Báo cáo thực tập công nghệ lên men MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Page Báo cáo thực tập công nghệ lên men DANH MỤC HÌNH Page Báo cáo thực tập công nghệ lên men KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH MÔI TRƯỜNG LÊN ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN TRONG Q TRÌNH NI CẤY MẺ TỔNG QUAN 1.1 Mục tiêu thí nghiệm Nắm vững kiến thức động học sinh trưởng Nhận xét ảnh hưởng pH lên động học sinh trưởng nấm men Hoàn thiện thao tác kĩ quan sát kính hiển vi 1.2 Tổng quan nấm men Từ xa xưa, chưa ý thức tồn vi sinh vật người biết đến nhiều ứng dụng chúng sản xuất đời sống Những tài liệu khảo cổ cho biết cách 6000 năm, người dân Ai Cập dọc sơng Nile có tập qn nấu rượu, hình vẽ kim tự tháp cho thấy nghề phổ biến nơi Bên cạnh nhiều nấm men có ích loại nấm men dùng để sản xuất rượu trắng, rượu vang, bia, làm bột nở bánh mì, tạo sinh khối giàu protein vitamin, sản xuất enzyme, sản xuất acid acitric từ tự nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2)… nhiều loại nấm men gây bệnh cho người [4] Page Báo cáo thực tập cơng nghệ lên men Trong đó, lồi Saccharomyces Cerevisiae sử dụng công cụ đắc lực để mang DNA tái tổ hợp phục vục cho sản xuất sản phẩm hệ kỹ thuật di truyền Để nấm men Saccharomyces Cerevisiae phát triển tốt, cho suất cao, người ta phải kiểm soát điều chỉnh yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đến sinh trưởng nấm men như: nhiệt độ, pH, nồng độ chất, tỷ lệ giống…Để hiểu rõ tầm quan trọng yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm men pH nên thực hành nhóm chúng em tìm hiểu đề tài : “Ảnh hưởng pH môi trường lên động học sinh trưởng nấm men trình ni cấy mẻ” Hình Một số lồi nấm men: A – Lactobacillus-johnsonii; B – Candida; C – Lactobacillus Acidophilus; D – Sacccharomyces cerevisiea 1.3 Tổng quan giống Saccharomyces Cerevisiae Saccharomyces cerevisiae loài nấm men biết đến nhiều có bánh mì nên thường gọi men bánh mì, loại vi sinh vật thuộc chi Page Báo cáo thực tập cơng nghệ lên men Saccharomyces lớp Ascomycetes ngành nấm Lồi xem lồi nấm hữu dụng đời sống người từ hàng ngàn năm trước đến Nó dùng rộng rãi q trình lên men làm bánh mì, rượu, bia.[3] S.cerevisiae có hình dáng tế bào hình cầu, hình ovan hay elip Thường có – bào tử nang, có bào tử.[3] Saccharomyces cerevisiae loài sinh vật nhân chuẩn khoa học dùng nhiều nhất, với E.coli hai loài sinh vật mơ hình phổ biến Hình Nấm men Saccharomyces Cerevisae 1.3.1 Đặc tính sinh học Các nghiên cứu di truyền học tiến hành Saccharomyces cerevisiae từ 70 năm Đối tượng kết hợp hai tính chất tuyệt vời: Page Báo cáo thực tập công nghệ lên men − Là đơn bào nên tiến hành thí nghiệm vi khuẩn, đồng thời có đặc tính chủ yếu điển hình Eukaryote có ty thể với gen DNA nhỏ, giống với vi khuẩn nên ni môi trường dịch thể hay đặc tạo khuẩn lạc mơi trường thạch − Thích nghi mơi trường chứa đường cao, có tính acid cao Có thề nuôi tế bào nấm men quy mô lớn nồi lên men dễ dàng thu nhận sinh khối tế bào 1.3.2 Hình thức sinh sản Sinh sản vơ tính theo kiểu nảy chồi: điều kiện thuận lợi nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh sôi nảy nở nhanh Khi chồi xuất hiện, enzyme thủy phân xuất làm phân giải phần polysaccharide thành tế bào làm cho chồi chui khỏi tế bào mẹ Vật chất tổng hợp huy động đến chồi làm chồi phình to lên, xuất vách ngăn chồi tế bào mẹ Chồi tách khỏi tế bào mẹ hình thành tế bào mới.