ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐÀO MAI PHƢƠNG PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU (Anemarrhena asphodeloides ) Ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 8.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS PHẠM VĂN KHANG THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Học viên Đào Mai Phƣơng i N NHẬN XÉT H CỦA Ậ GIÁO N VIÊN X HƢỚN É G DẪN T C Ủ A K H O A C H U Y Ê N M Ô N i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc của mình tới TS Phạm Văn Khang - người thầy đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và các học viên cao học K24 trong phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn các em sinh viên nghiên cứu đề tài khoa học hợp chất thiên nhiên đã cùng cộng tác với tôi trong trong việc tiến hành các thí nghiệm thuộc đề tài luận văn Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban lãnh đạo khoa Hóa và phòng Đào tạo sau đại học - trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này Thái nguyên, tháng 5 năm 2018 Học viên ĐÀO MAI PHƢƠNG ii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ 3 Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt dùng trong luận văn iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình vi MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 3 1.1 Khái quát về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) 3 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 3 [1] 1.1.2 Công dụng của loài Tri mẫu 5 1.2 Tình hình nghiên cứu về hoạt tính sinh học loài Tri mẫu 5 1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của loài Tri mẫu 14 1.3.1 Nhóm hợp chất saponin 14 1.3.2 Nhóm hợp chất phenolic 21 Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM 25 2.1 Hóa chất và thiết bị phân lập 25 2.1.1 Hóa chất 25 2.1.2 Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học 25 2.1.3 Thiết bị 25 2.2 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được 26 2.2.1 Xử lý mẫu thực vật 26 2.2.2 Chiết tách các chất 26 2.2.3 Xác định cấu trúc các chất 26 2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 26 2.3.1 Vật liệu và hóa chất 26 2.3.2 Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) 27 2.4 Chiết xuất hợp chất từ thân rễ Tri mẫu 28 4 2.4.1 Chiết xuất cao etanol từ thân rễ của loài Tri mẫu 28 2.4.2 Phân lập, tinh chế các hợp chất 28 2.4.3 Các giá trị phổ 1H, 13C-NMR của AA1, AA2 và AA3 31 2.4.4 Xác định hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào HeLa ( tế bào ung thư cổ tử cung) và tế bào A549 (tế bào ung thư gan) 32 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết quả phân lập các hợp chất 34 3.2 Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất 34 3.2.1 Phân tích cấu trúc hợp chất AA1 34 3.2.2 Phân tích cấu trúc hợp chất AA2 41 3.2.3 Phân tích cấu trúc hợp chất AA3 47 3.3 Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư HeLa (cổ tử cung) và A549 (tế bào ung thư gan) 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN 13 C-NMR 13 : C-Nucler Magnetic Resonance 13 : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C 1 H-NMR 1 : H-Nucler Magnetic Resonance 1 : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H NOESY : Nuclear Overhauser Spectroscopy : Phổ tương quan hai chiều H-H DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer : Phổ DEPT ESI-Ms : Electron Impact Mass Spectroscopy : Phổ khối lượng HMBC : Heternuclear multiple - Bond Corelation : Phổ tương quan hai chiều H-C iv H R : H et er nu cl ea r Sp ec tro sc op yQ ua nt u m C oh er en ce Chro mato graph y : Nor mal – Phas e Chro mato graph y : Ph ổ tư ơn g tá c CH : Re ve rs ed – Ph as e iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Kết