BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO HẠT, BẢO QUẢN VÀ NẢY MẦM CỦA HẠT NHÂN TẠO ĐỐI VỚI CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA (DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : NGUYỄN CỬU THÀNH NHÂN Sinh viên thực MSSV: 1151110528 : HUỲNH THỊ NGỌC TRÂM Lớp: 11DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn Th.s Nguyễn Cửu Thành Nhân Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Chân thành cảm ơn:  Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công Nghệ Tphcm  Quý thầy cô trường Đại Học Công Nghệ Tphcm  Quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trường Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Cửu Thành Nhân tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tâp thực luận văn Cảm ơn công lao cha mẹ tận tụy suốt đời để có ngày hơm Xin gửi lời cảm ơn đến: Tập thể cán nhân viên Trung Tâm Ươm Tạo Doanh Nghiệp Nông Nghiệp Cơng Nghệ Cao phòng Ni Cấy Tế Bào Thực Vật, tất bạn bè lớp 11DSH04 động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập thực đề tài Tp Hồ Chí Minh, Ngày tháng năm 2015 Sinh viên Huỳnh Thị Ngọc Trâm ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .vii CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Khái quát lan .4 1.1.1 Phân loại thực vật học 1.1.2 Lịch sử lan 1.1.3 Tình hình sản xuất lan 1.1.4 Đặc điểm thực vật học lan .6 1.1.4.1 Cơ quan dinh dưỡng .6 1.1.4.2 Cơ quan sinh dục lan- tổ chức hoa 1.1.5 Các điều kiện cho lan 1.2 Giới thiệu lan Thạch Hộc Tía: 10 1.2.1 Đặc trưng hình thái phân bố: 10 1.2.2 Công dụng: 10 1.2.3 Giá trị kinh tế: 12 1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 1.3.1 Khái niệm 13 1.3.2 Lịch sử phát triển .14 1.3.3 Ứng dụng: 15 1.3.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro 15 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng nhân giống in vitro 17 1.3.6 Các bước nhân giống in vitro: 18 1.4 Công nghệ tạo hạt nhân tạo: .19 1.4.1 Khái niệm hạt nhân tạo: 19 iii Đồ án tốt nghiệp 1.4.2 Ưu điểm hạt nhân tạo: 20 1.4.3 Quá trình tạo hạt nhân tạo: 20 1.4.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo: 22 1.4.5 Các nhân tố cần thiết việc tổng hợp hạt nhân tạo: 23 1.4.6 Nguyên tắc điều kiện tạo vỏ bọc chất alginate sodium: 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: 25 2.2 Thời gian thực hiện: 25 2.3 Nội dung nghiên cứu : 25 2.4 Vật liệu nghiên cứu .26 2.4.1 Trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu .26 2.4.2 Mẫu sử dụng điều kiện nuôi cấy 26 2.4.3 Môi trường sử dụng 26 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.5.1 Chuẩn bị môi trường 27 2.5.2 Bố trí thí nghiệm .28 2.6 Xử lý số liệu: 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32 3.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phơi lan Thạch Hộc Tía: 32 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .52 4.1 Kết luận 52 4.2 Đề nghị 52 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ sodium alginate đến hình thành hạt nhân tạo .28 Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm hạt dung dịch CaCl2.2H2O 28 Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng môi trường tạo hạt nhân 29 Bảng 2.4 Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo 30 Bảng 2.5 Khảo sát nẩy mầm hạt nhân tạo giá thể khác 31 Bảng 3.1 Nồng độ alginate ảnh hưởng đến hình thái vỏ hạt nhân tạo .35 Bảng 3.2 Tỷ lệ sống hạt nhân tạo nồng độ alginate 36 Bảng 3.3 Tỷ lệ nẩy mầm hạt nhân tạo nồng độ alginate khác 37 Bảng 3.4: Tỷ lệ sống hạt nhân tạo thời gian ngâm hạt khác nhau: 41 Bảng 3.5 Khảo sát khả bảo quản hạt môi trường MS: 43 Bảng 3.6 Tỷ lệ nẩy mầm hạt nhân tạo môi trường dinh dưỡng khác 44 Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng môi trường bảo quản hạt nhân tạo 46 Bảng3.8 Khảo sát ảnh hưởng môi trường bảo quản hạt nhân tạo .48 Bảng 3.9: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm giá thể 50 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.2 Cấu tạo hoa lan .9 Hình 1.3 Hình ảnh số lồi lan Thạch Hộc 13 Hình 2.1 Cấu tạo hạt nhân tạo 20 Hình 2.2 Các giai đoạn phát sinh phôi soma 21 Hình 2.3 Hình dạng phôi soma 21 Hình 2.