[4] Hình Tế bào nấm men S cerevisiae giai đoạn sinh sản phương pháp tạo chồi 1.4 Sinh trưởng phát triển nấm men Sự sinh trưởng phát triển nấm men diễn biến qua giai đoạn Page Báo cáo thực tập công nghệ lên men Hình Đồ thị thể sinh trưởng phát triển nấm men qua giai đoạn 1.4.1 Giai đoạn tiềm phát (lag phase) Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trường đến lúc chúng bắt đầu sinh sản Ở giai đoạn này, chúng phải thích nghi với điều kiện mơi trường Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua biến đổi lớn hình thái sinh lý, kích thước tăng lên đáng kể chúng trở nên nhạy cảm với tác động bên Số lượng tế bào nấm men giai đoạn không tăng tăng không đáng kể 1.4.2 Giai đoạn tăng trưởng cấp luỹ thừa (log phase) Số lượng sinh khối tế bào giai đoạn tăng theo cấp số nhân Khả thích ứng với điều kiện khơng thuận lợi mơi trường ngồi tăng lên rõ rệt, đồng thời xuất chức lên men rượu Giai đoạn thuận tiện để xác định lượng sinh sản, thời gian nảy chồi, khơng nên đánh giá kích thước tế bào dấu hiệu khác khuẩn lạc Do thời kỳ đầu giai đoạn này, tốc độ sinh sản tế bào thường nhanh tốc độ tạo thành tế bào chất nên kích thước tế bào có phần nhỏ 1.4.3 Giai đoạn ổn định Page Báo cáo thực tập công nghệ lên men Số lượng tế bào giai đoạn khơng tăng nữa, cân số sinh chết Song kích thước tế bào tăng lên rõ rệt Quá trình lên men rượu bắt đầu 1.4.4 Giai đoạn suy vong Số lượng tế bào giảm xuống có tượng tiêu hủy Lượng protein acid nucleic giảm xuống, glycogen treganose hồn tồn tiêu biến Như thấy số lượng tế bào nấm men đạt cao giai đoạn logarit, song sinh khối tế bào lại đạt cao giai đoạn ổn định khối lượng tế bào giai đoạn lớn 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm men điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào 1.5.1 Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy thích hợp cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon, nguồn nitơ, phospho, số nguyên tố vi lượng K, Na, Mg, Ca vitamin Saccharomyces cerevisiae có khả phát triển môi trường mà nguồn carbon tinh bột, phát triển tốt môi trường đường với nguồn ngun liệu nấu chín Mơi trường nước chiết giá đậu sử dụng để nuối cấy nấm men đậu chứa hàm lượng protein cao, nguồn thức ăn tốt cho nấm men Ngồi ra, có vitamin A1, B1, B2, C, E, K chất kích thích tố tăng trưởng khác Tuy nhiên, vitamin C nước chiết giá đậu làm hạn chế phát triển nấm men Ngồi ra, nấm men ni cấy số môi trường như: môi trường cám, môi trường rỉ đường hay dung dịch đường acid hóa với pH=4, nước bã rượu, môi trường thủy phân từ cellulose thực vật, môi trường dịch kiềm sulfit (thành phần chủ yếu đường pentose) 1.5.2 Nhiệt độ Page Báo cáo thực tập công nghệ lên men Saccharomyces cerevisiae có nhiệt độ tối ưu 28-30 0C, 430 C 280 C sinh trưởng nấm men chậm ngừng hẳn Ở 300 C, nấm men hoang dại phát triển nhanh S.cerevisiae 2-3 lần, 35-380 C chúng phát triển nhanh 6-8 lần Ở nhiệt độ cao, hoạt