BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62640102 HÀ HUỲNH HỒNG VŨ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÕ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ Cần Thơ, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN HỮU HƢNG Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam II DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2014 Thành phần loài ốc nước - ký chủ chủ trung gian lồi sán ký sinh vật ni hai tỉnh Vinh Long Đồng Tháp Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề Nông nghiệp /2014, trang 812 Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2015 Đặc điểm hình thái phân tử sán gan lớn ký sinh bò tỉnh Đồng Tháp Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 6/2015, trang 63-69 Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Phạm Đức Phúc, Nguyễn Hữu Hưng, 2016 Ứng dụng thị gen phân tử ITS-1 kỹ thuật PCRRFLP để xác định loài sán gan lớn (Fasciola sp.) bò Đồng sơng Cửu Long Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 2/2016, trang 85-92 Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2016 Tình trạng nhiễm sán gan lớn bò số tỉnh Đồng sông Cửu Long thử hiệu tẩy trừ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ /2016, trang 17-22 Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2018 Khảo sát số đặc điểm bệnh lí bệnh sán gan lớn bò số tỉnh Đồng sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề Nông nghiệp /2018, trang 12-17 III Chƣơng GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Theo Tổ chức y tế Thế giới (WHO) bệnh sán gan lớn (SLGL) bệnh quan trọng phát ngày nhiều người động vật, có 2,4 triệu người 70 quốc gia bị ảnh hưởng bệnh SLGL (WHO, 2015; Amer, 1016) Tại Việt Nam, bệnh SLGL người có xu hướng tăng dần, từ năm 2006 đến năm 2010 có số ca mắc bệnh 15.764 số ca tăng lên 20.000 người năm 2011 Bệnh phân bố 52 tỉnh thành từ Bắc đến Nam loài gây bệnh xác định chủ yếu Fasciola gigantica (Nguyễn Văn Đề ctv.2012) Trong năm qua nghiên cứu bệnh SLGL cho biết bệnh nằm danh sách bệnh truyền lây vật nuôi người Các bệnh sán gan gây cần phải thông qua vật chủ trung gian loài ốc nước ngọt.Với đặc điểm vùng Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) trồng lúa rau màu nên thích hợp cho ốc nước thực vật thủy sinh phát triển ĐBSCL khu vực ưu phát triển chăn ni bò nhờ tận dụng thức ăn thô xanh từ nguồn phụ phẩm – phế phẩm nông nghiệp công nghiệp chế biến Tuy nhiên, phần lớn chăn nuôi tập trung nông hộ với quy mô nhỏ, thức ăn tận dụng chính, trình độ người chăn ni thấp, việc ứng dụng khoa học kỹ thuật chăn nuôi hạn chế, hình thức chăn ni chủ yếu bán chăn thả nên khả bò nhiễm giun sán cao Để hạn chế thiệt hại sán gan gây việc nghiên cứu bệnh sán gan kiểm soát bệnh cần thiết Tuy nhiên, chưa có cơng trình nghiên cứu có tính tổng hợp để xác định thành phần loài, đặc điểm sinh học phân bố sán gan khu vực ĐBSCL Do nghiên cứu đề tài: “MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BỊ Ở ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ” cần thiết 1.2 Mục tiêu đề tài - Xác