quả hạ đường huyết của dịch chiết nước Tri mẫu [3] 11 Bảng 1.2 Kết quả hạ đường huyết của cao Tri mẫu chiết bằng cồn 80o [3] 11 1 Bảng 3.1: Mốt số tín hiệu cộng hưởng trên H-NMR của chất AA1 và Sarsasapogenin 35 1 13 Bảng 3.2 Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân H và C 37 Bảng 3.3 Sự tương quan giữa HC của chất AA3 50 Bảng 3.4: Tác động gây độc tế bào ung thư của các mẫu nghiên cứu 53 5 20 Tsukamoto S, Wakana T, Koimaru K, Yoshida T, sato M, Ohta T (2005), “7-Hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl) chromanand Broussonin B: Neurotrophic Compounds, Isolated from Anemarrhena asphodeloides Bunge, Functionas Proteasome Inhibitors”, Biol Pharm Bull, 28(9), 1798-1800 21 Hu Y, Xia Z, Sun Q, Orsi A, Rees D (2005), "A new approach to the pharmacological regulation of memory: Sarsasapogenin improves memory by elevating the low muscarinic acetylcholine receptor density in brains of memory-deficit rat models", Brain research, 1060(1-2), 26-39 22 Kang L P, Ma B, shit T, Zang J, Xiong C (2006), “two new furostanol saponins from rhizomes of Anemarrhena asphodeloides ”, Acta Pharmaceu Sinica, 41(6), 527-532 23 Nian H, Qin L P, Chen W S, Zhang Q Y, Zheng H C, Wang Y (2006), "Protective effect of steroidal saponins from rhizome of Anemarrhena asphodeloides on ovariectomy-induced bone loss in rats", Acta Pharmacologica Sinica, 27(6), 728-734 24 Ren L X, Luo Y F, Li X, Zuo D.Y, Wu Y L (2006), "Antidepressant-Like Effects of Sarsasapogenin from Anemarrhena asphodeloides Bunge", Bio Pharn Bull, 29(11), 2304-2306 25 Sun Q, Sun A, Liu R (2006), “Preparative isolation and purification of 4 compounds from asphodeloides the Chinese medicinal herb Anemarrhena by high-speed counter-current chromatography”, Chromatography A, 1104, 69 -74 26 Xiao SZ, Xu ME, Ge YK, Xiao GF (2006), " Inhibitory effects of saponins from Anemarrhena asphodeloides Bunge on the growth of vascular smooth muscle cells", Biomedical and Environmental Sciences, 19(3), 185-191 27 Bae G, Yu JR, Lee J, Chang J, Seo EK (2007), "Identification of nyasol and structurally related compounds as the active principles from Anemarrhena asphodeloides against respiratory syncytial virut (RSV)", Chem Biodivers, 4(9), 2231-2235 59 28 Bao W, Pan H, Lu M, Ni Y, Zhang R, Gong X(2007), "The apoptotic effect of Sarsasapogenin from Anemarrhena asphodeloides on HepG2 human hepatoma cells", Cell Biology International, 31(9), 887-892 29 Oh J K, Hyun S Y, Oh H R, Jung J W, Park C, Lee S Y, Park J H, Kim S Y, Kim K H, Kim Y K, Ryu J H (2007), "Effects of Anemarrhena asphodeloides on Focal Ischemic Brain InJury Induced by Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats", Bio Pharn Bull, 30(1), 38-43 30 Peng Y, Sun Y, Liu L, Liu B, Lin D, Li L, Song S(2007), saponins from Anemarrhena asphodeloides “Two new Bunge”, Chinese Chemical Letters, 18, 171-174 31 Sy L K, Che C M, Yan S C, Lok C N, Man R Y (2008), "Timosaponin A-III induces autophagy preceding mitochondria-mediated apoptosis in HeLa cancer cells", Cancer Res, 68, 10229-10237 32 Zhang Y, Xia Z, Hu Y, Orsi A, Rees D (2008), "Role of glial cell derived Role of glial cell derived neurotrophic factor in the protective effect of smilagenin on rat mesencephalic dopaminergic neurons damaged by MPP ”, FEBS Letters,582,956–960 33 Ni Y, Gong X G, Lu M, Chen H M, Wang Y (2008), "Mitochondrial ROS burst as an early sign in sarsasapogenin-induced apoptosis in HepG2 cells", Cell Biology International, 32, 337-343 34 Nicholson Ralph, Vermerris Wilfred (2008), “Phenolic Compound Biochemistry”, springer, USA, 2 35 Qin L, Han T, Zhang Q, Cao D, Nian H, Rahman K, Zheng