tính nấm men giảm nhanh: nhiệt độ thấp khoảng 20230 C, hạn chế mức độ tạp nhiễm khả lên men cao, kéo dài 1.5.3 pH môi trường pH tối ưu cho nấm men khoảng 4.5 – 5.6 Ở pH=4, tốc độ tích lũy sinh khối giảm, pH=3 – 3.5 sinh sản nấm men ngừng lại Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động hệ thống enzyme, sinh tổng hợp protein bị ảnh hưởng pH nên chất lượng nấm men giảm pH môi trường nằm khoảng 4.5 – 5.6 1.5.4 Tốc độ sục khí khuấy trộn Trong q trình ni cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hòa oxy hòa tan Ngừng cung cấp oxy 15 giây gây tác động âm hoạt động sống tế bào nấm men Oxy khơng khí di chuyển vào tế bào nấm men qua giai đoạn: oxy hòa tan vào mơi trường ni cấy sau nấm men hấp thụ oxy vào tế bào Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để oxy hóa kg đường, thực tế cần phần nhỏ oxy bơm vào nấm men sử dụng, phần lại bị trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt môi trường VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Chủng vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae Hóa chất sử dụng môi trường nuôi cấy: Đường Page Báo cáo thực tập công nghệ lên men K2HPO4 MgSO4.7H2O Peptone Nước cất 2.2 Phương pháp 2.2.1 Chuẩn bị môi trường Chuẩn bị môi trường nuôi cấy sau: Môi trường M2e M2d M2f M2g Saccharose (g/l) 50 50 50 50 Peptone (g/l) 1 1 K2HPO4 (g/l) 3 3 MgSO4.7H2O (g/l) 2 2 pH 4.0 5.0 6.0 7.0 Môi trường M2 điều chỉnh pH dung dịch H 2SO4 0.1N Được phân phối vào bình ni cấy tiệt trùng 121 0C 30 phút Các môi trường kiểm tra nồng độ đường tổng trước sử dụng 2.2.2 Chuẩn bị giống vi sinh vật Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) dạng đông khô sử dụng làm chủng giống vi sinh vật Nấm men hoạt hóa nhân giống trog mơi trường M1b 30 0C 24 máy lắc xoay vòng với tốc độ 120rpm Nấm men kiểm tra tiêu (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống, (c) tỉ lệ tế bào nảy chồi (d) đường tổng Môi trường chuẩn bị giống: Môi trường Saccharose (g/l) Peptone (g/l) M1b 50 Dịch chiết giá* (ml) Đủ 1000 pH 7.0 *Dịch chiết giá: 100g giá đậu xanh (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước cất Đun sôi 30 phút Thu phần dịch Bổ sung nước cho đủ 1000ml 2.2.3 Khảo sát động học sinh trưởng nấm men nuôi cấy mẻ Sau trình nhân giống, nấm men (10ml) bổ sung vào 190 ml môi trường M2b tiệt trùng bình ni cấy Q trình ni cấy mẻ tiến hành nhiệt độ Page 10 Báo cáo thực tập cơng nghệ lên men phòng (30oC), lắc 120rpm (hoặc ni cấy tĩnh) Trong suốt q trình ni cấy, thứ 0, tiêu (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống (c) tỉ lệ tế bào nảy chồi (d) nồng độ đường khử đường tổng số kiểm tra Các thông số động học sinh trưởng nấm men tính tốn để rút kết luận 2.2.