định loài, phân bố, đặc điểm sinh học yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm SLGL bò tỉnh ĐBSCL - Đề xuất biện pháp tẩy trừ bệnh SLGL bò tỉnh ĐBSCL 1.3 Ý nghĩa khoa học - Là công trình nghiên cứu có hệ thống sán gan lớn Fasciola gigantica bò: xác định tình hình nhiễm bệnh yếu tố liên quan đến phân bố mầm bệnh Định lồi hình thái học sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP giải trình tự gen ITS1 - Là cơng trình ĐBSCL nghiên cứu vòng đời SLGL bò, xác định thành phần ký chủ trung gian, nghiên cứu bệnh lý lâm sàng bò, điều trị thử nghiệm đề biện pháp tẩy trừ - Cung cấp thêm tư liệu khoa học loài Fasciola sp ký sinh bò (ĐBSCL), đồng thời bổ sung cho giáo trình ký sinh trùng thú y để phục vụ công tác giảng dạy 1.4 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài sở khoa học để khuyến cáo người dân vùng (ĐBSCL) áp dụng biện pháp phòng trị bệnh SLGL cách hữu hiệu, nhằm giảm thiểu tác động có hại, góp phần phát triển chăn ni bò theo hướng bền vững 1.5 Những đóng góp luận án - Đây cơng trình nghiên cứu xác định lồi Fasciola gigantica lưu hành bò ni ĐBSCL kỹ thuật sinh học phân tử - Đây công trình nghiên cứu thành cơng vòng đời SLGL (Fasciola gigantica) bò ĐBSCL - Mơ tả triệu chứng lâm sang, bệnh tích đại thể vi thể bệnh sán gan lớn loài Fasciola gigantica gây ra, tạo sở khoa học cho công tác chẩn đoán phát bệnh nhanh để kịp thời điều trị Chƣơng III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 3.1.1 Xác định tỷ lệ nhiễm sán gan lớn bò tỉnh ĐBSCL - Xác định tỷ lệ nhiễm SLGL ký sinh bò tỉnh ĐBSCL qua phương pháp kiểm tra phân phương pháp mổ khám 3.1.2 Xác định lồi sán gan lớn bò tỉnh ĐBSCL - Xác định loài sán gan lớn qua định danh phân loại hình thái học, kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 3.1.3 Nghiên cứu vòng đời sán gan lớn - Theo dõi trình phát triển trứng SLGL bên thể ký chủ - Theo dõi trình phát triển SLGL ký chủ trung gian (ốc Lymnaea swinhoei Lymnaea viridis) đến giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm cercaria) - Xác định vòng đời SLGL vật chủ cuối qua gây nhiễm ấu trùng gây bệnh cho bò 3.1.4 Nghiên cứu bệnh lý lâm sàng bò nhiễm sán gan lớn - Xác định triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể bò nhiễm SLGL khảo sát biến đổi vi thể gan bò nhiễm SLGL 3.1.5 Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh sán gan lớn bò - Thử hiệu lực thuốc tẩy trừ SLGL albendazole, triclabendazole mebendazole; đề xuất biện pháp phòng bệnh sán gan cho trâu bò 3.2 Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: Bò ni tỉnh: Đồng Tháp, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre Sóc Trăng; sán gan Fasciola sp.; ốc Lymnaea spp 3.2.2 Thời gian tiến hành: Tiến hành từ tháng 11/2013 đến 06/2017 3.2.3 Địa điểm tiến hành - Các hộ chăn ni bò tỉnh ĐBSCL, lò giết mổ tập trung tỉnh khảo sát, phòng thí nghiệm Ký sinh trùng phòng thí nghiệm Mơ học thuộc Bộ môn Thú Y - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng - Trường Đại học Cần Thơ, Bộ môn Thú y Lâm sàng – Khoa Chăn nuôi Thú