 thuốc lá, tiến hành biến nạp vector chuyển gen pER8-UBQ14::HSP101 vào chủng vi khuẩn GV3101 Kết kiểm tra ngẫu nhiên khuẩn lạc Khóa luận tốt nghiệp 4A 36 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học môi trường kháng sinh rifampicin, spectinomycin gentamycin cho thấy hầu hết khuẩn lạc dương tính với cặp mồi AtHSP101-F pER8-R cho kích thước gen khoảng 1,63kb (Hình 3.2B) Từ kết chứng tỏ gen HSP101 gắn vào vector chuyển gen biến nạp vào vi khuẩn sẵn sàng cho thí nghiệm chuyển gen Để khẳng định khả ứng dụng gen HSP101 trồng, đề tài tiến hành nghiên cứu chuyển gen thuốc (A) M (C) 1.63kb (B) M 11.9kb 3.7kb M 1.63kb Hình 3.2 Kết kiểm tra khuẩn lạc PCR enzyme cắt giới hạn M: Thang DNA chuẩn 1kb (A, B) PCR khuẩn lạc để chọn khuẩn lạc tái tổ hợp pER8-UBQ14::AtHSP101 sử dụng cặp mồi pER8-R AtHSP101-F E.coli (A) GV3101 (B) Mũi tên đoạn khuếch đại kích thước khoảng 1.63kb tương ứng với kích thước mong muốn (C) Kiểm tra đoạn chèn enzyme cắt hạn chế AscI SpeI cho hai đoạn 11.9kb 3.7kb tương ứng với kích thước vector pER8 UBQ14::AtHSP101 3.2 Kết chuyển gen HSP101 vào giống thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens Chuyển gen chịu nhiệt HSP101 vào giống thuốc K326 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens GV3101 bước quan trọng tồn q trình tạo chuyển gen Trong nghiên cứu chúng tơi Khóa luận tốt nghiệp 4A 37 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học áp dụng theo quy trình chuyển gen quan tâm vào thuốc thông qua A.tumefaciens theo phương pháp Topping cải tiến [39] Cây thuốc in vitro 15 ngày tuổi (hình 3.3A) sử dụng làm vật liệu chuyển gen Chọn có kích thước khoảng 2-3cm (hình 3.3B) cắt thành mảnh kích thước 1-1,5cm 2, sau lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens mang gen HSP101 chuẩn bị sẵn (hình 3.3C) Sau lây nhiễm với vi khuẩn, mẫu lây nhiễm chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy RMOP (bảng 2.2) ngày điều kiện 28 oC Mẫu lây nhiễm sau rửa nước cất vơ trùng cấy chuyển sang mơi trường chọn lọc RMOP có bổ sung kháng sinh kanamycin (bảng 2.2) để chọn lọc chồi chuyển gen (hình 3.3D) Quá trình chuyển gen thực 10 lần, lần 30 mẫu Kết thống kê bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết chuyển gen HSP101 thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens Thí nghiệm TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 TN10 Tổng cộng Số mẫu biến nạp (mẫu) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 300 Số mẫu sống sót sau … ngày 14 ngày 28 16 30 15 27 19 29 17 26 12 27 11 30 14 28 12 30 18 30 19 285 153 Số mẫu tạo chồi 12 13 17 14 12 12 10 16 17 132 Sử dụng chủng vi khuẩn chuyển A.tumefaciens GV3101 mang vector chuyển gen pER8-HSP101 chuyển gen vào mảnh thuốc giống K326 Kết thu bảng 3.1 cho thấy sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen cấu trúc pER8-HSP101 vào 300 mảnh thuốc thu 285 mẫu sống sót sau ngày đạt 95% 153 mẫu sống sót sau 14 ngày đạt 51% so với tổng Khóa luận tốt nghiệp 4A 38 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học số mẫu biến nạp Số mẫu sống xót tiếp tục tái sinh tạo chồi thu kết cao 132 mẫu tạo chồi, đạt 86% so với tổng số mẫu sống xót Chứng tỏ bước đầu biến nạp chuyển gen thành cơng 3.3 Chọn lọc phân tích hiệu chuyển gen Do vector pER8-HSP101 có mang đoạn gen kháng kanamycine, nên môi trường sau biến nạp bổ sung kanamycine để chọn lọc cụm chồi chuyển gen Trong nghiên cứu này, tơi tiến hành thí nghiệm chọn lọc cụm chồi/cây