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm men, tỉ lệ tế bào nấm men sống, tỉ lệ tế bào nảy chồi Có thể sử dụng buồng đếm để định lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn nấm men, bào tử nấm mốc với độ phóng đại x100 đến x400 Với tế bào vi khuẩn, kích thước nhỏ, nên phải sử dụng buồng đếm Petroff-Hasser Phương pháp đếm trực tiếp giúp quan sát hình thái tế bào Kết đếm tổng số tế bào có mẫu, khơng phân biệt tế bào sống hay chết (chỉ phân biệt tế bào nấm men sống/chết tiến hành nhuộm với dung dịch methylen blue) 2.2.4.1 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu Buồng đếm hồng cầu phiến kính dày hình chữ nhật, phẩn lõm phẳng, có kẻ lưới gồm 400 vng nhỏ có diện tích tổng cộng 1mm 2, bao gồm 25 ô vuông lớn, vng gồm có 16 vng nhỏ Vì thế, diện tích hình vng nhỏ 1/400mm2 diện tích hình vng lớn 1/25mm2 Page 11 Báo cáo thực tập công nghệ lên men Hình Cấu tạo buồng đếm hồng cầu 2.2.4.2 − − Cách tiến hành Pha loãng huyền phù nấm men (sao cho vương lớn có từ 10-50 tế bào) Trộn 1ml huyền phù (đã pha loãng) với giọt (~50µl) dung dịch 0.2% methylen blue (pha D.W) 30 giây − Đậy buồng đếm lamelle − Nhẹ nhàng dùng đầu pipette đặt giọt huyền phù nấm men cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với lamelle) Dịch huyền phù vào buồng đếm nhờ chế mao dẫn Buồng đếm chuẩn bị có vùng khơng gian nằm buồng đếm lamelle trám đầy huyền phù nấm men, rãnh xung quanh khơng bị dính ướt − Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x4 để tìm buồng đếm vật kính x10 x40 để quan sát Điều chỉnh cường độ ánh sáng cửa trập để quan sát rõ ràng tế bào lẫn đường kẻ Thông thường ta chọn ô trung tâm bốn nằm bốn góc năm theo đường chéo (các đánh dấu x) Có thể sử dụng máy ảnh kỹ thuật số để chụp hình buồng đếm vật kình x10 để sau sử dụng đếm số lượng tế bào nấm men Page 12 Báo cáo thực tập công nghệ lên men − Kết đếm mật độ tế bào có giá trị vòng 3-5 phút sau cho mẫu vào buồng đếm, phải đếm tế bào nằm hai đường kẻ kể chọn ô − Ở độ pha loãng, sau đếm ta số tế bào năm ô lớn a  Số tế bào nấm men (N) 1.0 ml mẫu: Trong đó: N: số tế bào 1.0 ml mẫu cho vào buồng đếm a: số tế bào ô vuông lớn b: số ô vuông nhỏ ô vuông lớn (16x5=80) 400: tổng số ô vuông nhỏ 25 vng lớn 0.1: thể tích (mm2) mẫu chứa ô trung tâm 103: số chuyển mm2 thành ml (103 mm2 = 1ml) 10n: độ pha loãng mẫu 2.2.5 Tính tốn thơng số động học sinh trưởng nấm men n = t/td Nt = No/2n = No.2t/td (lnNt – lnNo)/t = 0.693/td µ = 0.693/td (tính dựa vào số lượng tế bào) YN/S = (Nt – No)/(St – So) Với: n: số hệ td: thời gian số tế bào nhân đôi (thời gian hệ) Nt: số tế bào thời điểm t No: số tế bào thời điểm ban đầu Nt: số tế bào thời điểm t µ: hẳng số tốc độ sinh trưởng (ở xem tốc độ gia tăng số lượng tế bào đơn vị số lượng tế bào) Page 13 Báo cáo thực tập công nghệ lên men St: nồng độ chất (carbohydrate) thời điểm t So: nồng độ chất (carbohydrate) thời điểm Các số liệu đo đạc thông số động học sinh trưởng biểu diễn bảng đồ thị bao gồm: (1) bảng số liệu trình lên men, (2) đồ thị diễn tả đườn cong sinh trưởng nấm men, (3) xác định thời gian hệ log phase, (4) số tốc độ sinh trưởng log phase (5) YN/S cuối log phase Các kết mơ tả, so sánh, giải thích biện luận để làm sáng tỏ ảnh hưởng điều kiện thí nghiệm đến kết đo đạc tính tốn thu nhận KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Tổng số tế bào nấm men Hình 6: Đồ thị thể tổng số tế bào nấm men theo thời gian Từ biểu đồ cho thấy tổng số tế bào lớn pH = thấp pH=7 Khi bắt đầu nuôi cấy nấm men môi trường (tại t = (h)), tổng số tế bào khoảng xấp xỉ 1500 – 1700 tế bào Mức ổn định khoảng 1h sau tế bào bắt đầu sinh trưởng mạnh pH= 5, pH= tổng số tế bào tương đương với pH= - pH = 5, tổng số tế bào cực đại khoảng 5610 tế bào thứ 4,6,7 pH = 6, tổng số tế bào cực đại khoảng 3800 tế bào thứ 3,6 pH = 4, tổng số tế bào cực đại khoảng 3700 tế bào thứ pH = 7, tổng số tế bào cực đại khoảng 3000 tế bào thứ 3,7 Theo nghiên cứu Audrey Serra công kết luận pH khơng có ảnh hưởng đáng kể đến tăng trưởng S.cerevisiae tất thí nghiệm ông pH giữ 5.