Đang tải... (xem toàn văn)
Đây là tài liệu giới thiệu về quy trình sản xuất bột từ lá dâu tằm.
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN NGHIÊN CỨU RAU QUẢ ---------***--------- BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘT LÁ DÂU TẰM CÓ HÀM LƯỢNG DNJ 0,5-1% (Thuộc đề tài: “Nghiên cứu sản xuất một số thực phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường từ lá dâu tằm”) Cơ quan chủ quản : Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Cơ quan chủ trì : Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam Cơ quan thực hiện : Viện Nghiên cứu Rau quả Chủ nhiệm đề tài : TS. Hoàng Thị Lệ Hằng Hà Nội 11/2012 MỤC LỤC 1 DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH I. ĐẶT VẤN ĐỀ 2 Từ xa xưa cây dâu tằm (có tên khoa học Morus alba L.) đã được sử dụng trong các bài thuốc dân gian của Trung Quốc trong việc chữa và ngăn ngừa bệnh tiểu đường (bệnh “Xiaoke”), tuy nhiên chưa có sự đề cập nào về thành phần có tác dụng chữa bệnh trong lá dâu tằm mà hoàn toàn là theo kinh nghiệm truyền thống [33]. Trong những năm gần đây, từ các công trình nghiên cứu chuyên sâu các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ đã công bố về thành phần, dược tính và cơ chế hoạt động của các thành phần chức năng có trong lá dâu tằm, các kết quả nghiên cứu đã cho thấy trong lá dâu chứa một lượng lớn các thành phần dinh dưỡng và các chất có hoạt tính sinh học, nhất là các hoạt chất có khả năng làm giảm lượng đường máu. Đặc biệt trong số đó có hoạt chất 1- Deoxynojirimycin (DNJ) là chất có chức năng chế ngự sự tăng đường máu hỗ trợ điều trị và phòng ngừa bệnh tiểu đường. Cho đến nay, lá dâu tằm là một trong những nguồn thực vật được phát hiện có chứa DNJ khá cao[21]. Trước thực trạng về số lượng người bị mắc bệnh tiểu đường ngày càng gia tăng sự đòi hỏi việc nghiên cứu tìm ra nhiều loại thuốc để điều trị căn bệnh nguy hiểm này cũng đã được đặt ra như là một nhu cầu bức thiết. Hiện nay trên thị trường nước ta có khá nhiều loại thực phẩm chức năng chuyên biệt dùng cho người bị bệnh tiểu đường được tổng hợp và trích ly từ thảo dược như: mướp đắng, cam thảo, nấm Linh chi, hoài sơn, lá dâu…. Tuy nhiên, các sản phẩm này đều được nhập khẩu từ các nước Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ .vv Trong khi đó, nước ta là một nước có truyền thống với nghề trồng dâu nuôi tằm, hơn nữa cây dâu là loại cây rất dễ trồng, dễ nhân giống, có thể thích nghi với các điều kiện khí hậu ở các vùng miền khác nhau nên có thể trồng thành vùng nguyên liệu và trồng khắp nơi. Hiện nay diện tích trồng dâu tằm ở nước ta khoảng gần 20.000 ha với năng suất khá cao khoảng 15-35 tấn/ha với khoảng 165 giống dâu, bao gồm cả dâu địa phương, giống mới lai tạo trong nước và giống nhập nội đang được trồng rộng khắp ở các khu vực trong cả nước[4][16]. Đây thực sự là nguồn nguyên liệu phong phú để thu nhận hợp chất DNJ. Do vậy việc lựa chọn lá dâu làm nguyên liệu trích ly hợp chất 1- Deoxynojirimycin (DNJ) và ứng dụng để sản xuất các thực phẩm chức năng dùng cho người bị bệnh tiểu đường là hoàn toàn khả thi, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, góp phần giảm tỷ lệ sản phẩm nhập khẩu cùng loại đồng thời nâng cao giá trị kinh tế của cây dâu ngoài việc nuôi tằm. Vì vậy, nghiên cứu trích ly, thu nhận hoạt chất 1- Deoxynojirimcyin (DNJ), đặc biệt 3 là xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất bột lá dâu giàu DNJ để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng phòng chống bệnh tiểu đường đang được quan tâm, đặc biệt ở các quốc gia Châu Á, nơi có nguồn thực vật và cây dược liệu phong phú như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc . Từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện quy trình: “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm có chứa hàm lượng hoạt chất