BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  - NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC- XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  - NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Công Hoạt PGS.TS Lê Văn Năm Hà Nội, năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Toàn số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án nhận nhiều giúp đỡ từ tổ chức cá nhân Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Công Hoạt (Bộ Khoa học Công nghệ), PGS TS Lê Văn Năm (Hội đồng chức danh giáo sư nhà nước), PGS.TS Phạm Thị Tâm (Phòng Khoa học Hợp tác quốc tế, Viện Đại học Mở Hà Nội) định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới hỗ trợ tài chính, sở vật chất, trang thiết bị từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11- 15 Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi thực nội dung đề tài luận án, hỗ trợ mặt để tơi hồn thành luận án Để hoàn thành luận án này, tơi cịn nhận động viên, khuyến khích giúp đỡ bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tất giúp đỡ tình cảm quý báu nguồn động lực lớn giúp tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng ix Danh mục hình x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá mú 1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 1.1.4 Đặc điểm sinh sản 1.1.5 Đặc điểm hệ miễn dịch cá mú 1.2 Ýnghĩa kinh tế tình hình ni cá mú 1.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới Việt Nam10 1.3.1 Đặc điểm bệnh hoại tử thần kinh cá biển 10 1.3.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới 12 1.3.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam 15 1.3.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh cá 17 1.4 Tổng quan vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 21 1.5 Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 25 1.6 Kháng nguyên tái tổ hợp tình hình sử dụng vắc-xin phịng bệnh cho cá27 1.6.1 Kháng nguyên tái tổ hợp tác nhân gây bệnh 27 1.6.2 Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá giới 30 1.6.3 Tình hình sử dụng vắc-xin phịng bệnh cho cá Việt Nam 34 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 37 iii 2.2 Nội dung nghiên cứu .38 2.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Nhóm phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 38 2.3.1.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 38 2.3.1.2 Phương pháp mô bệnh học 38 2.3.1.3 Phương pháp phân lập vi rút kỹ thuật nuôi cấy tế bào 39 2.3.1.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 40 2.3.1.5 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 41 2.3.1.6 Điện di axit nucleic gel agarose 41 2.3.1.7 Phương pháp tách dòng gen: 41 2.3.2 Phương pháp xác định đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV) 45 2.3.2.1 Phương pháp xác định độc lực vi rút tế bào GS1 45 2.3.2.2 Phương pháp xác định độc lực vi rút cá mú 46 2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây nhiễm vi rút tế bào GS1 47 2.3.2.4 Thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây nhiễm vi rút cá mú 48 2.3.3 Nhóm phương pháp biểu gen mã hóa kháng nguyên đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp 48 2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực phản ứng nối gen 48 2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+ 49 2.3.3.3 Chuyển gen vào E coliJM109 49 2.3.3.4 Tách chiết plasmid từ khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra PCR enzyme giới hạn 50 2.3.3.5 Nuôi cấy E coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 51 2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE 51 2.3.3.7 Phương pháp Western blot 52 iv 2.3.3.8 Phương pháp đánh giá khả tạo kháng thể trung hòa kháng nguyên tái tổ hợp 53 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 56 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam 57 3.1.1 Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp mô bệnh học 57 3.1.2 Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp RT-PCR 59 3.1.3 Xác định vi rút gây bệnh tế bào 62 3.1.4 Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 NNV 67 3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú 72 3.2.1 Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh tế bào mẫn cảm72 3.2.2 Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 73 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh tế bào GS1 75 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 77 3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 80 3.3.