[1] Page 14 Báo cáo thực tập công nghệ lên men 3.2 Tỷ lệ tế bào nảy chồi chết  Môi trường pH=4 Hình Đồ thị thể tỉ lệ tế bào nảy chồi chết theo thời gian pH=4 Trong đầu tiên, % tế bào nảy chồi có tăng không nhiều (từ 1.3% tăng lên 2.4%) % tế bào chết giai đoạn tăng cao (từ 12.5% tăng lên 30.7%) Giai đoạn pha lag, nấm men chuyển vào mơi trường mới, chưa thích nghi kịp nên nhiều tế bào nấm men bị chết, số tế bào bắt đầu thích nghi nảy chồi Trong tiếp theo, giai đoạn pha log Tế bào dần thích nghi với mơi trường tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng lên, tỷ lệ tế bào chết giảm xuống, thứ 2, tỷ lệ tế bào chết có tăng khơng nhiều (tăng 6.3%) nguyên nhân số tế bào khơng thích nghi sai số q trình lấy mẫu trình đếm Trong kế tiếp, tế bào pha log, tỷ lệ tế bào chết giảm mạnh (giảm 14.5%) tế bào nấm men sinh trưởng, tốc độ tăng trưởng cao nên tế bào chết giảm mạnh, tỷ lệ tế bào nảy chồi khơng có thay đổi lớn tế bào nảy chồi tăng trưởng nhanh tách thành tế bào độc lập Trong kế tiếp, tỷ lệ tế bào nảy chồi tế bào chết có giảm ít, giai đoạn ổn định  Môi trường pH=5 Hình Đồ thị thể tỉ lệ tế bào nảy chồi chết theo thời gian pH=5 Trong đầu tiên, tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng (từ 2.97% tăng lên 21.43%) tỷ lệ tế bào chết giảm mạnh (từ 40.26% giảm 9.14%), ngun nhân mơi trường tối thích cho nấm men phát triển, giống nấm men có khả sinh trưởng tốt, mơi trường ni cấy có chất phù hợp dễ hấp thu tế bào nấm men Page 15 Báo cáo thực tập công nghệ lên men Trong tiếp theo, tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng nhanh (từ 21.43% tăng lên 52.7%), tỷ lệ tế bào chết dường khơng có thay đổi nhiều, tế bào giai đoạn tăng trưởng %) Do nấm men sử dụng chất có hiệu quả, thích nghi tốt với điều kiện môi trường nên phát triển mạnh mẽ Trong tiếp theo, tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm mạnh (từ 52.7% giảm 15.26%), tỷ lệ tế bào chết không thay đổi đáng kể, tế bào giai đoạn tăng trưởng, tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm tế bào tăng trưởng nhanh, sau phát triển tách thành tế bào độc lập Trong kế tiếp, tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm nhẹ, tỷ lệ tế bào chết không thay đổi nhiều, tỷ lệ nảy chồi chết gần giống tế bào pha ổn định Trong cuối cùng, tỷ lệ tế bào nảy chồi không đổi, tỷ lệ tế bào chết tăng (tăng 21.95%), bước vào giai đoạn suy vong, chất cạn kiệt tích lũy sản phẩm trao đổi chất ức chế sinh trưởng nấm men  Môi trường pH=6 Hình Đồ thị thể tỉ lệ tế bào nảy chồi chết theo thời gian pH=6 Trong giai đoạn pha lag, tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm nhẹ (từ 12.97% tăng lên 11.25%) tỷ lệ tế bào chết giảm mạnh (từ 43.53% giảm 30.00%).Ngun nhân nấm men vừa cấy