chức năng DNJ (1- deoxynojirimycin)”. II. MỤC ĐÍCH Nghiên cứu thiết lập quy trình công nghệ sản xuất bột lá dâu có chứa hàm lượng DNJ để sản xuất thực phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường. III. NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Nguyên vật liệu nghiên cứu 3.1.1. Nguyên liệu: Nguyên liệu được sử dụng là giống dâu Quế ưu đang được trồng phổ biến ở tỉnh Thái Bình được thu hái vào vụ hè (từ 21/4÷30/8), ở độ già thành thục, lá bánh tẻ (lá thứ 5 -12), được làm khô đến độ ẩm 10 ± 1% 3.1.2.Vật liệu 3.1.2.1. Hóa chất Chế phẩm enzim pectinex Ultral SP-L, Ethanol thực phẩm 96% V, DNJ chuẩn, 9- fluorenylmethy chloroformat (FMOC_CL), Glycin- metanol, Axit formic, Axit sulfuric, Chloroform, Diethylether, NH 4 OH, Na 2 SO 4 , Axit axetic, Maltodextrin, đường isomalt, tinh bột biến tính. 3.1.2.2. Thiết bị Bình hút ẩm , Cân điện tử Presisa 62A, Thụy Điển, Cân kỹ thuật Ohaus CT 1200, Mỹ, Cốc, bình trích ly thuỷ tinh các loại , Giấy lọc, Bình trích ly, Máy cô chân không Buchi, Đức, Máy đo màu Minolta, Máy đo hàm ẩm, Bể ổn nhiệt, Máy HPLC- FL, cột ODS-3, Máy sấy phun mini BUCHI – 91, Túi thiếc, túi PE, Máy dán túi . 3.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xác định phương pháp chiết tách thích hợp nhằm thu được hàm lượng DNJ cao. 4 - Nghiên cứu xác định phương pháp thu nhận cao lá dâu tằm có hàm lượng DNJ cao. - Nghiên cứu phương pháp thu nhận bột lá dâu tằm. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Phương pháp phân tích 3.3.1.1 Phương pháp vật lý - Xác định màu sắc của nguyên liệu và sản phẩm trong quá trình nghiên cứu bằng máy đo màu MINOTA. - Xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng refactometer (trích ly quang kế) theo TCVN 5610-1991. - Xác định độ ẩm theo TCVN 5613-1991 3.3.1.2 Phương pháp hoá học - Phương pháp định lượng alkaloid toàn phần trong thực vật: Cân chính xác khoảng 10g bột nguyên liệu, thêm 100ml dung dịch axit sulfuric 2%, để yên 10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Để trong 16 - 18 giờ ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy 50 ml dịch lọc (tương đương 5g bột nguyên liệu). Kiềm hóa dịch lọc bằng NH 4 OH đậm đặc đến pH = 10. Chuyển dịch lọc vào phiễu trích ly. Lắc dịch lọc với hỗn hợp chloroform:diethylether (2:1): 20ml x 3 lần (đến khi dịch trích ly hết màu). Tập hợp dịch chiết chloroform - diethylether, thêm Na 2 SO 4 khan để loại nước. Gạn dịch trích ly sang cốc khô đã cân trọng lượng. Bốc hơi dung môi trên cách thủy đến khô. Để cốc trong bình hút ẩm 30 phút và cân nhanh khối lượng của cốc cùng cắn. Tính hàm lượng alkaloid TS trong dịch trích ly theo công thức sau: X% = A x 100 M Trong đó: X- Là hàm lượng alkaloid TS trong nguyên liệu (%) A- Là khối lượng alkaloid TS cân được (g) M- Là khối lượng bột nguyên liệu dùng để định lượng (g) Định lượng alkaloid toàn phần trong bột thành phẩm: Cân chính xác khoảng 1g bột thành phẩm, hòa tan trong 40 ml dung dịch axit sulfuric 2%. Lọc lấy 20ml dung dịch (tương ứng với 0,5 g bột). 5 Các bước tiếp theo và cách tính tương tự như đối với định lượng alkaloid toàn phần trong bột nguyên liệu. Tính hiệu suất thu hồi alkaloid bột thành phẩm HS thu hồi alkaloid (%) = Lượng alkaloid toàn phần trong bột thành phẩm (g) x 100 Lượng alkaloid toàn phần trong bột nguyên liệu (g) - Phương pháp xác định hàm lượng DNJ bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 5.3, Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. + Điều kiện sắc ký: Điều chỉnh nếu cần thiết - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích - Cột: Luna C18 (2) 250 nm x 4,6mm, 5µm (cột tương tự) - Pha động: o Pha động A: Dung dịch acid formic 0,2% trong methanol o Pha động B: Dung dịch acid formic 0,2% trong nước o Chương trình dung môi gradient o Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút o Nhiệt độ buồng cột: 35 o C o Detector huỳnh quang: E x = 254nm, E m = 322 nm o Thể tích tiêm mẫu 10 µl Thời gian (phút) A (%, tt/tt) B (%, tt/tt) Kiểu rửa giải 0 – 40 40 60 Đẳng dòng + Chuẩn bị mẫu Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 20 mg của bột chế phẩm, thêm 10 ml chlorhydric 0,05N, siêu âm 30 phút, ly tâm ở tốc độ 15000 rpm trong 10 phút, gạn lấy dịch trong phía trên. Cắn còn lại được chiết thêm như trên 3 lần nữa. Gộp dịch chiết vào bình định mức 50,0 ml. Thêm nước vừa đủ tới vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị dung dịch DNJ chuẩn trong acid chlorhydric 0.05N có nồng độ chính xác khoảng 2 µg/mL. Phản ứng tạo mầu dẫn xuất đo huỳnh quang với thuốc thử 9-fluorenylmethyl chloroformat (FMOC-Cl) trên đầu cột theo cơ chế phản ứng như sơ đồ sau. 6 Phản ứng FMOC: Lấy 10 µl mẫu sau khi đã được pha loãng và thêm vào 10 µl của dung dịch đệm kali borat 0,4 M (pH 8,5) và 20 µl của dung dịch FMOC-CL 5mM, giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Thêm vào 10 µl của dung dịch glycine 0,1 M để dừng phản ứng và pha loãng bằng cách thêm 950 µl dung dịch axit axetic 0,1%. Tiêm sắc ký Hàm lượng % DNJ trong mẫu thử được tính theo công thức: % GABA = At x Cc x 50 x100 Ac x Mt Trong đó: At: Độ hấp thụ huỳnh quang của mẫu thử Ac: Độ hấp thụ huỳnh quang của mẫu chuẩn Cc: Nồng độ mẫu chuẩn (mg/ml) Mt: Khối lượng mẫu thử đã trừ ẩm (mg) HS thu hồi DNJ (%) = Lượng DNJ trong bột thành phẩm (g) x 100 Lượng DNJ trong nguyên liệu ban đầu (g) 3.3.1.3. Phương pháp vi sinh - Xác định tổng số nấm men, nấm mốc có trong sản phẩm trong quá trình bảo quản theo TCVN 4993-89 * Nguyên tắc: Môi trường dinh dưỡng phải chứa chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Cấy lên bề mặt thạch của môt trường Yeast Glucose Chloramphenicol một lượng mẫu đã được pha loãng nhất định và nuôi ở nhiệt độ 25 ± 1˚C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 48-72 giờ. Đếm tất cả số khuẩn lac mọc trên đó từ đó suy ra lượng nấm men và nấm mốc có trong mẫu phân tích. 7 * Cách tiến hành: - Pha loãng thập phân mẫu phân tích đến nồng độ thích hợp để dễ dàng cho việc đếm khuẩn lạc ( mỗi đĩa chỉ nên có 15-300 khuẩn lạc). Thời gian thao tác không quá 30 phút. - Lấy 0,05 ml (hay 1 giọt mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri. Mỗi độ pha loãng nên làm đồng thời 2-3 hộp và nên làm 2 cấp pha loãng liên tiếp nhau) đã chứa môi trường thạch dinh dưỡng, trang đều trên mặt thạch. - Lật ngược đĩa, đặt vào tủ ấm nhiệt độ 25 ± 1˚C trong thời gian 48-72 giờ. *Kết quả: Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa có số lượng nằm trong khoảng 15-300. Nếu ngay ở đĩa cấy mẫu nguyên chất mà có số lượng ít hơn 15 khuẩn lạc thì vẫn lấy kết quả đó (Trần Văn Tài, 2000). Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu được tính theo công thức: N = Trong đó: N: số khuẩn lạc/g hay số khuẩn lạc trên ml. ∑C: Tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n 1 : Số đĩa đếm được ở nồng độ pha loãng thứ nhất n 2 : Số đĩa đếm được ở nồng độ pha loãng thứ hai d: Độ pha loãng cho số đếm thứ nhất 3.3.2. Phương pháp thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu - Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp yếu tố ngẫu nhiên hoàn toàn - Kiểm tra giả thiết thống kê theo ANOVA 3.3.3. Phương pháp toán học các thực nghiệm trong nghiên cứu tìm tối ưu Tối ưu hoá quá trình trích ly đối với lá dâu mà cụ thể là xác định các giá trị tối ưu của các biến số nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Bằng ngôn ngữ, tối ưu hoá quá trình là tìm giá trị của các yếu tố X i để tại đó quá trình trích ly đạt hiệu suất cao nhất (tức là hàm lượng DNJ được trích ly tách lớn nhất), nghĩa là các hàm mục tiêu Y i đạt cực trị. 8 Để đạt được mục đích nghiên cứu chúng tôi chọn ma trận DOEHLERT. Ma trận này