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 80 3.3.2 Biểu gen mã hóa kháng nguyên T4 vi rút gây hoại tử thần kinh85 3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coliBL21(DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên NNV 85 3.3.2.2 Biểu gen T4 tế bào vi khuẩn tái tổ hợp 87 3.3.2.3 Đánh giá điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên T4 vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 92 3.3.3 Tinh kháng nguyên tái tổ hợp 95 v 3.3.4 Đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp 97 3.3.4.1 Đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp thỏ 97 3.3.4.2 Đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp cá mú 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích aa Amino axit BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh cá bơn) bp Base pair (cặp bazơ) BSA Bovine Serum Albumin (Albumin huyết bò) cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid (Chuỗi Axit Deoxyribonucleic acid bổ sung) CPE Cytopathogenic effect (Hiệu ứng bệnh tích tế bào) CNS Central nervous system (Hệ thần kinh trung ương) cs Cộng Da Dalton DAB Diamino bezidine (kit làm màu) DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (phản ứng miễn dịch liên kết enzyme) EtBr Ethidium Bromide FCS fetal calf serum (Huyết bào thai bê) HRP Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase) kb kilobase KDa Kilodalton GAA Global Aquaculture Alliance (Liên minh nuôi trồng thủy sản toàn cầu) GS Grouper spleen (tế bào lách cá mú) IPTG isopropyl β-D- thiogalactoside Ig Immunoglobulin (kháng thể) vii LB Leibovitz’s (môi trường nuôi tế bào) LD50 Lethal Dose 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) NCR Non coding region ND Not done (không đánh giá) NNV Nervous Necrosis Virus (vi rút gây hoại tử thần kinh) nt nucleotid OD Optical Density (mật độ quang) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở) PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di gel polyacrylamide) PCR Polemerase Chain Reaction (chuỗi phản ứng polime) PVDF Polyvinylidene Fluoride RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú chấm đỏ) RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR phiên mã ngược) SDS Sodium dodecyl sulphase SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh cá măng sọc) TAE Tris - acetate - EDTA TBS Tris Buffer Saline TBST TBS - Tween TCID50 Tissue culture infective dose 50% (liều gây chết 50% tế bào) TPNNV Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh cá hổ) UV Ultraviolet light VLPs Virus-like particles (Tạo hạt giả vi rút) VNN Viral Nervous Necrosis (Bệnh hoại tử thần kinh) viii Vũ Dũng Tiến, Đỗ Ngọc Liên, Lại Văn Hùng, Ngô Văn Quang (2003), Kết ban đầu điều chế thử vắc-xin phòng bệnh đốm đỏ cá trắm cỏ Ctenopharyngodon idellus, Tuyển tập báo cáo khoa học nuôi trồng thủy sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, trang 465 – 469 10 Lê Thị Thu Thảo, Võ Văn Quang Nguyễn Phi Uy Vũ (2011), “Danh sách thành phần loài họ cá mú Serranidae vùng biển Việt Nam”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Biển tồn quốc, lần thứ V, Quyển 4: Sinh học Nguồn lợi sinh vật, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội, tr 145–153 11 Lê Anh Tuấn (2004), “Tình hình ni cá mú Việt Nam: trạng trở ngại mặt kỹ thuật”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thủy sản, tr 174–179 12 Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hịa (2009), Miễn dịch học thủy sản, NXB Nơng nghiệp Hà Nội 13 Phan Thị Vân, Bùi Ngọc Thanh (2004), “Những dấu hiệu mô bệnh học VNN cá song chấm nâu Epinephelus coioides Hải Phòng Nghệ An”, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I 14 Nguyễn Thị Vui (2012), Phân lập xác định số đặc điểm sinh học virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú (Epinephelus spp)”, Luận văn thạc sĩ ngành Nuôi trồng thủy sản, trường Đại học Vinh 15 OIE, FAO (2005), Hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á, Disease strategy Viral encephalopathy and retinopathy Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội, 2005 Tài liệu Tiếng Anh 16 Anderson ED., Mourich DV., Leong JA (1996), “Gene expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) following intramuscular injection of DNA”, Molec.mar Biol Biotechnol., (2), 114–122 17 Arimoto M., Mori K., Nakai T., Muroga K., Furusawa I (1993), “Pathogenicity of the causitive agent of viral nervous necrosis disease in striped jack, Pseudocaranx dentex”, J Fish Dis 16 461–469 18 Arimoto M., Sato J., Maruya K., Mimura G., Furusawa I (1996), “Effect of chemical and physical treatments on the inactivation of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV)”, Aquaculture 143, p 15–22 19 Bondad MF; Kanchanakan S; Chinabut S (2000), “Review of grouper disease and health management stragegies for grouper and marine finfish diseases”, In: APE-CFWG02/2000, Workshop Development of a Regional Research Program on Grouper Virus Transmission and Vaccine Development, Bangkok, p 27–60 20 Bovo G., Nishizawa T., Maltese C., Borghesan F., Mutinelli F., Montesi F., De Mas S (1999), «Viral encephalopathy and retinopathy of farmed marine species in Italy” Virus Research 63, p 143–146 21 Breuil G., Pepin JF., Castric J., Fauvel C., Thiery R (2000), “Detection of serum antibodies against nodavirus in wind and farmed adult sea bass: application to the screening of brood stock in sea bass hatcheries”, Bull Eur: Assoc Fish Pathol.20, p 95–100 22 Brian M., Hillar K (1996), “Virology Methods Manual 1st Edition”, Academic Press, page 374 23 Chang SF., Ngoh GH., Kueh LFS., Qin QW., Chen CL., Lam TJ., Sin YM (2001), “Development of a tropical marine fish cell line from Asian seabass Lates calcarifer for virus isolation”, Aquaculture 192, p 133–145 24 Chi SC., Shieh JR., Lin SC (2003), “Genetic and antigenic analysis of betanodaviruses isolated from aquatic organisms in Taiwan”, Diseases of Aquatic Organisms, p 221–228 25 Cho HS., Seo JY., Park SI., Kim TG., Kim TJ (2018), “Oral immunization with recombinant protein antigen expressed in tobacco against fish nervous necrosis virus”, J Vet Med Sci 80(2):272–279 26 Christie KE (1997), “Immunization with viral antigents: Infectious pancreatic necrosis”, In: Fish Vaccinology; Developments in Biological Standardizationn Basel, Karger, 90 191–199 27 Chen YM., Wang TY., Chen TY (2014), “Immunity to betanodavirus infections of marine fish”, Dev Comp Immunol, 43 (2): 174–183 Dol: 10.1016/j 28 Comps M., Trindad M., Delsert C (1996), “Investigation of fish encenphalitis viruses expression in marine fishes using DIG-labeled probes”, Aquaculture 143, p 113–121 29 Costa JZ., Thompson KD (2016), “Understanding the interaction between Betanodavirus and its host for the development of prophylactic measures for viral encephalopathy and retinopathy”, Fish Shellfish Immunol 53:35–49 30 Danayadol Y., Direkbusarakom S., Supamattaya K (1995), “Viral nervous necrosis in brown- spotted grouper Epinephelus malabaricus culture in Thailand”, In: Diseases in Asian Aquaculture II Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, p 227–233 31 Doan QK., Vandeputte M., Chatain B., Morin T., Allal F (2017), “Viral encephalopathy in aquaculture: a review”, J Fish Dis ; 40 (5): 717–742 32 Frerichs GN., Tweedie A., Starkey WG., Richards RH (2000), “Temperature, pH and electrolyte sensitivity, and heat, UV and disinfection inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy virus”, Aquaculture 185, p 13–24 33 Fukuda Y., Nguyen HD., Furuhashti M., Nakai T (1996), “Mass mortality of cultured sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus, associated with viral nervour necrosis”, Fish Pathol; 31: 165–170 34 Grotmol S., Totland GK (2000), “Surface disinfection of Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus with ozonated sea-water inactivates nodavirus and increases survival of the larvae”, Dis Aquat Org.39, 89–96 35 