vào môi trường với pH=6, tế bào nấm men cần thời gian để thích nghi nên số tế bào nảy chồi giảm Tuy nhiên môi trường có nồng độ chất nhiều nên tế bào sử dụng nguồn chất để phát triển nên số tế bào chết giảm Ở tiếp theo, sau nấm men thích nghi với mơi trường ni tế bào nấm men sử dụng nguồn chất để sinh trưởng phát triển Dẫn đến tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng mạnh (từ 11.25% lên 24.47%) Ở thứ 5, song song tỷ lệ tế bào nảy chồi cực đại tỷ lệ tế bào chết nhỏ (2.66%) Tỷ lệ tế bào chết giảm mạnh từ 30% xuống 2.66%) Page 16 Báo cáo thực tập công nghệ lên men Ở cuối cùng, sinh trưởng phát triển tế bào giảm rõ rệt thể qua tỷ lệ tế bào chết tăng mạnh (từ 2.66% lên 21.48%) tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm (từ 24.47% xuống 14.77%)  Môi trường pH=7 Hình 10 Đồ thị thể tỉ lệ tế bào nảy chồi chết theo thời gian pH=7 Trong đầu tiên, % tế bào nảy chồi có tăng khơng nhiều (từ 3.47% tăng lên 5.48%) % tế bào chết giai đoạn tăng cao (từ 15.03% tăng lên 18.63%) Giai đoạn pha lag, nấm men chuyển vào mơi trường mới, chưa thích nghi kịp nên nhiều tế bào nấm men bị chết, số tế bào bắt đầu thích nghi nảy chồi Trong tiếp theo, tế bào nấm men thích nghi với môi trường nên tỷ lệ tế bào tăng mạnh ( từ 5.48% lên 16.14%), với tỷ lệ chết giảm (từ 18.63% xuống 9.12%) Ở tiếp theo, sinh trưởng tế bào chậm lại thể qua tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm (từ 16.14% xuống 11.51%) tỷ lệ tế bào chết tăng nhẹ (từ 9.12% lên 10.83%) Trong cuối tỷ lệ tế bào chết tăng lên đáng kể (từ 10.83% đến 20.36%), với tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm mạnh (từ 11.51% xuống 7.6%) Điều chứng tỏ, giai đoạn sinh trưởng phát triển tế bào dừng lại bắt đầu vào giai đoạn suy vong  So sánh tỷ lệ tế bào chết nảy chồi theo thời gian khoảng pH (4,5,6,7) Bảng So sánh tỷ lệ tế bào nảy chồi khoảng pH (4,5,6,7) pH Tỷ lệ tế bào nảy chồi cao 20.00% 52.70% 24.47% 16.14% Page 17 Thời điểm tỷ lệ tế bào nảy chồi cao Giờ thứ Giờ thứ Giờ thứ Giờ thứ Báo cáo thực tập công nghệ lên men Qua bảng này, ta thấy khoảng pH=5 nấm men sử dụng nguổn chất hiệu để làm tăng tỷ lệ tế bào nảy chồi (cao với 52.70%) thứ thời gian ni cấy Còn khoảng pH=7 tỷ lệ tế bào nảy chồi thấp với 16.14% thứ 3.3 Quá trình sinh trưởng tế bào nồng độ đường theo thời gian  Môi trường pH=4 Hình 11 Đồ thị tốc độ sinh trưởng tb nồng độ đường theo thời gian pH=4 Hình 12 Đồ thị sinh trưởng tb pha log pH=4 Pha lag 0-1 (h): pha lag ngắn, dấu hiệu số tế bào chết tăng đáng kể số tể bào nảy chồi giảm nhẹ Pha log 1-4 (h): nấm men thích nghi tốt với mơi trường tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng vượt trội tỷ lệ tế bào chết giảm dần Log N tăng từ 8.44716 đến 8.87157 Số lượng tế bào tăng nồng độ chất giảm mạnh Tại thời điểm 4h số lượng tế bào bắt đầu tăng từ từ, chuẩn bị bước sang giai đoạn ổn định Pha ổn định 4-6 (h): Số lượng tế bào đạt giá trị cực đại thời điểm 4h (10 8.87157) có xu hướng khơng đổi qua tiếp theo, hàm lượng đường bị tiêu thụ giảm đặn liên tục (độ Brix tương ứng 4.5 h 4.1, 3.9) Hằng số tốc độ sinh trưởng µ max = 0.262 (mai tính)  Mơi trường pH=5 Hình 13 Đồ thị tốc độ sinh trưởng