y – Trường Đại học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh, phòng thí nghiệm Giải phẩu bệnh học – Trường Đại học Y dược Cần Thơ 3.3 Dụng cụ hố chất: Một số dụng cụ, hóa chất cần thiết để nghiên cứu ký sinh trùng sinh học phân tử 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Xác định tình hình nhiễm SLGL bò ĐBSCL - Đối tƣợng thí nghiệm: Bò địa phương, bò lai Sind, bò sữa Mỗi giống bò theo dõi lứa tuổi: < năm tuổi, - năm tuổi > năm tuổi.Bò giết mổ gia súc tập trung có nguồn gốc tỉnh khảo sát - Phƣơng pháp kiểm tra phân: áp dụng phương pháp gạn rửa sa lắng Benedek (1943) - Phƣơng pháp mổ khám: Phương pháp mổ khám Skrjabine (1937) - Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ nhiễm trứng sán gan chung bò; tỷ lệ nhiễm sán gan theo giống, theo lứa tuổi bò, theo phương thức ni, theo mùa, theo vùng sinh thái theo địa bàn; cường độ nhiễm số lồi/cá thể - Phân tích thống kê:Dùng trắc nghiệm Chi-Square chương trình Minitab version 16 để so sánh tỷ lệ nhiễm 3.4.2 Phƣơng pháp định danh phân loài 3.4.2.1 Phƣơng pháp định danh phân loại sán gan hình thái học Định danh phân lồi sán gan dựa vào tài liệu theo David and Erasmus (1972), Soulsby (1980), Nguyễn Thị Lê (2000) 3.4.2.2 Phƣơng pháp định danh sán gan lớn kỹ thuật sinh học phân tử (PCR-RFLP) giải trình tự gen Thu trữ mẫu ly trích DNA Chọn ngẫu nhiên 180 mẫu SLGL thu thập từ gan ống dẫn mật bò lò giết mổ đại diện cho tỉnh ĐBSCL Mẫu trữ dung dịch nước muối sinh lý đem phòng thí nghiệm để ly trích DNA Tách chiết DNA từ mẫu sán gan lớn Kiểm tra nồng độ DNA Thực phản ứng PCR - RFLP Phản ứng PCR: Bảng 3.1 Trình tự mồi tương ứng với gen Tên Gene Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Nhiệt độ -Tm Tham khảo (oC) ITS1-F: TTG CGC TGA TTA CGT CCC ITS1 TG 56 Itagaki T (2005) ITS1-R: TTG GCT GCG CTC TTC ATC Thực phản ứng PCR-RFLP Sản phẩm phản ứng PCR ủ với enzyme cắt giới hạn RsaI (5 IU) ủ qua đêm nhiệt độ 37oC sản phẩm thu được điện di agarose 1.5% có bổ sung Ethidium bromide điện 80 volt 30 phút Sản phẩm điện di ghi lại máy chụp hình gel Bảng 3.2 Dự đốn kiểu cắt hạn chế (restriction patterns) enzyme cắt giới hạn Enzyme RsaI vùng ITS1 sán gan lớn ITS1F/ITS1R Tên loài Enzyme sử dụng Nhiệt độ, thời gian ủ mồi Vị trí cắt Dự đốn chiều dài đoạn cắt (bp) Tài liệu tham khảo 367, 104 (68, 59, 5’ GT↓AC 3' 370C, ủ 54, 28) (Ichikawa RsaI 3' CA↑TG 5' qua đêm 367, 172 Itagaki, 2010) Fasciola (59, 54, gigantica 28) Giải trình tự chuỗi nucleotide khuếch đại chứa đa hình Chọn 12 mẫu SLGL đại diện cho tỉnh thuộc vùng ĐBSCL cụ thể tinh chọn mẫu, sản phẩm PCR mẫu tinh tách dòng Mẫu gửi lên công ty Marcogen (Hàn Quốc) để giải trình tự (sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp Sanger) * Chỉ tiêu theo dõi - Kết xác định loài SLGL kỹ thuật PCR-RFLP phương pháp xác định hình thái - Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS1 SLGL địa phương với với ngân hàng gen giới Fasciola hepatica * Phân tích xử lý số liệu :Trình tự đoạn gen ITS-1 12 mẫu SLGL sử dụng truy cập Ngân hàng gen dùng chương trình BLASTN