Gye HJ., Nishizawa T (2013), “Assessment of the sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus with a live nervous necrosis virus (NNV) vaccine at natural seawater temperature”, Vaccine Volume 31, Issue 16, 12 April 36 Hegde A (2003), Characterization and immunological studies of fish nervour necrosis virus, A thesis submitted for the degree of doctor of philosophy department of Biological sciences National University of Singapore 37 Heppell J., Heather L (2000), “Application of DNA vaccine technology to aquaculture”, Davis Advanced Drug Delivery Reviews 43, p 29–43 38 Husgard S., Grotmol S., Hjeltnes BK., Rodseth OM., Biering E (2001), “Immune response to a recombinant capsid protein of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) in turbot Scophthalmus maximus and evaluation of a vaccine againts SJNNV”, Dis Aquaculture Org 45, 33–44 39 Iwamoto T., Nakai T., Mori K., Arimoto M., Furusawa I (2000), “Cloning of fish cell line SSN-1 for piscine nodaviruses”, Dis Aquat Org 43, 81–89 40 Kai YH., Su H., Tai J., Chi SC (2010), “Vaccination of grouper broodfish (Epinephelus tukula) reduces the risk of vertical transmission by nervous necrosis virus”, Vaccine 28: p 996 – 1001 41 Kim JO., Kim WS., Oh MJ (2015), “Development of a Recombinant Protein Vaccine Based on Cell-Free Protein Synthesis for Sevenband Grouper (Epinephelus septemfasciatus) Against Viral Nervous Necrosis”, J Microbiol Biotechnol, 25(10), 1761–1767 42 Lai YS., Chiu HC., Murali S., Guo IC., Chen SC., Fang K., Chang CY (2001), “In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara”, J Fish Dis.24, 237–244 43 Lorenzen N., LaPatra SE (2005), “DNA vaccines for aquacultured fish”, Rev sci tech Off int Epiz., 24 (1), 201–213 44 Munday BL., Kwang J., Moody N (2002), “Betanodavirus infections of teleost fish: a review”, J Fish Dis 25, 127–142 45 Muroga K (1995), “Viral and bacteria diseases in larval and juvenile marine fish and shellfish: a review”, Fish Pathol 30, 71 – 85 46 Nakai T., Mori T., Nishizawa T., Muroga K (1995), “Viral nervous necrosis of larval and juvenile marine fish”, Proceedings of the international Symposium on Biotechnology Aplication In Aquaculture Asian Fish p147– 152 47 Nakai T (2000), “Recent advances in the diagnosis and control of viral nervous necrosis (VNN) in groupers”, In: Development of a regional research program on grouper virus transmission and vaccine development, Bangkok P 18–20 48 Nishizawa T., Furuhashi M., Nagai T., Muroga K (1997), “Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene”, Applied and Environmental Microbiology 63, 1633–1636 49 Nishizawa T., Gye HJ., Takami I., Oh MJ (2012), “Potentiality of a live vaccine with nervous necrosis virus (NNV) for sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus at a low rearing temperature”, Vaccine; 30 (6): 1056–63 50 Oh MJ., Gye HJ., Nishizawa T (2013), “Assessment of the sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus with a live nervous necrosis virus (NNV) vaccine at natural seawater temperature”, Vaccine; 31 (16): 0025–7 51 Pakingking JR., Bautista NB., de Jesus-Ayson EG., Reyes O (2010), “Protective immunity against viral nervous necrosis (VNN) in brown-marbled grouper (Epinephelus fuscogutattus) following vaccination with inactivated betanodavirus”, Fish and Shellfih Immunology 28: 525–533 52 Pasnik DJ., Smith SA (2005), “Immunogenic and protective effects of a DNA vaccine for Mycobacterium marinum in fish”, Immunopathol, 103 (34), 195–206 53 Peducasse S., Castric R., Thiery R., Jeffroy J., Le VA; Baudin L (1999), “Compare studies of viral encenphalopathy and retinopathy in juvenile sea bass Dicentrarchus labrax infected in different ways”, Dis Aquat Org 36, p 11 – 20 54 Purcell MK., Kurath G., Garvet KA., Herwig RP., Winton JR (2004), “Quantitative expression profiling of immune response genes in rainbown trout following infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV) infection or DNA vaccination”, Fish Sellfish Immunol, 17 (5) 447–462 55 Qin QW., Wu TH., Jia TL., Hegde A., Zhang RQ (2006), “Development and characterization of a new