tb nồng độ đường theo thời gian pH=5 Page 18 Báo cáo thực tập công nghệ lên men Hình 14 Đồ thị thể sinh trưởng tb biểu diễn pha log pH=5 Pha lag: 0-1(h), số tế bào nảy chồi tăng nhẹ đồng thời số tế bào chết tăng mạnh Chứng tỏ nấm men cần thời gian thích ứng với môi trường Pha log 1-4 (h): Nấm men tăng trưởng nhanh từ đến (log N tăng từ 8.57518 đến 9.20952) Số lượng tế bào đạt cực đại 109.20952 thứ Pha ổn định 5-9 (h): Số lượng tế bào qua chênh lệch không đáng kể (Log N 5h 9.0086, 6h 9.04297, 7h 9.04999) Hằng số tốc độ sinh trưởng µ max =0.323  Mơi trường pH=6 Hình 15 Đồ thị tốc độ sinh trưởng tb nồng độ đường theo thời gian pH=6 Hình 16 Đồ thị thể sinh trưởng tb pha log pH=6 Pha lag 0-1 (h): pha lag ngắn, số tế bào chết tăng vượt trội số tế bào nảy chồi tăng nhẹ Pha log 1-3 (h): nấm men thích nghi tốt với môi trường tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng mạnh tỷ lệ tế bào chết giảm dần Số lượng tế bào tăng (log N tăng từ 8.54654 đến 8.88081) nồng độ chất giảm Số lượng tế bào đạt cực đại 10 8.88081 thứ Số lượng tế bào giảm nhẹ từ thời điểm 3h trở chuẩn bị bước sang giai đoạn ổn định Pha ổn định 3-6(h): tổng số tế bào qua chênh lệch không đáng kể Tại thời điểm 6h tổng số tế bào đạt cực đại 108.88309 Pha suy vong 6-7 (h) số lượng tế bào giảm cách rõ rệt, logN giảm từ 8.88309 xuống 8.77525 cạn kiệt chất, số chất dinh dưỡng cần thiết hay tích lũy sản phẩm trao đổi chất bậc khơng có ích cho sinh trưởng phát triển Hằng số tốc độ sinh trưởng µ max = 0.412  Môi trường pH=7 Page 19 Báo cáo thực tập công nghệ lên men Hình 17 Đồ thị tốc độ sinh trưởng tb nồng độ đường theo thời gian pH=7 Hình 18 Đồ thị thể sinh trưởng tb pha log pH=7 Phase lag: khơng có Do mơi trường gần giống với môi trường ban đầu (pH=7) nên nấm men khơng cần khoảng thời gian dài để thích nghi mà bắt đầu sinh trưởng phát triển Pha log 0-3 (h): pha nấm men phát triển với tốc độ sinh trưởng đặc trưng tối đa chúng, số lượng tế bào nảy chồi tăng mạnh tỷ lệ tế bào chết giảm Tổng số tế bào tăng nhiên nồng độ chất lại giảm dần Tại thời điểm (h) lượng tế bào đạt cực đại 108.77525, tổng số tế bào bắt đầu giảm nhẹ chuẩn bị bước sang pha ổn định Pha ổn định 3-7(h): Số lượng tế bào qua chênh lệch không đáng kể (Log N 4h 8.75739, 5h 8.76042, 7h 8.77232 ) Pha suy vong 7-8 (h) số lượng tế bào giảm cách rõ rệt (logN giảm từ 8.77232 xuống 8.74194) vi sinh vật khơng có chất để sinh trưởng phát triển Hằng số tốc độ sinh trưởng µ max = 0.244  So sánh Bảng Các thông số so sánh Các thông số so sánh Pha lag pH=4 pH=5 pH=6 pH=7 0-1 (h) 0-1 (h) 0-1 (h) Khơng có Pha log 1-4 (h) 1-4 (h) 1-3 (h) 0-3(h) Pha ổn định 4-6 (h) 5-9 (h) 3-6 (h) 3-7 (h) µ max 0.262 0.323 0.412 0.244 2.645 (h) 2.146 (h) 1.682 (h) 2.840 (h) Tại 4h:109.20952 Tại 6h: 108.88309 Tại 3h : 108.77525 Td Nồng độ sinh khối lớn Tại 4h: 108.87157 Page 20 Báo cáo thực tập công nghệ lên men Qua bảng so sánh thông số ta nhận thấy pH=5 không xuất pha lag, pha log dài pH khác kéo dài 4h môi trường khác kéo dài 3h Pha ổn định pH=5 kéo dài 2h (từ đến h) tương tự pH=4 môi trường pH=6 pH=7 nồng độ sinh khối lớn thu lại cao so với mơi trường lại Điều cho thấy nấm men có