cho phép tìm được vùng tối ưu trong khoảng giới hạn đã chọn. Ma trận cho phép phân chia rất cân đối các điểm thí nghiệm trong giới hạn theo bất kỳ hướng nào. Dựa vào ma trận, ta có thể thêm các biến số khác nữa mà không làm mất đi tính đúng đắn của ma trận. Trong ma trận này, số lần thí nghiệm N và các biến số K được xác định như sau: N= K 2 + K+1. Trong trường hợp K= 3 thì số điểm thí nghiệm cần thực hiện là N=13. Với 3 yếu tố ảnh hưởng, ma trận được xác định như hình sau: Tất cả các điểm đã chọn được xác định theo phương trình hồi quy có dạng sau: Y= b 0 + b 1 X 1 + b 2 X 2 + b 3 X 3 + b 11 X 1 2 + b 22 X 2 2 + b 33 X 3 2 + b 12 X 1 X 2 + b 13 X 1 X 3 + b 23 X 2 X 3 . Trong đó : Y- Hàm mục tiêu ( hay các đại lượng cần xác định) b - Các hệ số hồi quy X- Các biến số. Quá trình tính toán và kết quả được xử lý bằng máy tính theo chương trình NEMROD- New Efficient Methodology For Research Using Optimal Design. 3.3.4. Bố trí thí nghiệm Hoạt động 1: Nghiên cứu xác định phương pháp chiết tách thích hợp nhằm thu được hàm lượng DNJ cao. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu phương pháp xử lý nguyên liệu trước khi trích ly thu nhận DNJ * Phương pháp: Lá dâu khô xay nhỏ, được chia thành các mẫu có khối lượng như nhau 100gr. Các thí nghiệm đều được xử lý ở các nồng độ enzim từ 0 – 0,3%, nhiệt độ xử lý 9 45 0 C (đây là nhiệt độ tối ưu nhất cho ezim hoạt động) và thời gian xử lý 1,5 giờ. Các mẫu thí nghiệm sau khi xử lý enzim ở các nồng độ khác nhau sẽ tiến hành trích ly bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi là nước. * Chỉ tiêu kiểm tra: Trên cơ sở xác định hàm lượng alkaloid, DNJ thu được trong dung dịch trích ly ở tất cả các mẫu. Từ đó so sánh được hiệu quả khi sử dụng chế phẩm enzim pectinex ULTral SP-L so với đối chứng, theo đó xác định được các thông số kỹ thuật khi sử dụng chế phẩm enzim nhằm tăng hiệu suất trích ly. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu phương pháp trích ly thích hợp * Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ sau khi xử lý enzim ở các điều kiện thích hợp (có được từ thí nghiệm 1) được tiếp tục khảo sát hiệu quả trích ly bằng 3 phương pháp phổ biến thường áp dụng với dược liệu tương ứng với 3 công thức thí nghiệm: CT1: Trích ly bằng phương pháp ngâm trong dung môi CT2: Trích ly bằng phương pháp ngấm kiệt bằng dung môi CT3: Trích ly bằng phương pháp trích ly Soxhlet Các mẫu có khối lượng như nhau và bằng 100gr, dung môi được sử dụng là cồn 90 0 C ở điều kiện nhiệt độ thường (29 ±1 0 C) * Các chỉ tiêu kiểm tra: Hàm lượng alkaloid, DNJ trong dịch chiết (% )và hiệu suất trích ly. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu lựa chọn loại và nồng độ dung môi trích ly thích hợp. * Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ được chia thành các mẫu có khối lượng như nhau (m=100gr) rồi tiến hành trích ly bằng phương pháp thích hợp (là kết quả của thí nghiệm 2) trong cùng các điều kiện (thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi/nước chiết) với các loại dung môi có các nồng độ khác nhau: - Loại dung môi: Sử dụng 02 loại dung môi là ethanol trung tính, ethanol đã axit hóa (là các dung môi thường được sử dụng trong quá trình chiết tách các dược liệu) - Nồng độ dung môi (đối với dung môi ethanol trung tính và ethanol đã axit hóa): 30%V- 90%V. * Chỉ tiêu kiểm tra: Hàm lượng alkaloid, DNJ có trong dịch chiết ở các mẫu. Từ đó xác định được loại dung môi cũng như nồng độ dung môi thích hợp nhất. 10 . VIỆN NGHIÊN CỨU RAU QUẢ -- -- - -- - -* * *-- -- - -- - - BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘT LÁ DÂU TẰM CÓ HÀM LƯỢNG DNJ 0, 5-1 % (Thuộc đề tài: “Nghiên. khảo sát khác nhau (5 0-6 0-7 0-8 0-9 0 0 C) cho đến khi dịch chiết đạt đến các hàm lượng chất khô hòa tan 1 3-1 4 0 Bx, 1 9-2 0 0 Bx, 2 5-2 6 0 Bx. * Các chỉ tiêu