sống xót sau biến nạp mơi trường chọn lọc có bổ sung thêm 25mg/l kanamycin Cefotacime (250mg/l) bổ sung vào môi trường nhằm loại bỏ vi khuẩn xót lại mảnh Kết sau 7-14 ngày quan sát thấy chồi xanh mang cấu trúc gen chuyển, kháng kháng sinh chọn lọc nên phát triển xanh tốt Những chồi vàng úa, héo khơng mang cấu trúc gen chuyển nên bị kháng sinh chọn lọc đào thải Bảng 3.2 Kết chọn lọc chuyển gen môi trường bổ sung Kanamycin 25mg/l Số mẫu sống sót tạo Số mẫu Số tạo cụm chồi sau Thí nghiệm chọn lọc thành (cây) (chồi) ngày 14 ngày Đ/c 30 0 TN1 30 25 14 TN2 30 28 12 TN3 30 21 12 TN4 30 25 17 11 TN5 30 27 14 TN6 30 25 11 TN7 30 28 21 12 TN8 30 27 15 11 TN9 30 23 10 TN10 30 24 18 14 Tổng cộng 330 253 144 92 Thí nghiệm chọn lọc chuyển gen HSP101 vào mảnh thuốc môi trường bổ sung kanamycin 25mg/l bố trí ngẫu nhiên, lặp lại 10 lần, lần với 30 mảnh nguyên liệu Kết thu bảng 3.2 cho Khóa luận tốt nghiệp 4A 39 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nơng học thấy, sau 10 lần thí nghiệm mẫu chọn lọc chồi với 300 mẫu chọn lọc thu 253 mẫu sống sót tạo cụm chồi sau ngày đạt xấp xỉ 77% 144 mẫu sống sót tạo cụm chồi sau 14 ngày đạt 43% so với tổng số mẫu chọn lọc chồi, tất cụm chồi sinh trưởng phát triển tốt (có thân, xanh đậm) Theo lý thuyết dòng tái sinh mơi trường có kháng sinh kanamycin dòng genom chúng có mang gen kháng kanamycin Do tạm kết luận mẫu biến nạp thành cơng có tồn gen kháng kanamycin tế bào mảnh nên mảnh tiếp tục tái sinh đa chồi môi trường có kháng sinh kanamycin Ngược lại, mảnh thuốc không chuyển gen cấy chuyển lên môi trường chọn lọc có 25mg/l kanamycin làm mẫu đối chứng (Đ/c), 100% mẫu bị vàng dần chết không tái sinh chồi sau 14 ngày (hình 3.3E), chứng tỏ tế bào mảnh không biến nạp không chứa gen kháng kanamycin nên chúng tái sinh mơi trường có kháng sinh Điều cho thấy dòng thuốc tái sinh mơi trường chọn lọc dòng chuyển gen Lựa chọn chồi sống xót khỏe mạnh đạt chiều cao khoảng 2-3cm, cấy chuyển sang môi trường rễ tạo thành hoàn chỉnh kết thu tất 92 tạo thành Các rễ, khỏe mạnh sau 2-3 tuần đưa bầu đất trồng nhà lưới Các thuốc chuyển gen sau trồng nhà lưới khoảng tuần tiến hành thu mẫu để phân tích, kiểm tra có mặt hoạt động gen chuyển HSP101 Khóa luận tốt nghiệp 4A 40 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nơng học Hình 3.3.Hình ảnh giai đoạn q trình biến nạp tái sinh tạo thuốc chuyển gen A: Cây thuốc gieo trồng in vitro 15 ngày tuổi; B: Lá thuốc vô trùng dùng cho biến nạp; C: Mảnh ngâm dịch huyền phù vi khuẩn mang vector chuyển gen; D: Mảnh môi trường đồng nuôi cấy; E: Các mảnh không biến nạp đặt môi trường bổ sung kháng sinh vàng dần chết; F: Tái sinh đa chồi; G: Kéo dài chồi; H: Ra rễ tạo hoàn chỉnh; I: Ra bầu đất trồng nhà lưới 3.4 Phân tích biểu gen chuyển HSP101 thuốc Việc đánh giá chuyển gen việc làm cần thiết, qua bước đầu kiểm tra có mặt gen đích sản phẩm chuyển gen Hiện PCR kỹ thuật tốt để thực điều PCR cho phép nhân số lượng lớn nguyên đoạn DNA thời gian ngắn Đây phương pháp thường dùng phân tích dòng chuyển gen độ tin cậy cao Theo lí thuyết ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu nhân xác đoạn gen nằm hai mồi Khi tiến hành PCR DNA tách từ chuyển gen, cho kết đặc hiệu với cặp mồi ta kết luận mang đoạn gen cần chuyển Khóa luận tốt nghiệp 4A 41 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học Để đánh giá hiệu chuyển gen, tiến hành phương pháp: thứ sử dụng phương pháp đĩa (leaf-disk) thứ hai sử dụng