tropical marine fish cell line from grouper, Epinephelus coioides susceptible to iridovirus and nodavirus”, J Virol Methods 131, 58–64 56 Ransangan J., Manin BO., Lal TMM., Lu KC, Sade A., Azila A (2013), “Betanodavirus Infection in Marine Fish Aquaculture in Malaysia”, Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences , ISSN 2320 – 6535 Vol 1(7), p 10–15 57 Reed LT., Muench H (1938), A simple method of estimating fifty percent end points, The American Journal of Hygienne: p 493–497 58 Rimmer MA., Phillips MJ., Sim SY (2006), “Aquaculture of groupers in Asia and the Pacific”, In: Proceedings Economics and marketing of the live reef fish trade in Asia–Pacific, Noumea, ACIAR Working Paper No p 116– 134 59 Roy PE., Yanong (2010), “Viral nervous necrosis (betanodavirus) infections in fish”, University of Florida 60 Russell PH., Kanellos T., Negrou M., Ambali AG (2000), “Antibody responses of goldfish (Carassius auratus) DNA immunization at different temperatures and feeding levels”, Vaccine, 18, 2331–2336 61 Sambrook J., Russell DW (2001), Molecular cloning: a laboratory manual, CSHL Press 62 Setty M., Maiti B., Santhosh KS., Venugopal MN., Karunasagar I (2012), “Betanodavirus of Marine and Freshwater Fish: Distribution, Genomic Organization, Diagnosis and Control Measures”, ndian J Virol; 23(2): 114– 123 63 Sohn SG., Park MA (1998), “Viral diseases of cultured marine fish and shrimp in Korea”, Fish Pathol 33, 189–192 64 Sommerset I., Skern R., Biering E., Bleie H., Fiksdal IU., Nerland AH (2005), “Protection against Atlantic halibut nodavirus in turbot is induced by recombinant capsid protein vaccination but not following DNA vaccination”, Fish Sellfish Immunol, 18 (1), 13–29 65 Tanaka S., Mori K., Arimoto M., Arimoto T., Nakai T (2001), “Protective immunity of sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus Thunberg, against experimental viral nervous necrosis”, J Fish Dis 24, 15–22 66 Toffan A., Panzarin V., Toson M., Cecchettin K., Pascoli F (2016), “Water temprature affects pathogenicity of different betanodavirus genotypes in experimentally challenged Dicentrarchus labrax”, Dis Aquat Organ, 119 (3):231–6 67 Tveteras R (2016), “Global Fish Production Data & Analysis”, University of Stavanger, Global outlook for Aquaculture leadership Global Aquaculture Alliance 2016 68 Watanabe K., Nishizawa T., Yoshimuzu M (2000), “Selection of broodstock candidates of barfin flounder using an ELISA system with recombinant protein of barfin flounder nervous necrosis virus”, Dis Aqua Org.41, 219–223 69 Yamashita H., Mori K., Kuroda A., Nakai T (2009), “Neutralizing antibody levels for protection against betanodavirus infection in sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus (Thunberg), immunized with an inactivated virus vaccine”, J Fish Dis 32(9):767–75 70 Yuasa K., Koesharyani I., Roza D., Mori K., Katata M., Nakai T (2002), “Immune response of humpback grouper Cromileptes altivelis, injected with the recombinant coat protein of betanodavirus”, J Fish Dis 25: 53–56 71 Zafran HT., Yuasa K., Hatai K (2001), “Viral nervos necrosis in humpback grouper Chromileptes altivelis larvae and Juveniles”, Fish Pathol 35, 95–96 TÀI LIỆU WEBSITE 72 http://m.vasep.com.vn/Tin-Tuc/1025_49048/Nuoi-bien-Huong-di-quantrong-cho-nganh-thuy-san.htm 73 https://nongnghiep.vn/quang-ngai-nhan-rong-mo-hinh-nuoi-ca-mu-tronglong-post209956.html 74 https://baotintuc.vn/kinh-te/phat-trien-nghe-nuoi-ca-long-be-tren-bien20180221091402318.htm PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đặc điểm mẫu bệnh phẩm STT Ký hiệu mẫu Mắt Não Biểu lâm sàng Gen T4 QN1 - - AB - QN2 ++++ +++ ABCD + QN3 - - AB - QN4 ++++ +++ ABCD + QN5 - - AB - QN6 - - AB - QN7 +++ ++ ABCD - QN8 - - AB - HP1 - - AB - 10 HP2 ++ + AB + 11 HP3 - - AB - 12 HP4 +++ +++ ABCD + 13 HP5 +++ +++ ABCD - 14 HP6 - - AB + 15 HP7 - - AB + 16 HP8 +++ +++ ABCD + 17 HP9 - - AB - 18 HP10 + - AB + 19 HP11 - - AB + 20 NĐ1 +++ +++ ABCD + 21 NĐ2 - - AB - 22 NĐ3 + - AB + 23 NĐ4 +++ +++ ABCD + 24 NĐ5 +++ +++ ABCD + 25 NĐ6 - - AB - 26 NĐ7 + - AB + 27 NĐ8 + - AB + 28 NĐ9 - - AB - 29 NĐ10 +++ +++ ABCD + 