H(2008), “Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula”, Journal of Ethnopharmacology, 118(2), 271-279 36 Shin J S, Noh Y S, Kim D H, Cho Y W, and Lee K T (2008), "Mangiferin isolated from the rhizome of Anemarrhena asphodeloides inhibits the LPS-induced nitric oxide and prostagladin E2 via the NF- κB inactivation in inflammatory macrophages", Natural product sciences, 14(3), 206-213 60 37 Youn U J, Lee Y S,Jeung H, Nam J W, Lee Y J, son Y M, Hwang E S, seo E K (2009), "Minor phenolic constituents of the Anemarrhena asphodeloides ", Natural Product Sciences, 15(4), 2003-2007 38 Lee B, Jung K, Kim D K (2009), “Timosaponin A-III, a saponin isolated from Anemarrhena asphodeloides , ameliorates learning and memory deficits in mice”, Pharmacol Biochem Behav, 93(2), 121-127 39 Lim H, Nam J W, Seo E K, Kim Y S, Kim H P (2009), " (-)-Nyasol (cishinokiresinol), a Norneolignan from the Rhizomes of Anemarrhena asphodeloides , is a Broad Spectrum Inhibitor of Eicosanoid and Nitric Oxide Production", Arch Pharm Res, 32(11), 1509-1514 40 Lu WQ, Qiu Y, Li TJ, Tao X, sun LN, Chen WS (2011), “antiplantelet and antithrombotic activities of timosaponin B-II, an extract of Anemarrhena asphodeloides ”, Clin Exp Pharmacol Physiol, 38(7), 430-434 41 Miura T, Ichiki H, Iwamoto N, Kato M, Kubo M, Sasaki H, Okada M, Ishida T, Seino Y, Tanigawa K (2011), " Antidiabetic activity of the rhizoma of Anemarrhena asphodeloides mangiferin and its and active components, glucoside", Biol Pharm Bull, 24(9), 1009-1011 42 Xiao S F, Xue H B, Li X, Chen C, Li G J, Yuan C M, Zhang M Y(2011), "A double-blind, placebo-controlled study of traditional Chinese medicine sarsasapogenin added to risperidone in patients with negative symptoms dominated schizophrenia", Neurosci Bull, 27(4), 258- 268 43 Chae S, Piao M J, Kang K A, Zhang R, Kim K C, Youn U J, Nam K W, Lee J H, Hyun J W (2011), "Inhibition of Matrix metalloproteinase1 induced by oxidative stress in human keratinocytes by mangiferin isolated", Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 75(12), 2321-2325 44 Han SY, Chin YW(2011), "A FLT3-inhibitory constituent from the rhizomes of Anemarrhena asphodeloide", Journal of Enzyme Inhibition andMedicinal Chemistry, 26(3),445-448 61 45 Kang Y J, Chung H J, Nam J W, Phark H J, seo E K, Kim Y S, Lee D, Lee S K (2011), “Cytotoxic and antineoplastic activity of timosaponin AIII for human colon cacer cells”, J Nat Prod, 74(4), 701-706 46 Kim H S, Song J H, Youn U J, Hyun J W, Jeong W S, Lee M Y, Choi H J, Lee H K, Chae S (2012), "Inhibition of UVB-induced wrinkle formation and MMP-9 expression by mangiferin isolated from Anemarrhena asphodeloides ", European Journal of Pharmacology, 689(3), 38-44 47 Park E , Yang Y J, Kim A, Kwak J H, Jung Y H, Kang S C, Kim I S (2012), “Synthesis of norlignans and in vitro inhibitory activity of antigeninduced degranulation”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 22, 3653-3655 48 Huang J F, Shang L, Liu P, Zhang M Q, Chen S, Chen D, Fan C L, Wang H, Xiong K (2012), "Timosaponin-BII inhibits the up-regulation of BACE1 induced by Ferric Chloride in rat retina", BioMed central, 12(189) 49 Jung J S, Jung K, Kim DH, Kim HS(2012), "Selective inhibition of MMP9 gene expression by mangiferin in PMA-stimulated human astroglioma cells: Involvement of PI3K/Akt And MAPK Signaling pathways", Pharmacological Research, 66, 95-103 50 Kwon J, KondaJi G, song S, Kim C, Lee K, Kim W, Choi Y (2013), “Synthesis of Naturally Occurring Norlignan (±)-Nyasol”, Bull Korean Chem Soc, 34(4), 1247-1249 51 Lee H J, Li H, Chang H R, Jung H, Lee D Y, Ryu J H (2013), "(-)Nyasol, isolated from Anemarrhena