phương pháp phân tích phản ứng PCR Mỗi thí nghiệm chọn ngẫu nhiên Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.3 Đánh giá biểu gen thông qua gen chọn lọc kanamycin: Cắt để ni cấy mơi trường có bổ sung kanamycin 25mg/l Sau 14 ngày theo dõi cho thấy tất thí nghiệm sống sót, đối chứng (Đ/c) chết sau 14 ngày xử lý (bảng 3.3, hình 3.3E) Để có kết xác hơn, chúng tơi tiến hành tách chiết DNA tổng số phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu AtHSP101 Kết cho thấy 24/30 mẫu thí nghiệm chuyển gen dương tính Kết thể bảng 3.3 hình 3.4 Bảng 3.3 Kết đánh giá hiệu chuyển gen HSP101 thuốc Thí nghiệm Đ/c TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 Cây thí nghiệm TN1-1 TN1-2 TN1-3 TN2-1 TN2-2 TN2-3 TN3-1 TN3-2 TN3-3 TN4-1 TN4-2 TN4-3 TN5-1 TN5-2 TN5-3 TN6-1 TN6-2 Khóa luận tốt nghiệp 4A Số mẫu sống sót mơi trường kháng sinh sau ngày 14 ngày 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 42 Kết PCR _ + + + + + + + _ _ + + + + + _ _ _ Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học Thí nghiệm TN7 TN8 TN9 TN10 Tổng cộng Cây thí nghiệm TN6-3 TN7-1 TN7-2 TN7-3 TN8-1 TN8-2 TN8-3 TN9-1 TN9-2 TN9-3 TN10-1 TN10-2 TN10-3 31 Số mẫu sống sót môi trường kháng sinh sau ngày 14 ngày 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 30 30 Kết PCR + + + + + + + + + + + + _ Ghi chú: (+): mẫu dương tính với cặp mồi AtHSP101 (-): mẫu âm tính với cặp mồi AtHSP101 Khóa luận tốt nghiệp 4A 43 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nơng học Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi HSP101 M: Thang DNA chuẩn 1kb; (-): Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn AND tách từ thuốc không chuyển gen; (+): Đối chứng dương plasmid pER8-HSP101; 1-30: 30 thuốc chuyển gen Ghi chú: 1: TN1-1 7: TN3-1 13: TN5-1 19: TN7-1 25: TN9-1 2: TN1-2 8: TN3-2 14: TN5-2 20: TN7-2 26: TN9-2 3: TN1-3 9: TN3-3 15: TN5-3 21: TN7-3 27: TN9-3 4: TN2-1 10: TN4-1 16: TN6-1 22: TN8-1 28: TN10-1 5: TN2-2 11: TN4-2 17: TN6-2 23: TN8-2 29: TN10-2 6: TN2-3 12: TN4-3 18: TN6-3 24: TN8-3 30: TN10-3 Kết phân tích cho thấy, có 24/30 cho kết dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu AtHSP101, lại 6/30 cho kết âm tính, q trình trao đổi chất tự nhân lên tế bào có đột biến xảy tượng trao đổi chéo,… nên gen HSP101 chuyển vào khơng ngun vẹn, cặp mồi khơng tìm vị trí để bắt cặp vào đoạn gen dự kiến khơng nhân lên Đối chứng dương plasmid pER8-HSP101 làm khuôn mẫu Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu AND tổng số tách chiết từ thuốc không chuyển gen cho kết âm tính Điều đảm bảo đoạn gen khơng có sẵn không chuyển gen Như vậy, kết dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu AtHSP101 30 thuốc chuyển gen chứng tỏ thuốc có mang cấu trúc gen cần chuyển Khóa luận tốt nghiệp 4A 44 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen HSP101 biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium GV3101 1.2 Tạo thuốc chuyển gen mang gen HSP101 phòng thí nghiệm phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A.tumefaciens chủng GV3101 hiểm tra có mặt gen chuyển HSP101 với kích thước khoảng 1,63kb (phù hợp với kích thước gen xác định trình tự) thuốc phương pháp PCR Đề nghị 2.1 Kiểm tra cấu trúc gen pER8-HSP101 hạt thuốc cách phân tích thành phần protein 2.2 Đánh giá khả chịu nóng chuyển gen điều kiện nhiệt độ cao Khóa luận tốt nghiệp 4A 45 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tài liệu tiếng