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo 22 Hình 3.1 Vật liệu hạt nhân tạo 33 Hình 3.2 Môi trường tạo hạt nhân tạo .34 Hình 3.3 Các bước tạo hạt nhân tạo 34 Hình 3.4 Hạt nhân tạo 34 Hình 3.5 Quá trình nảy mầm hạt nhân tạo lan Thạch Hộc Tía .35 Hình 3.7 Biểu đồ tỷ lệ sống hạt nhân tạo nồng độ alginate khác 36 Hình 3.8 Biểu đồ tỷ lệ sống hạt nhân tạo nồng độ alginate khác 37 Hình 3.9 Hạt nhân tạo nảy mầm nồng độ alginate khác 39 Hình 3.10 Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm hạt thời gian ngâm CaCl2.2H2O khác 41 Hình 3.11 Hạt nhân tạo nảy mầm nồng độ alginate khác 42 Hình 3.13 Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo môi trường vỏ hạt khác Hình 3.14 Hạt nhân tạo nảy mầm môi trường vỏ hạt khác .45 Hình 3.15 Hình thái vỏ hạt nhân tạo sau tuần bảo quản .47 Hình 3.16 Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo môi trường bảo quản khác 48 Hình 3.17 Hạt nảy mầm giá thể khác 50 Hình 3.18 Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo môi trường bảo quản khác 51 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BAP Benzyl amino purine GA3 Giberrenlin IP Cytokinin CV Hệ số biến thiên MS Murashige Skoog PVP Polyvinyl pyrrolidone NSC Ngày sau cấy vii Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài: Cuộc sống ngày đại phát triển Con người buộc phải đối mặt với nhiều vấn đề áp lực từ sống Chính mà vui chơi, giải trí nhu cầu khơng thể thiếu Ngồi hoạt động vui chơi giải trí khác thú chơi hoa, cảnh có chỗ đứng định Khơng tạo mảng xanh, khơng gian tươi mát xanh giúp nâng cao chất lượng sống, giúp người ta gần gũi với thiên nhiên, sống lâu sống khỏe Hoa có mặt đời sống người phổ biến Từ làm vật liệu trang trí làm đẹp cho không gian sống, quà tặng đến công dụng làm thức ăn hay dược liệu Hoa biểu tượng cho đẹp Mỗi lồi hoa có màu sắc mùi hương đặc biệt cho vùng miền, thời tiết hay khí hậu Nhiều lễ hội hoa tổ chức quốc gia hàng năm Trong số đó, hoa lan biết đến yêu mến vẻ đẹp, sang trọng lợi ích kinh tế mà hoa lan mang lại Lan đa dạng chủng loại, màu sắc, mùi hương phân bố rộng khắp toàn giới Trồng kinh doanh lan từ mà phát triển rộng rãi Sản lượng hoa lan năm giới ước tính hàng tỷ đô la Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển mạnh, Thái Lan nước xuất lan nhiều giới (có đến 1.000 giống hoa lan), Malaysia phủ qui hoạch hẳn 300 đất Johor giao cho Hiệp hội hoa lan tổ chức thành khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”, ngành trồng hoa lan Đài Loan tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt doanh thu năm 9,3 tỷ đài tệ gắng việc tìm tòi cách để sản xuất lan nhanh hiệu Dồng thời đẩy mạnh việc lai chọn tạo giống giống lan mới, sức chống chịu cao với bệnh hại thời tiết ngày trởi nên khắc nghiệt Trong năm trở lại đây, Việt Nam nghiên cứu nhiều lan đặc biệt nhân nhanh lan phương pháp nuôi cấy mô Đồ án tốt nghiệp Cây lan biết lồi thực vật khó gieo hạt tự nhiên Muốn nhân giống lan người ta thường dùng phương pháp tách chiết nuôi cấy in vitro Với phát triển kỹ thuật hạt nhân tạo, ứng dụng lấy phơi soma cho bọc vỏ nhân tạo có chứa mơi trường dinh dưỡng, nhằm bảo quản phôi điều kiện cho hạt nhân tạo nảy mầm Với kỹ thuật khắc phục hạn chế khó nảy mầm hạt lan tự nhiên giúp nhân nhanh giống lan trồng, loại thực vật khó nảy mầm Đồng thời mở hướng cho việc sử dụng hạt vơ tính thay cho hạt hữu tính có khả nẩy mầm thấp khơng đồng loạt Xuất phát từ lý mà chọn đề tài: “Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến trình tạo hạt, bảo quản nảy mầm hạt nhân tạo lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” để thực luận văn tốt nghiệp Khi thực đề tài này, hy vọng mang đến hiểu biết q trình hình thành phơi vơ tính lan Thạch Hộc nói riêng hoa lan nói chung, đồng thời đem lại ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật Việt Nam Tình hình nghiên cứu: Khái niệm phôi sinh dưỡng biết tới vào năm 1958 cuối năm 1970 Murashige đua khái niệm hạt nhân tạo – phôi sinh dưỡng có vỏ bọc nhân tạo Trong năm khơng có kết đáng kể ngồi việc xem xét khả sống sót phơi thực carrot Kitto Janick (1982-1985) Năm 1975, Bingham cộng tiến hành thí nghiệm