TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN - HÀ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY HOA TRIỆU CHNG ( Calibrachoa praviflora ) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền học HÀ NỘI- 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN - HÀ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY HOA TRIỆU CHUÔNG ( Calibrachoa praviflora ) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học Th.S PHẠM PHƢƠNG THU HÀ NỘI- 2018 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Phƣơng Thu giảng viên Khoa Sinh - KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài tơi nhận đƣợc giúp đỡ tận tình thầy La Việt Hồng cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tơi hồn thành đề tài khóa luận, nhân tơi xin gửi lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học Chuyển giao Cơng nghệ, Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, phƣơng tiện để hồn thành khóa luận Cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, góp ý cho tơi q trình học tập hồn thành đề tài Hà Nội, ngày 17 tháng năm 2018 Sinh viên HÀ THỊ LAN ANH LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc cơng bố Hà Nội, ngày 17 tháng năm 2018 Sinh viên HÀ THỊ LAN ANH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: Napthlacetic acid BAP: 6- Benzyl amino purin MS: Murashige Skoog Nxb: Nhà xuất CT: Công thức ĐC: Đối chứng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các công thức thí nghiệm xác định hiệu chất 20 khử trùng 20 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả tạo cụm chồi hoa Triệu chuông 21 Bảng 2.3 Ảnh hƣởng NAA đến tạo rễ hoa Triệu chuông in vitro 22 Bảng 2.4 Ảnh hƣởng giá thể tới tỉ lệ sống hoa Triệu chuông 23 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian nồng độ chất khử trùng NaClO đến khả tạo mẫu tái sinh chồi 25 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BAP Kinetin đến hệ số nhân chồi Triệu chuông 27 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng giá thể đến tỷ lệ sống mô Triệu chuông sau tuần 33 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.Hoa Triệu chng (Calibrachoa parviflora) Hình 1.2 Một số màu hoa có hoa Triệu chng Hình 3.1 Chồi hoa Triệu chuông 25 Hình 3.2 Cụm chồi Triệu chng sau tuần ni cấy mơi trƣờng có bổ sung BAP 29 Hình 3.3 Chồi in vitro hoa Triệu chng có bổ sung 0,3 mg/l Kinetin sau tuần ni cấy 30 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng α-NAA đến khả hình thành rễ hoa Triệu chng 31 Hình 3.4 Tạo rễ Triệu chng in vitro 32 Hình 3.5 Cây hoa Triệu chuông giai đoạn rèn luyện 35 Hình 3.6 Triệu chng in vitro hoa ngồi tự nhiên 35 Hình 3.7 Nhân nhanh hoa Triệu chuông in vitro 36 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa đề tài NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) 1.1.1 Vị trí, phân loại: 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lí 1.1.4 Kĩ thuật chăm sóc hoa Triệu chuông 1.2 Kĩ thuật nhân giống hoa Triệu chuông 1.2.1 Nhân giống hữu tính 1.2.2 Nhân giống vơ tính 1.2.3 Nhân giống vơ tính in vitro hoa Triệu chng 1.2.3.