30 NĐ11 +++ +++ ABCD + 31 KH1 - - AB - 32 KH2 - - AB - 33 KH3 - - AB - 34 KH4 +++ ++ ABCD + 35 KH +++ +++ ABCD + 36 KH6 + - AB - 37 KH7 - - AB - 38 KH8 - - AB - 39 KH9 + - AB + 40 BT1 + - AB - 41 BT2 +++ +++ ABCD + 42 BT3 - - AB + 43 BT4 +++ +++ ABCD + 44 BT5 - - AB - 45 BT6 - - AB - 46 BT7 + - AB + 47 BT8 - - AB - 48 BT9 +++ +++ ABCD + 49 BT10 - - AB + 50 BT11 - - AB - 51 BT12 +++ ++ ABCD + Ghi chú: A: Bỏ ăn B: Bơi tách đàn, màu sắc thể đen tối C: Mắt lồi, bóng căng, ruột chứa dịch D: Bơi ngửa, bơi xoay trịn, có tượng chết (-): Khơng có CPE mơ não, mơ mắt; khơng có gen T4 (+): Có gen T4 (++): CPE > 50% (+++): CPE > 85% (++++): CPE > 98%, có tượng tan bào Phụ lục 2: Một số phương pháp sử dụng luận án Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) Phản ứng RT-PCR phản ứng khuếch đại đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý PCR, bao gồm giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất: Phiên mã ngược khn mẫu RNA thành sợi cDNA, sau dùng sợi làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA Giai đoạn thứ hai: Dùng sợi đôi làm khuôn mẫu để thực phản ứng Đối với NNV, kĩ thuật RT-PCR bao gồm giai đoạn: giai đoạn phiên mã ngược từ mạch khuôn RNA NNV để tạo cDNA giai đoạn khuếch đại đoạn cDNA tạo nên số cần thiết Để khuếch đại trình tự T4 RNA-2 dài 421 bp E fuscogutatus E.akaara, dựa trình tự GenBank chúng tơi thiết kế cặp mồi gồm: P1 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) P2 (3’-AGAAGTGGGCACAACTGAGC-5’) Thành phần phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích (µl) RT-PCR buffer 10 Q- solution 10 dNTP Enzyme DNA-polymerase Mồi: P1-P2 0,6 RNA temperlate RNase- free water 19,8 Tổng 50 Chu trình nhiệt RT: 50ºC/ 30phút PCR: Biến tính 95ºC/ 15phút - 94ºC/ 30s - 60ºC/30s - 72ºC/ 1p - 72º C/ 5p 30 cycle Phương pháp điện di gel agarose Theo phương pháp Sambrook J, Russel DW (2001) + Cân 0,2 gam agarose đun nóng chảy bổ sung 1µl EtBr đổ vào khuôn gel lắp sẵn lược để tạo giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau gel nguội hồn tồn rút lược đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X, cho đệm ngập hoàn toàn gel + Tra mẫu: lấy thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA), trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát giúp cho phân tử DNA lắng xuống trình điện di) sau tra vào giếng gel + Chạy điện di hiệu điện 110V, thời gian 20-30 phút + Sau lấy gel tráng qua nước quan sát chụp ảnh ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm Phương pháp tinh DNA gel agarose Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt enzym giới hạn tiến hành tinh theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có TOPO® TA Cloning Kit hãng Invitrogen với bước sau: Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn Cân lát gel hịa tan với dịch đệm (GS1) có kit với tỉ lệ 10: 60 (mg/ µl) ống vô trùng 5ml Ủ 50°C 15 phút, phút lại lắc để gel agarose tan chảy hết Làm tan gel với dung dịch đệm TE 65°C- 75°C Hút 400µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer (GS1) vào cột, trộn ủ nhiệt độ phòng , ly tâm 12.000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch phía Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm 12.000 vòng/phút vòng phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột tinh sang eppendorf 1,5 ml Bổ sung 50 µl TE buffer (65-70°C) vào cột, ủ nhiệt độ phòng phút 10 Ly tâm 12.000 vòng/phút phút, loại bỏ cột tinh sạch, thu hồi eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản -20°C Phụ lục 3: Kết so sánh mức độ đồng trình tự đoạn gen T4 với trình tự GenBank ... dung nghiên cứu - Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Vi? ??t Nam - Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú - Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên. .. độ đến khả gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 77 3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú ... Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh tế bào mẫn cảm72 3.2.2 Đặc tính gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú 73 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút gây hoại tử thần kinh