BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH CỘNG ĐỒNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ DGGE TỪ RƠM TRƯỚC VÀ SAU KHI XỬ LÝ TRỒNG NẤM RƠM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS HOÀNG QUỐC KHÁNH CN NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực : HOÀNG NGỌC PHƯƠNG THẢO MSSV: 0851110222 Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật môi trường sống nhằm tìm hiểu thêm đa dạng sinh học mong muốn nhà khoa học giới Trước đây, để phân tích cộng đồng vi sinh vật môi trường tự nhiên, nhà khoa học phải nuôi cấy phân lập qua nhiều công đoạn khác nhau, tốn thời gian công sức lại không đem đến kết mong muốn Trong số tất vi sinh vật tự nhiên, khoảng 99% không phát kỹ thuật ni cấy Vì vậy, sinh học phân tử, phương pháp nhận biết độc lập, khuếch đại giải trình tự gen 16S rDNA, thường sử dụng để có liệu đầy đủ cộng đồng sống môi trường cụ thể, sinh học phân tử đời khắc phục khó khăn hạn chế cơng nghệ sinh học, nhằm góp phần xác định cộng đồng vi sinh vật môi trường nhanh chóng mà khơng phải qua nhiều giai đoạn ni cấy phân lập, qua giúp nhà khoa học hiểu biết nhiều đa dạng sinh học, từ đưa vào ứng dụng nhằm phục vụ cho thực tiễn Áp dụng sinh học phân tử để nghiên cứu cộng đồng vi sinh có rơm rạ giai đoạn trước sau xử lý trồng nấm cần thiết Định danh hệ vi sinh vật có mẫu rơm việc ly trích thu nhận DNA trực tiếp, so sánh thay đổi hệ vi sinh mẫu rơm giai đoạn tiền xử lý trước đưa vào trồng nấm, từ bổ sung hệ vi sinh phù hợp vào giai đoạn rơm tiền xử lý nhằm rút ngắn thời gian ủ rơm trước đưa vào trồng nấm, đem lại hiệu kinh tế cao cho người dân Đây bước khởi đầu quan trọng cho có thêm kiến thức đa dạng sinh học nguồn chất này, góp phần ứng dụng cho nghiên cứu Đồ án tốt nghiệp Tình hình nghiên cứu Ly trích DNA vi sinh vật trực tiếp từ rơm rạ để tìm hiểu cộng đồng vi sinh vật thực số phòng thí nghiệm nơng nghiệp nước Tuy có quy trình ly trích DNA khác chung mục đích thu nhận DNA nhóm vi khuẩn phục vụ cho nghiên cứu Ở Việt Nam, rơm rạ nguồn lượng lớn chưa ứng dụng nhiều so với vai trò mà mang lại Rơm rạ nói riêng từ biomass nói chung khơng sử dụng cách hiệu Phần lớn chúng đốt bỏ trở lại ruộng sau thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho hộ nhà nông, làm chất trồng nấm, làm thức ăn cho gia súc…gây lãng phí nguồn lượng tiềm Việc ly trích thu nhận trức tiếp DNA nhóm vi khuẩn từ rơm chưa nghiên cứu ứng dụng nhiều, chủ yếu phân lập ly trích từ chủng vi sinh cho mục đích nghiên cứu khác Mục đích nghiên cứu - Ly trích thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước sau xử lý trồng nấm - Xác định nhóm vi khuẩn rơm trước sau xử lý trồng nấm phương pháp PCR DGGE, giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 đoạn 16S rDNA - Thành lập phân loài nhóm vi khuẩn có rơm trước sau xử lý Nhiệm vụ nghiên cứu - Ly trích thu nhận DNA tổng số vi sinh trực tiếp từ rơm xử lý trồng nấm - Tiến hành tinh kiểm tra độ tinh DNA nhóm vi khuẩn - Sử dụng phương pháp khuếch đại đoạn gene 16S rDNA vi khuẩn Điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose - Xác định nhóm vi khuẩn rơm phương pháp DGGE vùng V3 thc đoạn gene 16S rDNA - Giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 đoạn 16S rDNA Đồ án tốt nghiệp - Hình thành phân lồi hệ vi khuẩn có rơm trước sau xử lý Phương pháp nghiên cứu - Hình thức thu mẫu: Thu mẫu rơm trước sau xử lý trồng nấm - Ly trích thu nhận DNA tổng số vi sinh