NCBI để so sánh với trình tự Genbank; Clustal Omega để so sánh khác biệt trình tự, so sánh mức tương đồng phương pháp Pairwise alignment/Calculate identity/Similarity for sequences (Bioedit) 3.4.3 Nghiên cứu vòng đời Fasciola sp 3.4.3.1 Phƣơng pháp định danh phân loại ốc nƣớc Dựa vào hệ thống phân loại ốc nước John (1982), Đặng Ngọc Thanh ctv (1980) Dựa sở định danh phân loại ta chọn ốc Lymnaea để ni phòng thí nghiệm cho sinh sản hệ ốc để gây nhiễm ấu trùng SLGL cho ốc Lymnaea sp 3.4.3.2 Theo dõi trình phát triển trứng sán gan Fasciola sp mơi trƣờng điều kiện thí nghiệm a Đối tượng nghiên cứu Trứng SLGL, ốc Lymnaea swinhoei Lymnaea viridis ”ốc sạch” b Bố trí thí nghiệm Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm q trình phát triển trứng SLG lớn Nghiệm thức Số trứng/đĩa Số đĩa / nghiệm thức Đối chứng 60 10 60 10 60 10 Nghiệm thức 1: Trứng SLGL cho vào đĩa petri với mực nước 0,5cm, không chiếu sáng, pH từ 6-8, nhiệt độ từ 26 - 290C.Nghiệm thức 2: Trứng SLGL cho vào đĩa petri với mực nước 0,5cm, có chiếu sáng giờ/ngày, pH từ 6-8, nhiệt độ từ 26 290C.Nghiệm thức 3: Trứng SLGL cho vào đĩa petri không chứa nước c Chỉ tiêu theo dõi - Thời gian trứng bắt đầu nở thành miracidium thoát khỏi trứng - Thời gian trứng bắt đầu nở thành miracidium 50% số trứng hình thành miracidium thoát khỏi trứng 3.4.3.3 Theo dõi thời gian sống miracidium nƣớc a Đối tượng nghiên cứu Các miracidium thoát nắp vỏ trứng thu nhận từ nghiệm thức (Thí nghiệm q trình phát triển trứng SLG) để bố trí thí nghiệm xác định thời gian sống chúng nước b Bố trí thí nghiệm Sau gây nhiễm, ốc mổ khảo sát thời điểm sau: ngày, 10 ngày, 14 ngày, 18 ngày, 22 ngày, 26 ngày, 30 ngày, 34 ngày, 38 ngày 42 ngày phát cercaria bơi lội nước thành Adolescaria; đợt mổ 10 ốc Lymnaea swinhoei 10 ốc Lymnaea viridis để xác định thời gian giai đoạn phát triển ấu trùng (sporocyst, redia cercaria) loài ốc Lymnaea Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm thời gian sống miracidium nước Số miracidium Lơ thí nghiệm Số đĩa / nghiệm thức /đĩa 15 10 15 10 15 10 3.4.3.4 Theo dõi trình phát triển ấu trùng sán gan ký chủ trung gian ốc Lymnaea spp 960 ấu trùng miracidium, 240 ốc Lymnaea swinhoei 240 Lymnaea viridis ”ốc sạch” sử dụng thí nghiệm, miracidium lấy từ thí nghiệm Bảng 3.5 Bố trí gây nhiễm ấu trùng sán gan cho ốc Lymnaea Nghiệm thức Liều gây nhiễm (micracidium /ốc) Lymnaea swinhoei đối chứng Lymnaea viridis đối chứng Lymnaea swinhoei Lymnaea viridis Số ốc thí nghiệm 80 3 80 160 160 3.4.3.5 Gây nhiễm ấu trùng sán gan lớn cho bò a Đối tượng nghiên cứu Bố trí bò có độ tuổi từ tháng đến 12 tháng tuổi mua từ nông dân địa phương tỉnh khảo sát, mua tẩy giun sán thuốc albendazole kiểm tra phân khơng có nhiễm SLGL lồi giun sán khác b Bố trí thí nghiệm gây nhiễm cercaria cho bò thí nghiệm Sáu bò gây cảm nhiễm đường miệng với nghiệm thức, nghiệm thức tiến hành bò với liều gây nhiễm cho nghiệm thức 100, 150, 200 cercaria di động SLGL cho bò ống bơm tiêm qua đường miệng.Nghiệm thức đối chứng không gây nhiễm Theo dõi xuất trứng sán gan