asphodeloides suppresses neuroinflammatory response through the inhibition of I-κBα degradation in LPS stimulated BV-2 microglial cells", Inhibition and Medicinal Chemistry, 28(5), 954-959 52 Li X, Cui X, Wang J, Yang J, sun X, Li X, Zhu Q, Li W (2013), “Rhizome of Anemarrhena asphodeloides counteracts diabetic ophthalmopathy progression in streptozotocin-induced diabetic rats”, Phytother Res, 27(8), 1243-1250 62 53 Liu Q B , Peng Y , Li L Z , Gao P Y, sun Y, Yu L H & Son S J (2013), "Steroidal saponins from Anemarrhena asphodeloides ", Journal of Asian Natural Products Research, 15(8), 891-898 54 Shen S, Zhang Y, Zhang R, Gong X(2013), "Sarsasapogenin induces apoptosis via the reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway and ER stress pathway in HeLa cells", Biochemical and Biophysical Research Communications, 441(2), 519-524 55 Jang S E, Jeong J J, Huam S R, Han M J, Kim D H (2013), “anticolitic effect of the Rhizome mixture of Anemarrhena asphodeloides and Coptidis chinensis (AC-mix) in mice”, Biomol ther (Seoul), 21(5), 398-404 56 Liu M, Tao L, Chau S L, Wu R, Zhang H, Yang Y, Yang D, Bian Z, Lu A, Han Q, Xu H (2014), "Folding fan mode counter-current chromatography offers fast blind screening for drug discovery Case study: finding anti-enterovirut 71 agents from Anemarrhena asphodeloides ", Journal of Chromatography A, 14(1368), 116-124 57 Yuan J C, Zhang J, Wang F X, Pang X, Zhao Y, Xiong C Q, Ma B P (2014), "New steroidal glycosides from the rhizome of Anemarrhena asphodeloides ", Asian Natural Products Research, 16(9), 901-909 58 Appian Subramoniam (2016), Plants with anti-diabetes mellitus properties, Taylor & Francis Group, U.S, 58-59 59 Sy L K, Lok C N, Wang J Y, Liu Y, Cheng L, Wan P K, Leung C T, Cao B, Kwong W L, Chang C C và Che C M (2016), “Identification of "sarsasapogenin-aglyconed" timosaponins as novel Ab-lowering modulators of amyloid precursor protein processing”, Chemical Science 60 Bing-You Yang, Xue-Yan Bi, Yan Liu, Guo-Yu Li, Xin Yin and Hai-Xue Kuang (2017) “Four New Glycosides from the Rhizoma of Anemarrhena asphodeloides”, Molecules , 22 61 P.V.Khang, D.M.Phuong, Lei Ma (2017), “New steroids from Anemarrhena asphodeloides rhizome and their α-glucosidase inhibitory activity” , Journal of Asian Natural Products Research, vol 19 (5), 468-473 (SCI-E) 63 PHỤ LỤC 1 Hình S1: Phổ H-NMR giãn của chất AA1 1 Hình S2: Phổ H-NMR giãn của chất AA1 13 Hình S3: Phổ C-NMR giãn của chất AA1 13 Hình S4: Phổ C-NMR giãn của chất AA1 Hình S5: Phổ DEPT giãn của chất AA1 Hình S6: Phổ HSQC giãn của chất AA1 Hình S7: Phổ HSQC giãn của chất AA1 Hình S8: Phổ HMBC giãn của chất AA1 Hình S9: Phổ HMBC giãn của chất AA1 Hình S10: Phổ NOESY của chất 1 1 Hình S11: Phổ H-NMR giãn của chất AA2 1 Hình S12: Phổ H-NMR giãn của chất AA2 13 Hình S13: Phổ C-NMR giãn của chất AA2 13 Hình S14: Phổ C-NMR giãn của chất AA2 Hình S15: Phổ DEPT giãn của chất AA2 Hình S16: Phổ HSQC giãn của chất AA2 Hình S17: Phổ HSQC giãn của chất AA2 Hình S18: Phổ HMBC giãn của chất AA2 Hình S19: Phổ HMBC giãn của chất AA2 ... phần hóa học lồi Tri mẫu, việc khai thác sử dụng thực vật chưa quan tâm mức Dó chúng tơi đề xuất đề tài: „? ?Phân lập, xác định cấu trúc đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ số hợp chất hóa học. .. chế hợp chất 28 2.4.3 Các giá trị phổ 1H, 13C-NMR AA1, AA2 AA3 31 2.4.4 Xác định hoạt tính độc tế bào dòng tế bào HeLa ( tế bào ung thư cổ tử cung) tế bào A549 (tế bào ung thư gan) ... ung thư biểu bì (SUNE- 1), ung thư gan (HepG 2), ung thư biểu mô cổ (HeLa), ung thư vú (MCF- 7), đồng thời thể ức chế nhiều dạng tế bào ung thư khác số hoạt tính sinh học hoạt tính chống oxi hóa,