phương pháp SDS - Tinh DNA kit: GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit - Xác định nhóm vi khuẩn phương pháp PCR khuếch đại đoạn gene 16S rDNA dựa vào cặp mồi 27F 5’ – GA GTT TGA TCM TGG CTC AG – 3’ 1492R 5’ – TAC GGG TAC CTT GTT CG ACT T – 3’, sau tinh sản phẩm PCR trước phân tích DGGE - Phương pháp DGGE sử dụng để xác định hệ vi khuẩn mẫu: + PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA vi khuẩn thực với cặp mồi chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn 517R 5’ – ATT AC GCG GCT GCT CC – 3’ 357F – GC 5’ – CGC CCG CGC GCG GGC GGG GGG GGG GCA CGG GGG CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ + Thực phương pháp DGGE gel polyacrylamide + PCR vùng V3 đoạn gene 16S rDNA sau DGGE với cặp mồi 357F 5’ – CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ 517R 5’ – ATT ACC GCG GCT GCT GG – 3’ Tinh thu nhận DNA từ gel polyacrylamide Kit QIAEX II trước bước vào giải trình tự lồi + Giải trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA vi khuẩn + Kết giải trình tự so chuỗi chương trình BLAST ngân hàng liệu gene NCBI Kết nghiên cứu - Ly trích thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước sau xử lý trồng nấm rơm - Xác định nhóm vi khuẩn cần nghiên cứu dựa vào khuếch đại đoạn gene 16S rDNA phản ứng PCR - Xác định nhóm vi khuẩn mẫu phương pháp DGGE vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA Đồ án tốt nghiệp - Giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA vi khuẩn - Hình thành phân lồi cộng đồng vi khuẩn có rơm trước sau xử lý Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm chương: - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Vật liệu phương pháp - Chương 3: Kết thảo luận - Chương 4: Kết luận kiến nghị Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rơm rạ 1.1.1 Thành phần cấu tạo rơm rạ Cây lúa ln giữ vị trí trung tâm nơng nghiệp kinh tế Việt Nam Hình ảnh đất Việt thường mơ tả đòn gánh khổng lồ với hai đầu hai vựa thóc lớn Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Đồng Bằng Sông Hồng (ĐBSH) Khoảng 80% số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu dựa vào hình thức canh tác thủ cơng truyền thống [8] Việc sản xuất lúa gạo tạo lượng lớn phế phẩm từ lúa bao gồm rơm trấu Rơm trấu hai số nhiều nguồn biomass phổ biến có tiềm Việt Nam Rơm rạ thành phần hỗn hợp nhiều hợp chất hóa học khác tạo nên thành phần cấu trúc cao phân tử gồm cacbonhydrate, lượng nhỏ protein khoáng Nghiên cứu tế bào qua kính hiển vi cho thấy mơ hình cấu tạo phức tạp rơm Các phần phân đoạn thực vật nói chung rơm rạ nói riêng gồm: đốt (mắt), lóng (thân) Tỷ lệ cấu trúc phân đoạn loài tương đối khác nhiều yếu tố: Loài, vụ mùa, đất, điều kiện khí hậu…Như hệ quả, thành phần hóa học phần phân đoạn thực vật khác cấu tạo lồi khác [17] Thành phần hóa học rơm rạ tính theo khối lượng khô gồm cellulose 60 %, lignin 14%, đạm hữu (protein) 3,4%, chất béo (lipid) 1,9% Nếu tính theo nguyên tố cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%, N khoảng 0,92% , lượng nhỏ photpho (P), lưu huỳnh (S) kali (K) Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Thành phần cấu tạo hóa học phần phân đoạn rơm dạng lúa: lúa ngắn ngày lúa dài ngày (Antongiovanni cộng sự, 1991) [17] Lúa dài ngày Thành phần cấu tạo Lóng Đốt (mắt) Lúa ngắn ngày Lá Lóng Đốt (mắt) Lá g/kg DM Nitơ tổng 34 70 38 26 39 35 Thành tế bào 782 737 787 766 773 800 Tro 100 162 211 184 182 193 Silica 28 26 