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.3.2 Các giai đoạn quy trình nhân giống in vitro 1.2.3.3 Đặc điểm giống in vitro 11 1.2.3.4 Những yếu tố ảnh hƣởng đến kỹ thuật nhân giống vơ tính in vitro 11 1.3 Tình hình sản xuất nghiên cứu nhân giống hoa Triệu chuông 16 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 17 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 17 2.2.3 Môi trƣờng nuôi cấy 18 2.2.4 Điều kiện nuôi cấy 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 19 2.3.2 Phƣơng pháp phân tích số liệu 23 CHƢƠNG 3: K T QUẢ VÀ THẢO UẬN 24 3.1.Tạo vật liệu in vitro từ chồi hoa Triệu chuông 24 3.2 Nhân nhanh chồi hoa Triệu chuông in vitro 26 3.3 Kích thích chồi rễ tạo in vitro hoàn chỉnh 30 Ảnh hƣởng loại giá thể lên tỷ lệ sống in vitro đƣa vƣờn ƣơm 32 CHƢƠNG 4: K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 MỞ ĐẦU 1.Lí chọn đề tài Triệu chng (Calibrachoa parviflora lồi hoa thuộc họ Cà (Solanaceae), phân bố chủ yếu vùng Nam Mỹ, Mexico, tây nam Hoa Kỳ [7], [16] Đây loài hoa cảnh đƣợc ƣa chuộng giới màu sắc vô đa dạng phong phú Về hình thái, hoa Triệu chng có đặc điểm gần giống với hoa Dạ yên thảo, hai loài thuộc họ Cà nhƣng hai chi khác Theo nghiên cứu củaStehmann cộng (1997), hoa Triệu chuông có NST 2n = 18, Dạ yên thảo có NST 2n = 16 chúng khác xa nhauvề cấu trúc nhiễm sắc thể [20] Đặc tính bật hoa Triệu chuông so với Dạ yên thảo hoa nhỏ sai hoa hơn, hoa quanh năm, thời gian chơi hoa dài hơn, khả chịu nắng nóng mƣa tốt Vì thế, đƣợc xem đối tƣợng hoa cảnh phù hợp để phát triển với điều kiện Việt Nam Theo thông tin từ sở cung ứng giống, phần lớn giống Triệu chuông đƣợc gieo từ hạt F1 nhập khẩu, nhiên giá bán hạt giống Triệu chuông cao, tỷ lệ nảy mầm hạt tƣơng đối thấp (khoảng 50% - 60%), có tỷ lệ chết cao, ảnh hƣởng đến giá thành giống Ngoài phƣơng pháp gieo hạt, Triệu chng nhân giống phƣơng pháp giâm cành, nhiên phƣơng pháp nhân giống có hệ số nhân thấp, giâm cành có sức sống yếu gieo hạt nhanh tàn Do vậy, việc cung ứng nguồn in vitro bệnh, hồn thiện quy trình nhân giống hoa Triệu chuông cần thiết Đây tiền đề quan trọng để góp phần bảo tồn nguồn gen phục vụ công tác chọn tạo giống Tuy nhiên, nghiên cứu tập trung vào phân loại [20] xây dựng phát sinh loài [7] khử trùng mức thấp nồng độ NaClO thấp, thời gian xử lí mẫu ngắn khơng đủ để diệt hết nấm mốc vi khuẩn nên tỉ lệ mẫu nhiễm mức cao 62%.Tuy nhiên, đơn vi thời gian (5 phút , tăng nồng độ chất khử trùng từ 5% lên 7% hiệu khử trùng tăng rõ rệt, cụ thể tỉ lệ mẫu nhiễm giảm xuống 10% tỷ lệ tạo mẫu tái sinh chồi tăng từ 20% lên 80% Trong đó, thời gian khử trùng mẫu phút tỉ lệ mẫu