BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA CÁC GỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC Giáo viên hướng dẫn: PGS – TS Nguyễn Ngọc Hải Họ tên sinh viên: Trương Hương Thảo Lớp: DH04DY Niên khóa: 2004 – 2009 Tháng 9/2009 PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA CÁC GỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC Tác giả TRƯƠNG HƯƠNG THẢO Khóa luận đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn: PGS – TS NGUYỄN NGỌC HẢI Tháng 9/2009 i LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin kính gửi lời cảm ơn Thầy Nguyễn Ngọc Hải hướng dẫn cho em hoàn thành luận văn với tất tinh thần, trách nhiệm lòng nhiệt thành Em xin chân thành cảm ơn quý thầy Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Ni Thú Y Trường Đại Học Nơng Lâm tận tình giúp đỡ truyền đạt kiến thức quý giá cho em suốt trình học tập trường Xin cảm ơn tất bạn bè luôn bên cạnh giúp đỡ đóng góp ý kiến cho tơi q trình học tập, sống thực đề tài Và hết, xin kính gửi đến Bố Mẹ lời biết ơn chân thành sâu sắc có ngày hơm nay, tất nhờ vào hi sinh cao vất vả Bố Mẹ Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn đến tất người với lòng tri ân sâu sắc Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2009 Trương Hương Thảo ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Qua thời gian thực đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất khảo sát khả kháng aflatoxin gốc phân lập được” từ tháng 2/2008 đến tháng 8/2009 Phòng thực hành Vi Sinh khoa Chăn Nuôi – Thú Y, thu kết sau: - Đánh giá sơ khả ức chế aflatoxin gốc Bacillus subtilis phân lập từ đất: sau ngày nuôi cấy chung Bacillus subtilis Aspergillus flavus môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên ánh đèn UV cho thấy số gốc có khả ức chế sản sinh aflatoxin sinh trưởng nấm mốc Aspergillus flavus - Khảo sát khả ức chế aflatoxin gốc vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất môi trường bắp: kết cho thấy số gốc vi khuẩn có khả làm giảm aflatoxin môi trường bắp - Thử nghiệm tác động aflatoxin lên phát triển Bacillus subtilis: sau ngày nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis mơi trường TSB có bổ sung aflatoxin theo nồng độ khác nhau, ống môi trường gửi phân tích hàm lượng aflatoxin Kết hàm lượng aflatoxin ống TSB có ni cấy vi khuẩn giảm so với hàm lượng aflatoxin ống TSB không nuôi cấy vi khuẩn Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy mơi trường khơng có aflatoxin phát triển tốt mơi trường có aflatoxin Kết cho thấy aflatoxin ức chế phát triển Bacillus subtilis vi khuẩn Bacillus subtilis làm giảm aflatoxin theo phương thức phá huỷ aflatoxin iii MỤC LỤC Trang tựa i Lời cám ơn ii Tóm tắt luận văn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục biểu đồ ix Danh mục hình x Danh mục sơ đồ xi CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 1.3 YÊU CẦU ĐỀ TÀI CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.4 Đặc điểm sinh hóa 2.1.5 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên .5 2.1.6 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .5 2.1.7 Tính chất đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 2.1.8 Tình hình nghiên cứu nước tác dụng đối kháng với Aspergillus Bacillus subtilis .10 iv 2.2 SƠ LƯỢC VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN 12 2.2.1 Khái niệm nấm mốc độc tố nấm mốc 12 2.2.2 Độc tố aflatoxin 13 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 24 3.1.1 Thời gian 24 3.1.2 Địa điểm 24 3.2 NỘI DUNG ĐỀ TÀI 24 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 24 3.3.1 Đối tượng khảo sát 24 3.3.