hiệu suất chuyển đổi chất cao khoảng thời gian ngắn, mơi trường pH=7 có khả ứng dụng cao vào thực tiễn sản xuất công nghiệp Ở mơi trường pH=4, µ max tương đối thấp, cho thấy phát triển sinh sơi max cao pH=4, nấm men sinh trưởng phát triển ảnh hưởng pH Ở môi trường pH=5, µ với tốc độ cao mơi trường phù hợp có pH tối ưu Ở mơi trường pH=6, µ max cao mơi trường lại Nhưng nồng độ sinh khối lớn thu 108.8943 < 109.043 (pH=5) cho thấy nấm men phát triển nhanh hiệu suất chuyển đổi chất thấp pH=5 nguyên nhân pH=5 tạo môi trường tốt cho nấm men Ở mơi trường pH=7, µ max nhỏ mơi trường lại nồng độ sinh khối lớn thu pha ổn định nhỏ môi trường pH=5 Nấm men sinh trưởng phát triển pha lag hiệu suất chuyển đổi sinh khối thu tương đối cao điều sinh sản phẩm trao đổi chất kết hợp với pH môi trường phù hợp cho nấm men Theo Nguyễn Lân Dũng, thời gian hệ nấm men rượu (Saccharomyces cerevisiae) 120 phút so với kết Td thu 2.645h (pH=4), 2.146h (pH=5), 1.682 (pH=6), 2.840 (pH=7) có chênh lệch đáng kể thao tác thực thí nghiệm, ảnh hưởng mơi trường ni cấy, điều kiện thí nghiệm, KẾT LUẬN  Kết luận pH yếu tố quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển nấm men Page 21 Báo cáo thực tập công nghệ lên men Trong môi trường pH = 7, nấm men nhanh đạt trạng thái ổn định (chỉ sau 3h) trì phase ổn định khoảng thời gian dài, thích hợp cho việc sản xuất sản phẩm trao đổi chất bậc Trong môi trường pH=5 (pH nằm khoảng tối thích nấm men) nấm men phát triển nhanh ổn định, hiệu suất chuyển đổi sinh khối lớn so với nghiên cứu Seda Karasu Yalcin, 2006 kết luận pH = cho nồng độ chất khô tốc độ sinh trưởng tối ưu [5] Mơi trường pH=5 thích hợp cho trình lên men thực tế, yêu cầu thu nhận nhiều sản phẩm trao đổi chất bậc (sản phẩm hình thành pha ổn định) Ở mơi trường pH thấp, hạn chế số vi sinh vật tránh nhiễm vào bình giống cạnh tranh chất với nấm men Trong môi trường pH=4, nấm men phát triển chậm nồng độ sinh khối thu nhỏ so với mơi trường pH khác Điều cho thấy tính ứng dụng nồng độ pH  Mở rộng Mức độ hấp thu chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động hệ thống enzyme tham gia vào tổng hợp protein, tạo vitamin tùy thuộc vào độ pH, pH tốt cho sinh trưởng men bánh mì 4.5 – 5.5, ngồi khoảng pH làm chất lượng giảm đi, pH=4: tốc độ tích lũy sinh khối giảm, pH = hay pH = 3.5: làm cho sinh trưởng nấm men bị dừng lại [8] Kết thấy phát triển nấm men bị ảnh hưởng giá trị Ph thấp cao Tại giá trị pH cao làm giảm hàm lượng sinh khối khơ Nó báo cáo rằng, phần lớn nấm men phát triển pH 4.5-6.5, gần tất lồi phát triển mơi trường acid kiềm pH thấp cao biết gây áp lực hóa học lên tế bào nấm men.[7] Kowda M Wasungu, Ronald E Simard nghiên cứu “ đặc tính phát triển nấm men bánh mì ethanol”, ảnh hưởng nhiệt độ (15° - 40°C) độ pH (2,56,0) tăng trưởng liên tục nấm men bánh '(Saccharomyces cerevisiae) trạng Page 22 Báo cáo thực tập công nghệ lên men thái ổn định 1% ethanol điều tra nhiệt độ pH tối ưu 30°C 4,5 tương ứng.[2] pH nằm khoảng đến tối thích cho q trình sản xuất ethanol, pH có ảnh hưởng đến đường tạo sản phẩm trao đổi chất pH nằm khoảng 5,5 đến 300C với hàm lượng glucose 40kgm-3 : sản phẩm ethanol butyrate, pH