tái sinh chồi tăng từ 36% (NaClO 5%) lên 40% (NaClO 7%) CT (NaClO 7% /7 phút đạt tỉ lệ mẫu nhiễm nhỏ 5%, nhiên số mẫu chết chiếm tỉ lệ lớn 55% thời gian khử trùng nồng độ NaClO cao làm chết tế bào thực vật nên không đạt hiệu khử trùng Nhƣ vậy, công thức khử trùng tạo mẫu hoa Triệu chng sạch, có khả tái sinh chồi tối ƣu xử lí sơ mẫu kết hợp khử trùng NaClO 7% thời gian phút, cho tỷ lệ mẫu đạt 90% với tỷ lệ mẫu sống đạt 80% 3.2 Nhân nhanh chồi hoa Triệu chng in vitro Mục đích thí nghiệm nhân nhanh hoa Triệu chuông tạo lƣợng lớn chồi in vitro từ chồi ban đầu, lƣợng chồi tạo thí nghiệm đƣợc dùng làm nguyên liệu cho thí nghiệm Để nhân nhanh chồi in vitro, giai đoạn đầu cần phải điều khiển mô nuôi cấy phát sinh nhiều chồi để tăng lƣợng mẫu sạch.Trong kĩ thuật nuôi cấy mô, nghiên cứu gần Himanen, Boucheron (2002) OrtízCastro, Contreras-Cornejo (2009) cho thấy, thực vật chịu ảnh hƣởng rõ rệt chất điều hòa sinh trƣởng (ĐHST [10], [17] Các chất ĐHST nhƣ BAP Kinetin nồng độ khác đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy MS để đánh giá khả tái sinh chồi hoa Triệu chuông 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP Kinetin đến hệ số nhân chồi Triệu chng Mơi Chất kích Sau Sau Sau Hình Chất trƣờng thích sinh tuần tuần tuần thành ƣợng mô sẹo chồi - ** + *** + *** + *** + ** - *** - *** - *** trƣởng MS 1,0d 1,0d 2,4bcd (ĐC ±0,00 ± 0,00 ± 0,48 0,1mg/l 2,4b 3,4b 4,2b BAP ± 1,01 ± 1,01 ± 0,74 0,3mg/l 4,0a 6,0a 11,8a MS bổ BAP ± 0,63 ± 1,41 ± 2,78 sung 0,5mg/l 1,8bcd 3,2b 3,2bc BAP BAP ± 0,74 ± 0,74 ± 0,74 0,7mg/l 1,2cd 1,2d 0,8d BAP ± 0,40 ± 0,74 ± 0,74 0,1 mg/l 1,0d 1,8cd 2,0cd MS bổ Kinetin ± 0,00 ± 0,74 ± 0,89 sung 0,3 mg/l 2,0bc 2,6bc 3,0bc Kinetin Kinetin ± 0,89 ± 0,48 ± 0,63 0,5 mg/l 1,0d 1,4cd 2,2cd Kinetin ± 0,00 ± 0,48 ± 0,74 0,85 1,17 1,67 LSD0,05 Ghi chú: * ch t ượng ch i (ch i mảnh, còi, yếu); ** ch t ượng ch i (ch i trung bình,mảnh, xanh); *** ch t ượng ch i tốt (ch i cao, mập, thân xanh đ ng đ u) Trong ph m vi cột, giá trị mang chữ cáikhác ch sai hác có ý nghĩa thống kê mức α = 05 Số liệu bảng 3.2 cho thấy, chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò định đến phát sinh chồi mô nuôi cấy Trên môi trƣờng khơng 27 bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng mẫu cấy khơng có kích ứng tạo chồi Hệ số nhân chồi thu đƣợc thấp, khoảng 2,4 lần sau tuần nuôi cấy, chồi chủ yếu phát triển chiều cao, số Tuy nhiên, chồi mảnh, bé màu xanh nhạt Kết thu đƣợc sau tuần ni cấy cho thấy có chênh lệch hệ số nhân chồi môi trƣờng thăm dò Mơi trƣờng bổ sung Kinetin có hệ số nhân chồi khơng cao, giao động khoảng 1,0 ÷ 2,0 lần Trong đó, mơi trƣờng bổ sung BAP tỏ thích hợp để nhân nhanh cụm chồi Ban đầu, từ chồi cấy vào hình thành lên mơ sẹo, sau mơ sẹo phát triển phát sinh thành chồi riêng biệt Khi tăng dần nồng độ BAP từ 0,1 mg/l lên 0,3 mg/l hệ số nhân chồi