việt Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lạng cộng (2016) Chọn tạo giống lúa chống chịu nóng thị phân tử Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai, 235-245 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng NXB Nông Nghiệp Nguyễn Đức Thành, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Diệu Muội, 1994 Nghiên cứu chuyển gen lục lạp thuốc Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 1994 Nguyễn Hồng Minh cộng (1999) Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chịu nóng Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, 1989 Chuyển gen kháng kanamycin vào mô thuốc (N tabacum) mô cà úc vi khuẩn A.tumefaciens tạp chí di truyền 1/1989 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005) Giáo trình cơng nghệ sinh học nông nghiệp NXB NN – Hà Nội Nguyễn Thị Lạng, Phạm Thị Thu Hà, Phạm Công Trứ, Trần Bảo Tồn, Bùi Chí Bửu, Young-Chan Cho (2015) Chọn tạo giống lúa chịu nhiệt dựa hỗ trợ marker đánh dấu Việt Nam Giống trồng Công nghệ sinh học 3: 274 ~ 281 Nguyễn Thị Thu Hiền (2011), Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc C9-1 nhằm tạo thuốc chuyển gen kháng bệnh khảm lá, Hà Nội 5/2011 Nguyễn Xuân Vũ, Nguyễn Tiến Dũng (2017) Nghiên cứu tuyển chọn tách dòng số gen chịu nóng phục vụ cơng tác chọn tạo giống chịu nóng thích ứng biến đổi khí hậu Việt Nam Đề tài nghiên cứu cấp sở trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 10 Phạm Đình Thái, Nguyễn Duy Minh, Nguyễn Lương Hùng Sinh lý học thực vật NXB GD, Hà Nội (1987) Khóa luận tốt nghiệp 4A 46 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học 11 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6(4A): 679687 12 Trần Đăng Kiên, Nông Văn Hải, Vũ Đức Quang, Trần Thị Vui, Đào Thị Xuân Nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc có khả kháng sâu bệnh Báo cáo đề tài khoa học 1999 13 Trần Phương Liên, Nông Văn Hải, Lê Xuân Tú, 1994 Nghiên cứu biến nạp số gene chọn lọc vào dòng thuốc cách sử dụng Tiplasmid vector Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 1994 14 Trần Thị Thanh Thảo (2009) Nghiên cứu tạo thuốc chuyển gen kháng sâu vip3A Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Bộ Giáo Dục Đào tạo, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Tài liệu tiếng anh 15 Abdullah F, Hareri F, Naaesan M, Ammar MA, ZuherKanbar O (2011) Effect of drought on different physiological characters and yield component in different varieties of syrian durum wheat J Agr Sci 3(3) 16 Chang CC, Huang PS, Lin HR and Lu CH (2007) Transactivation of Protein Expression by Rice HSP101 in Planta and Using Hsp101 as a Selection Marker for Transformation Plant Cell Physiol 48(8):1098– 1107 17 De Block M, Verduyn C, De Brouwer D, Cornelissen M (2005) Poly (ADPribose) polymerase in plants affects energy homeostasis, cell death and stress tolerance Plant J 41: 95–106 18 Foolad MR (2005) Breeding for abiotic stress tolerances in tomato In: Ashraf, M., Harris, P.J.C (Eds), Abiotic Streses: Plant Resistance Through Breeding and Molecular Approaches The Haworth Press Inc, New York, USA, pp 613-684 19 Gulzar SS, Shabir HW, Wasim H, Singh NB (2011) Engineering cold stress tolerance in crop plants Curr Genomics 12(1): 30–43 20 Hall AE (2001) Crop responses to environment CRC Press, LLC, Boca Raton, Florida Khóa luận tốt nghiệp 4A 47 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học 21 Howarth CJ (2005) Genetic improvements of tolerance to high