BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TỐNG TRẦN THẢO LY Niên khóa: 2010 – 2014 Tháng 12 / 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.NGUYỄN QUỐC BÌNH TỐNG TRẦN THẢO LY KS.TRẦN THỊ THANH HƯƠNG Tháng 12 / 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết xin cảm ơn ba mẹ sinh nuôi nấng, dạy dỗ đến trưởng thành ngày hôm Ba mẹ người động viên giúp đỡ lúc khó khăn học tập Và cảm ơn thành viên gia đình động lực cho cố gắng sống Em xin chân thành cảm ơn đến: Thầy PGS.TS Lê Đình Đơn trưởng mơn Cơng nghệ sinh học tạo kiện cho em thực đề tài Và thầy cô môn truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường Ban giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM giúp đỡ tạo kiện cho em thực đề tài trung tâm TS Nguyễn Quốc Bình KS Trần Thị Thanh Hương tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt trình thực đề tài Các anh chị Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM chia động viên lúc em gặp khó khăn nhiệt tình giúp đỡ em Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013 Tống Trần Thảo Ly i TÓM TẮT Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus loại vi khuẩn nguy hiểm, tác nhân gây ngộ độc thực phẩm Việt Nam nước giới Việc kiểm soát diện vi khuẩn thực phẩm cần thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Trong nghiên cứu này, thiết kế chọn lọc cặp mồi đặc hiệu cho chủng vi khuẩn mục tiêu Các cặp mồi chọn cho kết đặc hiệu 100% với loài vi khuẩn mục tiêu, khơng có tượng bắt cặp chéo với loại vi khuẩn khác Quy trình định lượng vi khuẩn mục tiêu kỹ thuật real-time PCR thiết lập thành công với độ nhạy phản ứng 3-10 cfu/ 25g mẫu thực phẩm (R2= 0.998), độ tin cậy đạt 90% Kết định lượng tương đồng so với phương pháp đếm tế bào đĩa thạch Tuy nhiên, so với phương pháp nuôi cấy truyền thống, định lượng vi sinh vật phương pháp real-time PCR cho kết xác cao rút ngắn thời gian xét nghiệm Tồn q trình định lượng vi khuẩn kỹ thuật real-time PCR khoảng 30 so với thời gian 5-7 ngày sử dụng phương pháp truyền thống Kết nghiên cứu sở khoa học để phát triển kit real-time PCR dùng xét nghiệm an toàn thực phẩm vừa đáp ứng yêu cầu độ nhạy, độ xác cao, có thời gian xét nghiệm nhanh phương pháp ni cấy truyền thống Từ khóa: Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus, real-time PCR ii SUMMARY Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus are dangerous bacteria, is the main cause of food poisoning in Vietnam and countries around the world The control of the presence of bacteria in food is necessary to ensure food safety and protect the health of consumers In this study, we have designed and selected the specific mồis for each target bacteria The mồi pairs were selected for specificity 100% results with target bacteria, not the phenomenon of cross-pairing with other bacteria Process quantify target bacteria by real-time PCR technique was also successfully established with a sensitivity reaction is 3-10 cfu / 25g food sample (R2 = 0.998), reliability of over 90% The results of this real-time PCR technique similar to cell counts on agar plates However, quantitative microorganisms methods by real-time PCR is exactly and rapidly The results of this study will be the scientific basis for developing real-time PCR kit used in food safety testing Key words: Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus, real-time PCR iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm giới Việt Nam 2.2 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến 2.2.1 Vi khuẩn Salmonella 2.2.2 Vi khuẩn Shigella 2.2.3 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 2.3 Một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm 2.3.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 2.3.2 Phương pháp Real-time PCR 10 2.3.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn 11 2.3.2.2 Phân tích tổng quát phản ứng real-time PCR 12 2.3.2.3 Tính lập lại phản ứng real-time PCR 13 2.4 Tình hình nghiên cứu nước 13 Chương VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 iv 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 3.2 Vật liệu 15 3.2.1 Vi khuẩn 15 3.2.2 Vật liệu hóa chất dùng phản ứng Real-time PCR 15 3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 16 3.3 Dụng cụ thiết bị 17 3.4 Phương pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Thiết kế mồi đặc hiệu 19 3.4.2 Phương pháp trích ly DNA vi khuẩn 21 3.4.3 Xây dựng quy trình phản ứng real-time PCR 22 3.4.3.1 Sàng lọc mồi tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp mồi 22 3.4.3.2 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi 24 3.4.3.3 Dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR 24 3.4.4 So sánh với phương pháp truyền thống 30 3.4.4.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 30 3.4.4.2 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn dịch nuôi cấy 30 3.4.4.3 Phương pháp gây nhiễm khuẩn nhân tạo vào mẫu thực phẩm 31 3.4.5 Thực phản ứng real-time PCR 31 3.4.5.1 Chương trình real-time PCR 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết thiết kế mồi sở lí thuyết 33 4.2 Kết xây dựng quy trình phản ứng Real-time PCR 33 4.2.1 Sàng lọc tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi (Ta) 33 4.2.2 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi 36 4.2.3 Dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR 40 4.2.3.1 Kết PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu 39 4.2.3.2 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả nạp 39 4.2.3.3 Kết PCR khuẩn lạc sàng lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp 40 4.2.3.4 Kết dựng đường chuẩn 43 v 4.3 Kết định lượng sau gây nhiễm thực nghiệm realtime PCR 48 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Đề nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AOAC : Association of Official Agriculture Chemists BAM: Bacteriological Analytical Manual BC: Bacillus CDC: Centers for Disease Control and Prevention CT: Chu kì ngưỡng OD : optical density Gen ial: invasive-associated locus Gen invA: invasion gen Gen ipaH: invasion plasmid antigen Lis: Listeria PCR: Polymerase Chain Reaction TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam Sal: Salmonella Shi: Shigella STEC : Shiga Toxin-Producing Escherichia coli V: Vibrio parahaemolyticus vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp Bảng 3.1 Thành phần phản ứng real-time PCR 23 Bảng 3.2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng real-time PCR 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR (sử dụng Pfu polymerase) 26 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối 27 Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng real-time PCR dựng đường chuẩn 30 Bảng 4.1 Các cặp mồi thiết kế thực phản ứng PCR 33 Bảng 4.2 Các cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella, Shigella, V parahaemolyticus 38 Bảng 4.3 Kết đo OD mẫu plasmid chứng dương 43 Bảng 4.4 Kết dựng đường chuẩn cho real-time PCR định lượng Salmonella 43 Bảng 4.5 Kết định lượng Salmonella từ canh khuẩn 44 Bảng 4.6 Kết dựng đường chuẩn Shigella cho phản ứng real-time PCR 45 Bảng 4.7 Kết định lượng Shigella từ canh khuẩn 46 Bảng 4.8 Kết dựng đường chuẩn Vibrio parahaemolyticus cho realtime PCR 46 Bảng 4.9 Kết định lượng V parahaemolyticus từ canh khuẩn 47 Bảng 4.10 Kết phát vi khuẩn 48 viii ... TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh vi? ?n thực TS.NGUYỄN... quy trình định lượng chủng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus mẫu thực phẩm kỹ thuật real-time PCR cần phải trải qua bước: Bước 1: Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn Salmonella,. .. Shigella, Vibrio parahaemolyticus Bước 2: Thiết kế mồi đặc hiệu cho chủng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus Bước 3: Xây dựng quy trình real-time PCR phát chủng vi khuẩn: Salmonella,