cỏ đinh lăng chứng minh phát triển phôi sinh dưỡng thành Năm 1981 Robert Laurence, năm 1991, K.Redenbaugh cộng tiến hành tạo phơi vơ tính thành cơng cần tây rau diếp Nghiên cứu hạt nhân tạo nước việc mẻ Trong thấy vài nghiên cứu hạt nhân tạo lan Vanda, lan Hồ Điệp hoa Ly, có giá trị kinh tế cao Mục đích nhằm Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt Bùi Bá Bổng (1995) Nhân giống nuôi cấy mô, Nhà Xuất Bản Sở Khoa Học Công Nghệ Và Môi Trường An Giang Dương Công Kiên (2002) Nuôi cấy mô thực vật (tập 1), Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh Lê Văn Hồng (2008) Cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật, ĐH Đà Nẵng Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2002) Công nghệ tế bào, Nhà Xuất Bản Nguyễn Hoàng Lộc – Lê Việt Dũng (2009) Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện tài nguyên môi trường công nghệ sinh học đại học Huế *Tài liệu nước ngoài: Hou B, Tian M, Luo J, Ji Y, Xue Q, Ding X (2012) Genetic diversity assessment and ex situ conservation strategy of the endangered Dendrobium officinale (Orchidaceae) using new trinucelotide microsatellite markers Plant Systematics and Evolution , 298, 1483-91 Bihua Chen, Stephen J Trueman, Jianmin Li, Qianzhen Li, Huihua Fan, Juan Zhang (2014) Micropropagation of the Endangered Medicinal Orchid, Dendrobium officinale Life Science Journa,11(9), 526-530 Fujimura T and Komamine A (1979) Synchronization of somatic embryogenesis in carrot cell suspension culture Plant physiol Xiang L, Sze CWS, Ng TB, Tong Y, Shaw PC, Tang CWS, Zhang YBK (2013) Polysaccharides of Dendrobium officinale inhibit TNF-α-induced apoptosis in A253 cell line Inflammation Research, 62, 313-24 10 Xia L, Liu X, Guo H, Zhang H, Zhu J, Ren F (2012) Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium officinale (Tiepishihu) in vitro Journal of Functional Foods, 4, 294-301 53 Đồ án tốt nghiệp 11 Redenbaugh K et al., 1986 Somatic seed: encapsulation of asexual plant embryo Biotechnology 12 Liu X-F, Zhu J, Ge S-Y, Xia L-J, Yang H-Y, Qian Y-T, Ren F-Z (2011) Orally administered Dendrobium officinale and its polysaccharides enhance immune functions in BALB/c mice Natural Product Communications, 6, 867-70 13 Li X, Ding X, Chu B, Zhou Q, Ding G, Gu S (2008) Genetic diversity analysis and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinable Kimura et Migo (Orchidaceae) based on AFLP Genatica, 133, 159-66 54 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót hạt nhân tạo sau tuần Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót hạt nhân tạo sau tuần Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót hạt nhân tạo sau tuần Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1: Tỷ lệ nẩy mầm sau tuần Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1: Tỷ lệ nẩy mầm sau tuần: Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 2: tỷ lệ nảy mầm hạt sau tuần: Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ sống sót hạt nhân tạo sau tuần: Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ sống sót hạt nhân tạo sau tuần: Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ sống sót hạt nhân tạo sau tuần: Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo sau tuần: 10 Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo sau tuần: 11 Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 4:Tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo sau tuần: 12 Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 5:Tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo sau tuần: 13 ... niệm hạt nhân tạo: 19 iii Đồ án tốt nghiệp 1.4.2 Ưu điểm hạt nhân tạo: 20 1.4.3 Quá trình tạo hạt nhân tạo: 20 1.4.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo: 22 1.4.5 Các nhân. .. trình tạo hạt nhân tạo 22 Hình 3.1 Vật liệu hạt nhân tạo 33 Hình 3.2 Môi trường tạo hạt nhân tạo .34 Hình 3.3 Các bước tạo hạt nhân tạo 34 Hình 3.4 Hạt nhân tạo. .. trình tạo hạt, bảo quản nảy mầm hạt nhân tạo lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) để thực luận văn tốt nghiệp Khi thực đề tài này, hy vọng mang đến hiểu biết q trình hình thành