103 29 55 67 Cellulose 411 327 323 433 332 364 Hemicellulose 245 286 256 242 331 283 Rơm rạ có hai đặc tính là: Hàm lượng N thấp (< 1%), nghèo khoáng vitamin, chứa nhiều xơ thơ nên tỷ lệ tiêu hóa thấp Việc tiêu hóa xơ nhờ hoạt động lên men vi sinh vật đường tiêu hóa Chất xơ rơm chủ yếu cellulose, hemicelluloses lignin Giữa chúng có liên kết hóa học tạo nên bền vững màng tế bào thực vật Cellulose gồm nhiều chuỗi thẳng ghép thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo thành micell bền vững Cellulose có cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử polymer mạch thẳng, đơn vị disaccharide gọi cellobiose, có cấu trúc từ hai phân tử D – glucose Cấu trúc bậc bậc phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với lực liên kết hydro [2] Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên bền vững, phân tử cellulose gồm từ 7000 – 14000 đơn vị glucose tạo thành Hemicellulose heteropolysaccharide với cellulose có màng tế bào thực vật Hemicellulose khơng hòa tan nước hòa tan dung dịch kiềm bị Đồ án tốt nghiệp thủy phân acid dễ dàng so với cellulose Khi bị thủy phân, từ hemicelluloses tạo glucose, fructose, mantose, galactose, cuabinose xylose Thành phần thứ ba đáng ý xơ lignin Lignin kèm với cellulose hemicellulose thành phần tế bào, không hòa tan nước, dung mơi hữu bình thường bền vững enzyme hệ sinh vật cỏ Nhưng tác dụng kiềm lignin phần bị phân giải chuyển vào dung dịch Trong cỏ lồi nhai lại có vi khuẩn đặc biệt chứa enzyme cellulase phân giải cellulose Cellulose hemicellulose hợp chất tiêu hóa Nhưng phần lớn cellulose tham gia cấu tạo vách tế bào rơm nên enzyme hệ vi sinh vật không dễ dàng tác động Lớp thành tế bào tạo thành chủ yếu từ phức chất lignohemicellulose mà enzyme vi sinh cỏ phân giải vơ chậm Điều cản trở lớp giàu cellulose trước tác động enzyme vi sinh vật, cản trở phân giải chất chứa tế bào Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa rơm rạ chất xơ khác, nhà nghiên cứu tiến hành xử lý rơm nhiều phương pháp như: lý học, hóa học, vi sinh vật học [1] 1.1.2 Cộng đồng vi sinh vật phân giải cellulose Rơm rạ có từ 400 - 430 g xơ kg chất khơ khó phân hủy Về nguyên tắc rơm rạ hệ vi sinh cỏ phân giải, nhiên bị lignin hóa cao nên khả tiêu hóa thực tế bị hạn chế Sự liên kết chặt chẽ lignin với cacbonhydrate tạo thành phức hợp lingo – hemicellulose/cellulose vách tế bào thực vật Liên kết có lợi cho thực vật lại bất lợi cho trình lên men vi sinh vật, làm cản trở tác động enzyme vi sinh vật Các biện pháp xử lý nhằm làm thay đổi số tính chất hóa lý rơm để làm tăng khả phân giải vi sinh vật với thành phần xơ Cellulose thành phần chủ yếu vách tế bào thực vật Hàng ngày, hàng giờ, lượng lớn cellulose tích lũy lại đất sản phẩm tổng hợp thực vật thải ra, cối chết đi, cành rụng xuống Một phần không nhỏ người thải dạng rác thải, giấy vụn, phôi bào, mùn cưa… Nếu khơng có Đồ án tốt nghiệp trình phân giải sinh vật lượng chất hữu khổng lồ tràn ngập trái đất Cellulose khó phân giải, vi sinh vật phân hủy cellulose phải có hệ enzyme gọi cellulase bao gồm enzyme khác Enzyme C1 có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến dạng cellulose tự nhiên có cấu hình khơng gian thành dạng cellulose vơ định hình, enzyme gọi cellobiohydrolase Enzyme thứ hai endoglucanase có khả cắt đứt liên kết β-1, bên phân tử tạo thành chuỗi dài Enzyme thứ exo – gluconase tiến hành phân giải chuỗi thành Disaccharide gọi Cellobiose Cả hai loại