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 25 3.3.3 Môi trường nuôi cấy .25 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 26 3.4.2 Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả sinh aflatoxin chủng nấm mốc Aspergillus flavus đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin gốc Bacillus subtilis phân lập 30 3.4.3 Thí nghiệm 2: Kiểm tra khả làm giảm aflatoxin môi trường bắp gốc vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập 31 3.4.4 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm tác động aflatoxin lên phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học Bacillus subtilis 37 4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis 37 4.1.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis 37 4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis…………… 38 v 4.2 Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả sinh aflatoxin chủng nấm mốc Aspergillus flavus đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin gốc Bacillus subtilis phân lập 39 4.2.1 Kiểm tra khả sinh aflatoxin chủng nấm mốc Aspergillus flavus……………… 39 4.2.2 Thí nghiệm đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin gốc Bacillus subtilis phân lập 40 4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả làm giảm aflatoxin sản sinh môi trường bắp gốc Bacillus subtilis phân lập .42 4.4 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm tác động aflatoxin lên phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .50 5.1 KẾT LUẬN 50 5.2 ĐỀ NGHỊ .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC .54 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Nguyên chữ AND Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic CFU Colony Forming Units ctv cộng tác viên CYA Czapek Yeast Extract Agar LD50 Lethal dose Liều gây chết 50% tổng đàn ppb part per billion Phần tỷ (μg/kg) TSA Trypticase Soya Agar TSB Trypticase Soya Broth UV Ultra violet Nghĩa Đơn vị hình thành khuẩn lạc Tia cực tím vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2-1: Sự khác tế bào dinh dưỡng bào tử Bacillus subtilis Bảng 2-2: Một số lồi nấm mốc có khả sản sinh aflatoxin .14 Bảng 2-3: Ảnh hưởng độ pH lên hàm lượng aflatoxin (μg/150ml) thí nghiệm A Ciegler ctv (1966) 15 Bảng 2-4: Liều gây ngộ độc cấp tính qua miệng aflatoxin B1 LD50 20 Bảng 3-1: Bố trí thí nghiệm 35 Bảng 4-1: Kết phân tích hàm lượng aflatoxin thí nghiệm .43 Bảng 4-2: Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis thí nghiệm (log10) 45 Bảng 4-3: Số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis thí nghiệm (log10) .45 Bảng 4-4: Kết phân tích nồng độ aflatoxin thí nghiệm 47 Bảng 5-1: Kết phân lập Bacillus subtilis từ đất 50 viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis thí nghiệm 46 Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus subtilis lên hàm lượng aflatoxin 48 ix Thuốc nhuộm 4.1 Crystal violet ( C25H30N3Cl.9H2O = 570,11 ) a) Crystal violet 0,4g Cồn 96o 10ml b) Phenol 1g Nước cất 100ml Trộn dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho hoà tan đem lọc Bảo quản dung dịch thuốc nhuộm chai màu, tránh ánh sáng 4.2 Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300 ml Hồ 2g KI vào 5ml nước cất, sau thêm 