tăng dần từ 2,4 ÷ 4,0 lần Tuy nhiên, dần tăng nồng độ BAP lên 0,7 mg/l hệ số nhân chồicó xu hƣớng giảm xuống Tiếp tục theo dõi giai đoạn sau - tuần ni cấy khơng có tƣợng hình thành mơ sẹo tất nồng độ môi trƣờng bổ sung Kinetin, hệ số nhân chồi thấp, có xu hƣớng phát triển thành hồn chỉnh Trong đó, mơi trƣờng bổ sung BAP tỏ thích hợp để nhân nhanh cụm chồi Mơ sẹo tiếp tục tăng kích thƣớc bật thành chồi Ở môi trƣờng MS bổ sung BAP 0,3 mg/l cho kết hệ số nhân chồi đạt giá trị cao khoảng 11,8 lần Khi dần tăng nồng độ BAP lên 0,7 mg/l hệ số nhân chồi giảm, xuất mơ sẹo đen kích thƣớc nhỏ khơng có khả bật chồi Điều đƣợc giải thích tái sinh chồi in vitro phụ thuộc vào hàm lƣợng cytokinin nội sinh ngoại sinh Khi nồng độ cytokinin cao ức chế q trình tái sinh chồi thơng qua chất lƣợng chồi giảm xuống, ngừng sinh trƣởng Nhƣ vậy, BAP hợp chất cytokinine có tác dụng tốt tới khả nhân nhanh chồi nhân giống in vitro hoa Triệu chuông Môi trƣờng MS bổ sung 0,3 mg/l BAP cơng thức thích hợp, cho hệ số nhân chồi cao 28 (11,8 lần) với chất lƣợng chồi tốt (chồi cao, mập, thân xanh đồng đều) đủ tiêu chuẩn cho rễ tạo in vitro hoàn chỉnh A Môi trƣờng MS bổ sung 0,3mg/l BAP B Mơi trƣờng MS bổ sung 0,7 mg/l BAP Hình 3.2 Cụm chồi Triệu chuông sau tuần nuôi cấy mơi trường có bổ sung BAP 29 Hình 3.3 Chồi in vitro hoa Triệu chng có bổ sung 0,3 mg/l Kinetin sau tuần ni cấy 3.3 Kích thích chồi rễ tạo in vitro hoàn chỉnh Rễ phận thiếu cây, rễ giúp hút nƣớc muối khoáng, để in vitro sống sót sinh trƣởng tốt ngồi tự nhiên cần phải hồn thiện rễ Chính vậy, mục đích thí nghiệm tìm mơi trƣờng thích hợp kích thích tạo rễ hoa Triệu chuông in vitro α-NAA chất ĐHST thuộc nhóm auxin, có tác dụng kích thích sinh trƣởng giãn tế bào hình thành rễ Các chồi in vitro đƣợc hình thành giai đoạn nhân nhanh có hình dáng cụm chồi (gồm nhiều chồi/gốc) Các chồi đƣợc tách đơn lẻ (chồi cao 1,5 - 3cm, có - lá) cấy vào mơi trƣờng có bổ sung -NAA nồng độ từ 0,1 - 0,5 mg/l Theo dõi ảnh hƣởng nồng độ -NAA đến khả kích ứng tạo rễ chồi in vitro sau tuần nuôi cấy, kết thu đƣợc trình bày bảng 3.3 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng α-NAA đến khả hình thành rễ hoa Triệu chng Chất kích Mơi trƣờng thích sinh Số rễ/mẫu trƣởng NAA rễ (mm) 3,0c 3,6c ± 1,41 ± 1,35 0,1mg/l 13,4a 16,0a NAA ±3,61 ± 4,0 0,3mg/l 8,2b 10,2b NAA ± 2,92 ± 2,71 0,5mg/l 4,8bc 5,4c NAA ± 2,03 ± 2,65 3,94 4,25 MS (ĐC MS bổ sung Chiều dài LSD0,05 Chất ƣợng rễ Ít, gầy Nhiều, mập Nhiều, mập Ít, mập (Ghi chú: Trong ph m vi cột, giá trị mang chữ khác ch sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 05) Kết rễ sau tuần nuôi cấy cho thấy, môi trƣờng đối chứng chồi in vitro có khả rễ,tuy nhiên thời gian xuất rễ chậm,số rễ/chồi ít, rễ nhỏ yếu có màu trắng, thân gầy, nhỏ Đây đặc điểm khơng có lợi cho in vitro đƣa ngồi tự nhiên Khi bổ sung -NAA vào mơi trƣờng