enzyme endo exo – gluconase gọi Cx Enzyme thứ β – glucosidase tiến hành thủy phân cellobiose thành glucose [2] Cellulose tự nhiên C1 cellulose vơ định hình CX Β - glucosidase cellobiose glucose Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả phân hủy cellulose nhờ có hệ cellulase ngoại bào Cellulase tổng hợp từ nhiều chủng vi sinh khác nhau: + Cellulase từ vi khuẩn: Bacillus megaterium, Pseudomonas fluorenscens, Acetobacter Xylium, vi khuẩn cỏ, Clostridium… + Cellulase từ xạ khuẩn: Các loài Actinomyces, Streptomyces… + Cellulase từ nấm: Aspergylus niger, Aspergylus Oryzae, Tricoderma, Mucor pusillus [22] Trong vi nấm nhóm có khả phân giải mạnh tiết mơi trường lượng lớn enzyme đầy đủ thành phần Các nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose đáng ý Tricoderma Hầu hết loài thuộc chi Tricoderma sống hoại sinh đất có khả phân hủy cellulose Chúng tiến hành phân hủy tàn dư thực vật để lại đất, góp phần chuyển hóa lượng chất hữu khổng lồ Tricoderma sống tre, nứa, gỗ tạo thành lớp mốc màu xanh phá hủy vật liệu Trong nhóm vi nấm, ngồi Đồ án tốt nghiệp Tricoderma có nhiều giống khác có khả phân giải cellulose Aspergillus, Fusarium, Mucor… Nhiều loài vi khuẩn có khả phân hủy cellulose Thường đất có lồi vi khuẩn có khả tiết đầy đủ loại enzyme, hệ enzyme cellulase Nhóm tiết loại enzyme hệ enzyme cellulase Nhóm tiết loại enzyme này, nhóm khác tiết loại khác, chúng phối hợp với để phân giải chất mối quan hệ hỗ sinh Nhóm vi khuẩn hiếu khí gồm Pseudomonas, Cellulomonase, Achromobacter Nhóm vi khuẩn kỵ khí bao gồm Clostridium đặc biệt nhóm vi khuẩn sống cỏ động vật nhai lại Chính nhờ nhóm vi khuẩn mà trâu bò sử dụng cellulose có cỏ, rơm rạ làm thức ăn Đó cầu khuẩn thuộc chi Rumonococcus có khả phân hủy cellulose thành đường acid hữu Ngoài vi nấm vi khuẩn, xạ khuẩn niêm vi khuẩn có khả phân hủy cellulose Người ta thường sử dụng xạ khuẩn, đặc biệt chi Streptomyces việc phân hủy rác thải sinh hoạt Những xạ khuẩn thường thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng, phát triển tốt nhiệt độ 45 – 50 0C thích hợp với trình ủ rác thải [2] Nhìn chung, hệ vi sinh vật rơm rạ đa dạng mặt phân loại chức Tổng cộng có 259 chủng vi khuẩn 45 loài nấm phân lập với đặc tính chức khác Sự đa dạng cộng đồng vi sinh vật rơm rạ đánh giá việc giải trình tự 16S rDNA cho kết luận có 17 họ vi khuẩn họ nấm có rơm Bacillaceace, Burkholderiaceae, Enterobacteraceae Pseudomonadaceae họ phổ biến Hoạt động phân giải cellulose phát Bacilliaceae, Enterobacteriaceae, Flexibateraceae, Microbacteriaceae Paenibacillaceae Hoạt tính phân giải chitin phổ biến loài Flexibacterceae, Burkholderiaceae, Enterobacteriaceae, Oxalobacteriaceae, Staphylococcaeae Xanthomonadaceae Các tác nhân gây bệnh lúa tiềm 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 ... vi sinh cho mục đích nghiên cứu khác Mục đích nghiên cứu - Ly trích thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước sau xử lý trồng nấm - Xác định nhóm vi khuẩn rơm trước sau xử lý trồng nấm phương. .. DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước sau xử lý trồng nấm rơm - Xác định nhóm vi khuẩn cần nghiên cứu dựa vào khuếch đại đoạn gene 16S rDNA phản ứng PCR - Xác định nhóm vi khuẩn mẫu phương pháp DGGE. .. Ứng dụng phương pháp PCR q trình xác định lồi vi khuẩn Phương pháp PCR phương pháp ứng dụng rộng rãi vi c xác định loài vi sinh vật Đối với loài vi khuẩn vậy, người ta sử dụng phương pháp PCR để