1g iod, chờ cho iod tan hết thêm nước vừa đủ 300ml 4.3 Fuchsine kiềm loãng ( C9H18N3Cl = 323,82 ) a) Fuchsine kiềm Cồn 96o b) Phenol Nước cất 0,3g 10ml 5g 35ml Trộn dung dịch a b với khuấy cho tan đều, đem lọc, bảo quản chai màu 59 Phương pháp nhuộm Gram Các bước tiến hành - Chuẩn bị vết bơi: cho lên lame kính giọt nước cất vơ trùng, dùng que cấy vòng vơ trùng lấy vi khuẩn mọc bề mặt mơi trường hòa vào giọt nước cất dàn - Cố định vết bơi: hơ lame kính cách đưa qua lại – lần lửa đèn cồn - Nhuộm tiêu bản: đặt giấy lọc lên vết bôi, nhỏ thuốc nhuộm crystal violet lên miếng giấy lọc cho đủ thấm xuống vết bôi, để – phút rửa nước Nhỏ dung dịch lugol lên vết bôi vừa nhuộm, để phút rửa nước Tẩy màu nhanh cồn 96o, khoảng 15 – 30 giây, rửa nước Đặt mảnh giấy lọc khác lên vết bôi nhỏ thuốc nhuộm fuchsin kiềm loãng lên miếng giấy lọc cho đủ thấm xuống vết bôi, để khoảng phút rửa nước Thấm khô tiêu xem kính hiển vi Cơng thức 6.1 - Công thức đếm khuẩn lạc môi trường thạch đĩa Số khuẩn lạc trung bình 1ml dịch mẫu độ pha lỗng liên tiếp Cơng thức: Y = X1 + X + X 3 Trong Y: số khuẩn lạc trung bình độ pha loãng X1 , X2, X3 : số khuẩn lạc trung bình có 1g mẫu hay 1ml dịch mẫu nồng độ pha loãng - Số khuẩn lạc 1ml dịch mẫu độ pha lỗng 60 Cơng thức: X = A × 1 × h V Trong : X: số khuẩn lạc có 1ml dịch mẫu A: số khuẩn lạc trung bình có đĩa (trong tổng đĩa nồng độ pha loãng) h: độ pha loãng ( 10-5, 10-6, 10-7…) V: thể tích dịch mẫu cấy đĩa 6.2 Cơng thức đếm vi khuẩn buồng đếm Công thức: A vsv/ml = a x 4000 x 1000 x H Trong đó: a: số vi sinh vật trung bình có ô nhỏ = ∑a n a1: số vi sinh vật đếm ô nhỏ n : số ô nhỏ đếm H: hệ số pha loãng = Độ pha loãng 1000: hệ số chuyển thành ml (1ml = 1000mm3) 4000: hệ số chuyển thành 1mm3 = V ô nhỏ Các phản ứng sinh hóa 7.1 Phản ứng catalase Chuẩn bị Dung dịch H2O2 30% Lame 61 = 4000mm3 Giống vi khuẩn Baccillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vòng, thao tác vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn Baccillus subtilis phết lên lame kính khơ Sau nhỏ giọt H2O2 30% lên vết phết vi khuẩn Đọc kết sau khoảng 15 giây Kết Phản ứng catalase dương tính: có tượng sủi bọt Phản ứng catalase âm tính : khơng có tượng sủi bọt 7.2 Phản ứng lecithinase Chuẩn bị Mơi trường lòng đỏ trứng Giống vi khuẩn Baccillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vòng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn cấy lên đĩa mơi trường lòng đỏ trứng, ủ đĩa 370C/24 Kết Phản ứng lecithinase dương tính: khuẩn lạc mọc ăn sâu vào thạch Phản ứng lecithinase âm tính : khuẩn lạc mọc bề mặt thạch 7.3 Phản ứng nitrate Chuẩn bị Môi trường nitrate Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B Giống vi khuẩn Baccillus subtilis Tiến hành: Vô trùng que cấy thẳng, lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống nghiệm môi trường nitrate, ủ 370C/24 Sau 24 nhỏ vào môi trường – giọt Giess A, sau nhỏ tiếp – giọt Giess B 62 Kết Phản ứng dương tính: mơi trường có màu đỏ cam Phản ứng âm tính: mơi trường có màu vàng 7.4 Phản ứng Voges – Proskauer ( VP ) Chuẩn bị Môi trường Clark Lubs Thuốc thử: NaOH 40%, α – naphtol 10% Giống vi khuẩn Baccillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vòng, thao tác vơ trùng, lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống môi trường Clark Lubs, ủ 370C/24 Sau nhỏ – giọt NaOH 40% – giọt α – naphtol 10%, đọc kết sau 15 phút Kết Phản ứng dương tính: mơi trường có màu đỏ Phản ứng âm tính: mơi trường có màu vàng 7.5 Phản ứng citrate Chuẩn bị Môi trường Simmon citrate Giống vi khuẩn Baccillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vòng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống môi trường citrate, ủ 370C/24 Kết Phản ứng dương tính: mơi trường chuyển sang màu xanh dương Phản ứng âm tính: mơi trường có màu xanh mạ non 63 7.6 Phản ứng len men đường maltose Chuẩn bị Môi trường đường maltose Giống vi khuẩn Baccillus subtilis Tiến hành: dùng que vòng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường đường maltose, ủ 370C/24 Kết Phản ứng dương tính: mơi trường có màu vàng Phản ứng âm tính: mơi trường có màu đỏ Chi tiết số liệu 8.1 Số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis đếm phương pháp trang đĩa thí nghiệm Gốc vi khuẩn Số lượng bào tử (CFU/ml) 1,03x1011 9,72x1010 12 3,6x1011 16 4,5x1010 24 1,31x1010 64 8.2 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin thí nghiệm Hàm lượng aflatoxin (ppb) Ký hiệu mẫu Lần Lần 807 360 Gốc Bacillu subtilis + Aspergillus flavus 375 74 Gốc Bacillus subtilis + Aspergillus flavus 93 63 Gốc Bacillus subtilis 12 + Aspergillus flavus 297 75 Gốc Bacillus subtilis 16 + Aspergillus flavus 60 42 Gốc Bacillus subtilis 24 + Aspergillus flavus 254 50 Đối chứng: Aspergillus flavus 8.3 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin thí nghiệm Nồng độ aflatoxin Nồng độ aflatoxin môi trường TBS sau ngày nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis (ppb) ban đầu (ppb) 100 Lần Lần Lần 200 12 400 12 600 13 800 16 8.4 Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis thí nghiệm (CFU/ml) Ghi chú: Số lượng vi khuẩn Số lượng bào tử vi khuẩn 65 66 Ngày (ppb) Nồng độ aflatoxin 9,47x108 1,05x10 10 6,17x108 14,6x10 10 3,25x108 35,5x10 10 2,55x108 6,54x10 11 1,36x108 25,5x10 12 5,75x107 52,5x1012 3,67x107 8,39x1012 2,27x10 1,05x10 11 5,76x108 3,33x10 10 3,33x108 6,65x10 10 2,34x108 9,76x10 10 1,68x108 1,34x10 11 1,07x108 5,05x10 12 5,65x107 14,5x10 12 2,03x107 5,6x1012 2,27x10 1,05x10 11 100 400 8,95x107 9,15x10 5,82x107 4,92x10 10 4,48x107 2,23x10 11 1,06x107 10,5x10 11 7,55x106 5,9x10 11 2,27x10 4,8x108 9,63x10 2,3x108 2,1x10 5,6x10 1,15x108 1,45x1010 7,1x10 7,25x10 9,17x10 7,75x107 6,8x10 11 18,5x10 1,22x107 27x10 7,8x10 11 1,05x10 11 1,05x10 11 200 2,27x10 1,05x10 11 800 7,3x107 1,43x10 6,95x107 4,85x108 5,83x107 6,95x108 2,7x107 4,78x109 1,65x107 8,03x10 10 9,79x106 2,61x10 11 5,65x106 5,2x107 1,38x10 4,05x107 1,72x10 2,55x107 4,45x10 1,35x107 1,33x10 9,65x106 6,65x10 10 5,42x106 2,56x10 11 3,37x10 1,84x10 11 1,23x10 11 2,27x10 1,05x10 11 600 67 Ngày (ppb) Nồng độ aflatoxin 1,25x109 5,45x10 10 6,94x108 6,9x10 10 2,55x108 21,03x10 11 9,55x107 10,37x10 12 3,5x107 13,95x10 12 3,79x107 6,55x1012 4,82x107 5,63x10 11 4,7x108 4,64x10 10 2,16x108 8,45x10 10 8,38x107 9,25x10 11 7,5x107 1,6x10 12 1,6x107 5,7x10 12 2,79x107 4,35x10 12 4,82x107 5,63x10 11 100 2,95x108 5,94x10 1,14x108 1,85x10 10 6,1x107 6,67x10 11 4,65x107 10,9x10 11 9,85x107 4,95x10 12 1,59x107 3,34x10 12 4,82x107 5,63x10 11 200 1,9x108 4,67x10 7,57x107 6,53x10 3,16x107 5,15x10 11 1,29x107 9,82x10 11 8,65x106 3,14x10 12 1,04x107 1,8x10 12 4,82x107 5,63x10 11 400 8,53x107 3,05x10 1,55x107 3,75x10 1,4x107 1,75x10 11 9,97x106 5,73x10 11 5,91x106 1,3x10 12 9,11x106 1,49x10 12 4,82x107 5,63x10 11 600 2,34x106 2,54x10 2,1x106 4,64x10 