nuôi cấy mức nồng độ khác nhau, sinh trƣởng tốt, to, chồi mập,cứng cáp q trình rễ chồi in vitro có thay đổi rõ rệt Thời gian xuất rễ sau vài ngày nuôi cấy, rễ mập, màu trắng đục, số rễ trung bình/mẫu cơng thức bổ sung chất ĐHST dao động từ 4,8 ÷ 13,4 rễ; khác biệt đƣợc thể rõ rệt 31 chiều dài rễ, khoảng nồng độ α-NAA từ 0,1 ÷ 0,5 mg/l chiều dài rễ dao động 5,4 ÷ 16mm Bảng 3.3 cho thấy số rễ/mẫu chiều dài rễ đạt đỉnh công thức môi trƣờng MS bổ sung NAA 0,1 mg/l giảm dần tăng nồng độ NAA Tóm lại: -NAA có ảnh hƣởng tốt đến hình thành rễ chồi in vitro hoa Triệu chng Để tạo hồn chỉnh nhân giống in vitro hoa chuông, bổ sung 0,1 mg -NAA/l vào môi trƣờng cho hiệu tốt Hình 3.4 Tạo rễ Triệu chng in vitro A Trên mơi trƣờng có bổ sung 0,0 mg/l NAA (ĐC B Trên mơi trƣờng có bổ sung 0,1 mg/l NAA Ảnh hƣởng loại giá thể lên tỷ lệ sống in vitro đƣa vƣờn ƣơm Giai đoạn chuyển in vitro từ phòng thí nghiệm (điều kiện nhân tạo) vƣờn ƣơm (điều kiện tự nhiên thƣờng gặp nhiều khó khăn nhƣ: tỷ lệ sống thấp, sinh trƣởng sâu bệnh công Nguyên nhân in vitro đƣa vƣờn ƣơm mẫn cảm với mơi trƣờng, rễ non 32 yếu, điều kiện thời tiết khắc nghiệt khâu xử lý giá thể trƣớc trồng chƣa phù hợp… Vì vậy, việc xác định đƣợc cơng thức giá thể trồng có ý nghĩa định đến thành cơng quy trình nhân giống in vitro Bên cạnh đó, cần phải có chế độ chăm sóc đặc biệt cho giống in vitro Khi cho ngồi tự nhiên, chúng tơi cho làm quen để thích nghi tốt Cây đƣợc rửa loại bỏ thạch dƣới vòi nƣớc chảy đƣợc cấy vào khay chuẩn bị với thành phần giá thể khác (bảng 3.4 để đánh giá tỷ lệ sống mô Một tuần đầu tiên, chúng tơi che kín miếng nilon suốt cỡ lớn để giúp không bị nƣớc bị héo Các tuần tiếp theo, sau cứng cáp dần thích nghi chúng tơi cho ngồi, tƣới nƣớc thƣờng xuyên ngày lần để đảm bảo độ ẩm Ngoài ra, nên tƣới nƣớc vòi phun sƣơng, lƣu ý không tƣới thẳng vào gốc để tránh làm bị ủng thối rễ Bảng 3.4 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống mô Triệu chuông sau tuần Tỷ lệ sống Công thức (%) sau Loại giá thể tuần Tỷ lệ sống (%) sau tuần 100% cát 25% cát + 75% đất 76 62 50% cát + 50% đất 62 24 75% cát + 25% đất 10 100% đất thịt 26 Giá thể không nơi tiếp xúc để quen dần với môi trƣờng tự nhiên mà nơi giúp bám rễ, đứng vững, dự trữ nƣớc chất dinh dƣỡng để cung cấp dần cho sau 33 Kết bảng 3.4 cho thấy, loại giá thể khác sử dụng để ƣơm ảnh hƣởng lớn tới tỷ lệ sống khả sinh trƣởng in vitro giai đoạn vƣờn ƣơm.Giá thể cát ẩm cho tỉ lệ sống thấp nhất, cát ẩm thành phần dinh dƣỡng làm rễ in vitro khó thích nghi gây tƣợng úng thối Khi kết hợp cát với đất thịt theo tỉ lệ khác có thay đổi rõ rệt tỉ lệ sống sót Sau tuần với giá thể 25% cát + 75% đất Triệu chuông in vitro đạt tỷ lệ sống cao (76%), sau tuần rèn luyện công thức giá thể cho tỉ lệ sống sót đạt 62%.Sau - ngày, bắt đầu bén rễ thích ứng với điều kiện bên ngồi, hình thành Sự khác