lớn phân bò gây nhiễm: Bắt đầu kiểm tra phân sau 11 tuần gây nhiễm ấu trùng SLGL cho bò sau kiểm tra phân hàng ngày phát trứng Fasciola sp phân phương pháp gạn rửa sa lắng - Mổ khám bò gây nhiễm: phát trứng SLGL phân bò - Chỉ tiêu theo dõi + Xác định thời điểm xuất trứng SLGL phân bò thí nghiệm + Số lượng SLGL thu bò thí nghiệm xác định loài SLGL phương pháp truyền thống sinh học phân tử 3.4.4 Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể biến đổi vi thể bò nhiễm sán gan lớn 3.4.4.1 Nghiên cứu triệu chứng bò nhiễm SLGL Quan sát thể trạng biểu lâm sàng 60 bò nhiễm SLGL tự nhiên bò gây nhiễm thực nghiệm 3.4.4.2 Nghiên cứu bệnh tích đại thể mô bệnh học gan nhiễm sán gan lớn - Đối tượng: Gan bò nhiễm SLGL gây nhiễm thực nghiệm 45 gan bò nhiễm SLGL tự nhiên thu thập từ sở giết mổ tỉnh ĐBSCL 3.4.5 Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sán gan lớn bò 105 bò lai Sind nhiễm SLGL phát phương pháp kiểm tra phân có cường độ nhiễm từ 2+ đến 3+ bố trí thử nghiệm với thc albendazole, triclabendazole, mebendazole với nghiệm thức (mỗi nghiệm thức15 con) bò chọn ngẫu nhiên để làm đối chứng Nghiệm thức 1: dùng liều lượng theo hướng dẫn nhà sản xuất.Nghiệm thức 2: dùng liều lượng cao liều hướng dẫn nhà sản xuất Nghiệm thức đối chứng: khơng dùng thuốc Bảng 3.7 Bố trí thử nghiệm albendazole, triclabendazole mebendazole tẩy trừ sán gan bò Nghiệm Liều dùng Số bò thử Đƣờng cấp thức (mg/kg thể trọng) nghiệm thuốc Đối chứng albendazole: 10mg/KgP 15 Uống triclabendazole: 15 Uống 15mg/KgP mebendazole:10mg/KgP 15 Uống albendazole:15mg/KgP 15 Uống triclabendazole: 15 Uống 20mg/KgP mebendazole:15mg/KgP 15 Uống c Chỉ tiêu theo dõi - Hiệu lực tẩy trừ thuốc sau 5, 10, 15 ngày điều trị, liều lượng thuốc tẩy trừ hiệu theo dõi phản ứng phụ thuốc bò điều trị 10 ctv (2010), Nguyễn Khắc Lực ctv (2010), Võ Thị Hải Lê ctv (2010), Nguyễn Hữu Hưng (2011), Nguyễn Thu Hương ctv (2012), Nguyen Thi Sam et al (2012), tác giả cho tỷ lệ nhiễm sán gan phụ thuộc vào nhóm tuổi Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm sán gan lớn theo lứa tuổi bò tỉnh ĐBSCL Tỉnh Lứa tuổi 1-2 NĂM 2 NĂM SMKT SMN TLN(%) c 23,97 21,79b 22,93b 14,79b 14,07b 12,69b 338 331 307 347 358 362 139 135 122 84 82 79 41,12 40,79c 39,74c 24,21c 22,91c 21,82c 19,06b 2.043 641 31,38c Chú thích: giá trị hàng có chữ khác khác có ý nghĩa thống kê P< 0,05; Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm sán gan lớn bò theo phương thức ni tỉnh ĐBSCL Phƣơng thức nuôi Tỉnh Nuôi nhốt Nuôi bán chăn thả SMKT SMN TLN(%) SMKT SMN TLN(%) 395 49 12,41a 641 219 34,17b AG a 385 46 11,95 602 203 31,67b ĐT 420 49 11,67a 573 195 34,03b VL a 296 24 8,11 637 125 19,62b BT 356 35 9,83a 544 107 19,67b TV a 375 32 8,53 560 102 18,21b ST Tổng 2.227 235 10,55a 3.557 951 26,74b Chú thích: giá trị hàng có chữ khác khác có ý nghĩa thống kê P< 0,05 Bảng 4.4 cho thấy ĐBSCL tỷ lệ nhiễm sán gan lớn bò ni bán chăn thả (26,74%) cao bò ni nhốt (10,55%) Qua phân tích thống kê tỷ lệ nhiễm sán gan lớn phương thức ni ĐBSCL có sai khác có ý nghĩa thống kê (p