1,05x106 7,75x10 3,13x105 1,52x10 10 2,5x1066 6,6x10 10 4,5x106 6,7x10 11 4,82x107 5,63x10 11 800 68 Ngày (ppb) Nồng độ aflatoxin 11,3x107 3,2x109 8,48x107 8,6x109 5,45x107 7,5x10 10 3,58x107 20,53x10 11 8,13x105 21,13x10 11 2,2x106 6,68x1011 6,82x106 9x10 10 3,44x106 3,75x108 2,93x106 5,75x109 5,48x106 1,42x10 10 9,78x105 3,82x10 11 4,5x105 12,65x10 11 5,75x105 3,3x10 11 6,82x106 9x10 10 100 5,03x106 1,53x108 4,5x106 3,46x109 2,73x106 9,83x109 7,3x105 1,25x10 11 3,6x105 3,53x10 11 4,85x105 27,5x10 10 6,82x106 9x10 10 200 2,31x106 8,65x107 2,28x106 1,4x108 1,43x106 5,43x108 641x105 9,33x10 10 3,33x105 24,5x10 10 4,24x105 2,2x10 11 6,82x106 9x10 10 400 1,73x106 5,25x107 9,78x105 9,53x107 9,4x105 2,4x108 5,1x105 7,23x109 2,6x105 18,1x10 10 3,75x105 19,7x10 10 6,82x106 9x10 10 600 4,49x105 4,25x107 3,9x105 7,56x107 1,9x105 1,73x108 1,15x105 4,57x109 2,05x105 8,98x10 10 3,1x105 16,95x10 10 6,82x106 9x10 10 800 XỬ LÝ THỐNG KÊ Kết xử lý thống kê thí nghiệm One-way ANOVA: aflatoxin versus Gốc vk Source Gốc vk Error Total S = 180.0 DF SS MS F P 372922 74584 2.30 0.170 194327 32388 11 567249 Level 12 16 24 Đối chứng R-Sq = 65.74% N 2 2 2 Mean 229.5 78.0 186.0 51.0 152.0 583.5 StDev 219.9 21.2 157.0 12.7 144.2 316.1 R-Sq(adj) = 37.19% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * -) ( * -) ( -* ) ( * -) ( -* -) ( -* ) -+ -+ -+ -+ 300 600 900 Pooled StDev = 180.0 Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Gốc vk Individual confidence level = 99.27% Gốc vk = subtracted from: Gốc vk Lower Center Upper + -+ -+ -+9 -867.9 -151.5 564.9 ( -* -) 12 -759.9 -43.5 672.9 ( -* ) 16 -894.9 -178.5 537.9 ( -* ) 24 -793.9 -77.5 638.9 ( -* -) Đối chứng -362.4 354.0 1070.4 ( -* -) + -+ -+ -+-700 700 1400 Gốc vk = subtracted from: Gốc vk Lower Center Upper + -+ -+ -+12 -608.4 108.0 824.4 ( * -) 16 -743.4 -27.0 689.4 ( * -) 24 -642.4 74.0 790.4 ( -* -) Đối chứng -210.9 505.5 1221.9 ( -* -) + -+ -+ -+-700 700 1400 Gốc vk = 12 subtracted from: 69 Gốc vk Lower Center Upper + -+ -+ -+16 -851.4 -135.0 581.4 ( -* -) 24 -750.4 -34.0 682.4 ( * -) Đối chứng -318.9 397.5 1113.9 ( * -) + -+ -+ -+-700 700 1400 Gốc vk = 16 subtracted from: Gốc vk Lower Center Upper + -+ -+ -+24 -615.4 101.0 817.4 ( -* ) Đối chứng -183.9 532.5 1248.9 ( * -) + -+ -+ -+-700 700 1400 Gốc vk = 24 subtracted from: Gốc vk Lower Center Upper + -+ -+ -+Đối chứng -284.9 431.5 1147.9 ( -* -) + -+ -+ -+-700 700 1400 Kết xử lý thống kê thí nghiệm Two-way ANOVA: logslbt versus day, nồng độ a Source day nồng độ a Interaction Error Total DF 35 96 143 S = 0.9250 R-Sq = 45.47% day nồng độ a Mean 6.95762 6.63550 6.60955 6.82749 7.22430 7.38375 7.63160 7.82108 Mean 7.92079 7.41111 7.24951 7.04249 6.82856 6.36570 SS 25.898 33.626 8.970 82.136 150.630 MS 3.69970 6.72520 0.25629 0.85559 F 4.32 7.86 0.30 P 0.000 0.000 1.000 R-Sq(adj) = 18.78% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+-( * ) ( -* ) ( * ) ( * ) ( * -) ( * ) ( * ) ( * -) -+ -+ -+ -+-6.60 7.20 7.80 8.40 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* -) ( * -) ( -* -) ( -* ) ( -* -) ( -* -) + -+ -+ -+ 6.00 6.60 7.20 7.80 70 Two-way ANOVA: logslvk versus day, nồng độ a Source day nồng độ a Interaction Error Total DF 35 96 143 S = 0.8198 R-Sq = 80.56% day nồng độ a Mean 11.2419 11.9206 12.0885 11.5383 10.4850 9.6209 9.2891 8.9325 Mean 11.5730 11.2314 10.8009 10.5104 10.0688 9.6532 SS 192.788 61.509 13.014 