biệt này, đất có bổ sung số dƣỡng chất cần thiết cho sinh trƣởng phát triển kết hợp với 25% cát giúp nƣớc giữ ẩm tốt hơn.Ngồi ra, tỷ lệ sống phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ chất lƣợng điều kiện thời tiết (nhiệt độ, ánh sáng) Trên giá thể 100% đất, sau trồng, tƣới nƣớc chăm sóc cây, đất thƣờng bít dí, nƣớc kém,tỉ lệ sống sót thấp (6%) ,cây nhỏ, sinh trƣởng kém, mép cong Nhƣ vậy, giống hoa chuông in vitro trồng ngồi vƣờn ƣơm, có nhu cầu loại giá thể đặc thù, giá thể trồng phải đảm bảo khả nƣớc giữ ẩm Tóm lại: Trong loại giá thể nghiên cứu, giá thể phù hợp để ƣơm hoa Triệu chuông in vitro giá thể 25% cát + 75% đất Bốn loại giá thể lại tỏ khơng phù hợp: tỷ lệ chết cao, sinh trƣởng không đều,việc giai đoạn vƣờn ƣơm không mang lại thành cơng cho quy trình nhân giống in vitro hoa Triệu chng 34 Hình 3.5 Cây hoa Triệu chng giai đoạn rèn luyện Hình 3.6 Triệu chng in vitro hoa tự nhiên 35 Từ thí nghiệm chúng tơi đƣa sơ đồ nhân nhanh hoa Triệu chuông kĩ thuật in vitro: Chồi đỉnh hoa Triệu chuông NaClO 7% / phút Tạo vật liệu khởi đầu invitro BAP 0,3 mg/l tuần Cụm chồi in vitro NAA 0,1 mg/l tuần Tạo rễ in vitro 25% cát ẩm + 75% đất tuần Rèn luyện in vitro thích nghi Hình 3.7 Nhân nhanh hoa Triệu chuông in vitro 36 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Quy trình nhân giống in vitro đƣợc xây dựng:  Công thức khử trùng tạo mẫu hoa Triệu chng sạch, có khả tái sinh chồi tối ƣu xử lí sơ mẫu kết hợp khử trùng NaClO 7% thời gian phút, với tỉ lệ mẫu sống 80%  Mơi trƣờng thích hợp để nhân nhanh chồi : MS + 30g đƣờng + 7g/l agar có bổ sung 0,3 mg/l BAP  Môi trƣờng tạo rễ tốt nhất: MS + 30g đƣờng + 7g/l agar có bổ sung 0,1 mg/l NAA  Cây rèn luyện trồng giá thể 25% cát + 75% đất thích hợp cho giai đoạn vƣờn ƣơm 4.2 Kiến nghị  Tiếp tục nghiên cứu thực sản xuất thực nghiệm hoa Triệu chng quy trình tìm  Thực phƣơng pháp vật lý hóa học để tạo giống hoa đột biến mới, đa dạng màu sắc, kiểu dáng hoa hình thái 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngơ Xn Bình (2010), Ni c y mơ tế bào thực vật s lí luận ứng d ng, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Văn Mã, a Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lí thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2000),Nuôi mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dung, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bảo Tồn (2004),Giáo trình ni c y mơ tế bào thực vật, Tủ sách Đại học Cần Thơ Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm Hoàng Minh Tấn(2010), Sinh lí học thực vật, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Tài liệu tiếng Anh Bhojwani and Razdan9 (1983),Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Volume Fregonezi, J N., et al (2013) "Biogeographical history and diversification of Petunia and Calibrachoa(Solanaceae) in the Neotropical Pampas grassland", Botanical Journal of the Linnean Society 171(1): 140-153 G Fridborg et al (1978), The effect of activated charcoal on tissue cultures: adsorption of metabolites inhibiting morphogenesis Haberlandt, G (1902).“Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen Sitzungsber”, Akad Wiss Wien Math.-Naturwiss Kl., Abt J 111, 69–92 10 Himanen, K., et al (2002) "Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation", Plant Cell 14(10): 2339-2351 11 Murashige, T and F Skoog (1962) "A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco 15(3): 473-497 38 Tissue Cultures", Physiol Plant 12 Murashige T (1974), Plant propagation through tissue culture, Annu Rev Plant Phys, 25, pp 135-166 13 Narayanaswami V, Wang J, Kay CM, Scraba DG, Ryan RO (1996),Disulfide bond engineering to monitor conformational opening of apolipophorin III during lipid binding J Biol Chem271:26855–26862 14 Nhut D.T., J.A Teixeirada silva, and C.R.Aswth (2003), The importance of the explant on regeneration in thin cell layer technology, In vitro cell.Dev Biol Plant, 39, pp 266 – 276 15 Okamoto T., O, Kitani, T Torii (2002), Robotic transplanting of orchid protocorm in mericlone culture, Journal of the Japanese Society of Agricultural Machinery, pp.103-110 16 Olmstead, R G., et al (2008) "A molecular phylogeny of the Solanaceae",TAXON 57 (4) 17 Ortíz-Castro, R., et al (2009) "The role of microbial signals in plant growth and development", Plant Signal Behav 4(8): 701-712 18 RILEY,P S., TATUM, H W & WEAVER, R E (1972),Pseudomonas putrefaciens isolates from clinical specimens Applied Microbiology 24,798800 19 Shigenobu, T & Sakamoto, S (1981), Intergeneric hybridization between Agropyron tsukushiense and Hordeum bulbosum Japanese Journal of Genetics 56, 505-17 20 Stehmann, J., et al (1997) "A New Species and New Combinations in Calibrachoa (Solanaceae)", Novon 7(4): 417-419 Tài iệu từ Internet 21 http://caytrongvatnuoi.com/cay-trong/cac-loai-hoa/nhan-giong-bang-nuoicay-mo-te-bao 22 http://giahuygarden.vn/cay-hoa-trieu-chuong-ban-cong.html 39 23 https://hoadepviet.com/hoa-trieu-chuong 24.http://hoala.vn/product-detail/2663/hoa-million-bells hoa-trieuchuong.html 25 https://plants.usda.gov 40 ... nhân giống in vitro hoa Triệu chng Chính vậy, tơi thực nghiên cứu đề tài: Nhân dòng vơ tính hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để góp phần sản xuất giống. .. HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN - HÀ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY HOA TRIỆU CHNG ( Calibrachoa praviflora ) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI... thuật ni cấy mơ tế bào thực vật q trình điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật cách có định hƣớng, dựa vào phân hóa phản phân hóa tế bào sở tính tồn tế bào thực vật Tính tồn tế bào Haberlandt