temperature in: abiotic stress plant resistance through breeding and molecular approaches, Ashraf, M and P.J.C Harris (Eds.) Howarth Press Inc., New York 22 Jagadish SVK, Craufurd PQ, and Wheeler TR (2008) Phenotyping Parents of mapping population of rice for heat tolerance during anthesis Crop Sci 48: 1140-1146 23 Jouyban Z (2012) The Effects of Salt stress on plant growth Tech J Engin & App Sci 2(1): 7-10 24 Kilian J, Whitehead D, Horak J, Wanke D, Weinl S, Batistic O, D'Angelo C, Bornberg-Bauer E, Kudla J, Harter K (2007) The AtGenExpress global stress expression data set: protocols, evaluation and model data analysis of UV-B light, drought and cold stress responses Plant J 2:347-63 25 Ko CB, Woo YM, Lee DJ, Kim CS (2007) Enhanced tolerance to heat stress in transgenic plants expressingthe GASA4 gene Plant Mol Biol 48, 667-681 26 Lindquist S and Craig EA (1988) The heat-shock proteins Annu Rev Genet 22:631-677 27 Maestri EN, Klueva C, Perotta M, Gulli HT, Nguyen N, Marmiroli (2002) Molecular genetics of heat tolerance and heat shock proteins in cereals Plant Mol Biol 48, 667- 681 28 Queitsch C, Hong SW, Vierling E, Lindquist S (2000) Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis Plant Cell 12(4):479-92 29 Schoffl F, Prandl R, Reindl A (1999) Molecular responses to heat stress In: Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (Eds), Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants R G Landes Co, Austin, Texas: 81–98 Khóa luận tốt nghiệp 4A 48 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Khoa Nông học 30 Timperio AM, Egidi MG, Zolla L (2008) Proteomics applied on plant abiotic stresses: Role of heatshock proteins (HSP) Journal of proteomics 71 (2008): 391-411 31 Topping TF (1988), Tobaco tranfomation Methods of Molecular Biology, 81:365 32 Vierling E (1991) The Roles of Heat Shock Proteins in Plants Annu Rev.Plant Physiol & Plant Mol Biol 42:579-620 33 Wahid A, Gelani S, Ashraf M, Foolad MR (2007) Heat tolerance in plants: An overview Environmental and Experimental Botany 61: 199– 223 34 Wu X, Shiroto Y, Kishitani S, Yukihiroto, Kinya Yoriyama (2009) Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing OsWRKY11 under the control of HSP101 promoter Plant Cell Rep (2009) 28:21-30 35 Yokotani N, Ichikawa T, Kondou Y, Matsui M, Hirochika H, Iwabuchi M, Oda K (2008) Expression of rice heat stress transcription factor OsHsfA2e enhances tolerance to envitronmental stresses in transgenic Arabidopsis Planta 227: 957-967 36 Zhu L, Xiao YH, Wang CM, Jiang L, Zhai HQ, Wan JM (2005) Mapping QTLs for heat tolerance during grain filing in rice Chinese Journal of Rice Science 19, 117-121 37 Zidenga T (2005) Improving stress tolerance through energy homeostasis in plants Department of Plant Cellular and Molecular Biology, Ohio State University Khóa luận tốt nghiệp 4A 49 Nguyễn Thùy Linh - D - CNSH ... đề tài: Nghiên cứu chuyển gen chịu nhiệt HSP101 thuốc (Nicotiana tabacum) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả chuyển gen chịu nhiệt HSP101 thuốc Khóa... bắn gen - Chuyển gen nhờ silicon carbide 1.5.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp - Chuyển gen nhờ virus - Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium nghiên cứu. .. dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen HSP101 Nội dung 2: Nghiên cứu chuyển gen chịu nhiệt HSP101 thuốc Nội dung 3: Nghiên cứu phương pháp chọn lọc đánh giá hiệu chuyển