64.512 331.823 MS 27.5412 12.3017 0.3718 0.6720 F 40.98 18.31 0.55 P 0.000 0.000 0.975 R-Sq(adj) = 71.04% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * -) ( -* -) ( -* -) ( * -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ -9.0 10.0 11.0 12.0 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+-( -* ) ( -* ) ( -* ) ( * ) ( * ) ( * ) -+ -+ -+ -+-9.80 10.50 11.20 11.90 Descriptive Statistics: logslvk Variable logslvk day N 18 18 18 18 18 18 18 18 N* 0 0 0 0 Variable logslvk day Maximum 11.750 12.924 13.720 13.406 12.323 11.550 11.163 10.628 Mean 11.242 11.921 12.088 11.538 10.485 9.621 9.289 8.933 SE Mean 0.0874 0.144 0.192 0.245 0.301 0.272 0.271 0.302 StDev 0.371 0.609 0.815 1.038 1.279 1.152 1.149 1.283 71 Minimum 10.954 11.090 10.820 9.660 8.238 7.879 7.628 6.767 Q1 10.954 11.330 11.403 10.884 9.541 8.621 8.223 8.082 Median 11.021 11.825 12.108 11.670 10.784 9.787 9.495 9.259 Q3 11.750 12.552 12.710 12.231 11.738 10.844 10.288 9.993 Descriptive Statistics: logslvk Variable logslvk Variable logslvk nồng độ a N 24 24 24 24 24 24 nồng độ a Maximum 13.720 13.161 12.695 12.498 12.173 11.826 N* 0 0 0 Mean 11.573 11.231 10.801 10.510 10.069 9.653 SE Mean 0.257 0.254 0.270 0.299 0.319 0.308 StDev 1.259 1.244 1.322 1.466 1.563 1.511 Minimum 9.146 8.362 7.909 7.076 6.773 6.767 Q1 10.762 10.576 9.986 9.689 8.725 8.264 Median 11.650 11.074 10.992 10.962 10.382 9.775 Q3 12.693 12.179 11.830 11.741 11.287 11.004 Descriptive Statistics: logslbt Variable logslbt day N 18 18 18 18 18 18 18 18 N* 0 0 0 0 Variable logslbt day Maximum 7.683 7.579 7.760 8.134 8.407 8.841 9.097 9.526 Mean 6.958 6.635 6.610 6.827 7.224 7.384 7.632 7.821 SE Mean 0.133 0.171 0.199 0.283 0.219 0.248 0.249 0.264 StDev 0.565 0.726 0.844 1.200 0.929 1.051 1.055 1.122 Minimum 6.356 5.477 5.312 4.699 5.279 5.591 5.694 5.724 Q1 6.356 5.741 5.629 5.771 6.366 6.349 6.453 6.614 Median 6.834 6.815 6.854 7.164 7.465 7.822 7.992 8.149 Q3 7.683 7.228 7.277 7.879 7.937 8.301 8.483 8.701 Descriptive Statistics: logslbt Variable logslbt Variable logslbt nồng độ a N 24 24 24 24 24 24 nồng độ a Maximum 9.526 8.775 8.681 8.550 7.975 7.716 N* 0 0 0 Mean 7.921 7.411 7.250 7.042 6.829 6.366 SE Mean 0.185 0.200 0.200 0.199 0.178 0.163 StDev 0.904 0.978 0.980 0.976 0.872 0.801 72 Minimum 5.910 5.653 5.556 4.699 4.699 5.061 Q1 7.556 6.566 6.447 6.359 6.250 5.617 Median 7.954 7.564 7.348 7.021 6.975 6.384 Q3 8.567 8.306 8.038 7.851 7.620 6.944 Descriptive Statistics: NĐ sau nc Variable NĐ sau nc Variable NĐ sau nc NĐ ban đầu 100 200 400 600 800 N 3 3 NĐ ban đầu 100 200 400 600 800 Maximum 4.000 12.00 12.00 13.00 16.00 N* 0 0 Mean 2.667 7.67 8.00 8.67 9.67 SE Mean 0.667 2.60 2.08 2.33 3.18 StDev 1.155 4.51 3.61 4.04 5.51 Minimum 2.000 3.00 5.00 5.00 6.00 Q1 2.000 3.00 5.00 5.00 6.00 Median 2.000 8.00 7.00 8.00 7.00 One-way ANOVA: C13 versus C14 Source C14 Error Total DF 18 19 SS 8307 5789 14096 S = 17.93 Level co vk k vk N 15 MS 8307 322 F 25.83 R-Sq = 58.93% Mean 7.33 54.40 StDev 4.24 37.21 P 0.000 R-Sq(adj) = 56.65% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * ) ( -* ) -+ -+ -+ -+ -0 20 40 60 Pooled StDev = 17.93 Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of C14 Simultaneous confidence level = 95.00% C14 = co vk subtracted from: C14 k vk Lower 27.61 Center 47.07 Upper 66.52 + -+ -+ -+ ( -* -) + -+ -+ -+ -25 25 50 73 Q3 4.000 12.00 12.00 13.00 16.00