BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HOÀNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISINDOSID D ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHƠI KHĨA LUẬN TƠT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HOÀNG Mã sinh viên: 1301169 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISINDOSID D ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHƠI KHĨA LUẬN TÔT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS ThS Nguyễn Lâm Hồng TS Đoàn Thị Mai Hƣơng Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Đồn Thị Mai Hƣơng – Viện Hóa Sinh Biển Việt Nam NCS ThS Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ mơn Hóa phân tích Độc Chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy Bộ mơn Hóa phân tích Độc Chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, giúp tơi áp dụng vào thực nghiệm để hồn thiện khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Lê Công Vinh anh chị trung tâm tiên tiến – Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn Lâm khoa học công nghệ Việt Nam hỗ trợ tơi q trình thực nghiệm viện Những kinh nghiệm kỹ học hỏi đƣợc góp phần giúp tơi thực nghiệm xác thực tế Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo cán nhân viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời dạy bảo giúp đỡ suốt năm năm học tập trƣờng Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ngƣời ln bên động viên, cổ vũ giúp đỡ để tơi hồn thành khóa học Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Văn Hoàng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN .2 1.1 Tổng quan thực vật Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl Euphorbiaceae) .2 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) 1.1.3 Chi Cách hoa (Cleistanthus) 1.1.4 Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) 1.1.5 Các nghiên cứu chi Cleistanthus 1.2 Hợp chất cleisindosid D .5 1.3 Tổng quan chất chuẩn .6 1.3.1 Khái niệm chất chuẩn 1.3.2 Phân lo ại chất chuẩn .7 1.3.3 Quy trình thiết lập chất chuẩn .7 1.4 Tổng quan tạp chất 1.4.1 Khái niệm phân loại 1.4.2 Tạp chất liên quan .9 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Hóa chất, dung mơi 13 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1 Khảo sát xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký cleisindosid D tinh chế đƣợc HPLC/DAD 14 2.2.2 Thẩm định phƣơng pháp 14 2.3 Phƣơng pháp nghiên c ứu 15 2.3.1 Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký cleisindosid D tinh chế HPLC/DAD 15 2.3.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 15 2.4 Xử lý kết 19 Chƣơng THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D phƣơng pháp HPLC/DAD 20 3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 20 3.1.2 Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký cleisindosid D 26 3.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 27 3.2.1 Độ đặc hiệu 27 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 32 3.2.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 33 3.2.4 Khoảng tuyến tính 35 3.2.5 Độ chụm 37 3.2.6 Độ ổn định phƣơng pháp phân tích 40 3.2.7 Kết xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D phƣơng pháp HPLC/DAD 42 3.3 Bàn luận 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 I Kết luận 44 II Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT α Hệ số chọn lọc ACN Acetonitril APG Angiosperm Phylogeny Group, Hệ thống phân loại thực vật ARS Chất chuẩn thức khu vực ASEAN ASEAN Association of South East Asian Nations BP British Pharmacopoeia, Dƣợc Điển Anh CH2Cl2 Dicloromethan HPLC/DAD High-performance liquid chromatography with Diod Array Detector, Sắc ký lỏng hiệu cao với detector mảng diod H2 O Nƣớc ICH International Council for Harmonisation ICRS International Chemical Reference Substances, chất chuẩn quốc tế IC50 Nồng độ ức chế 50 % số lƣợng cá thể IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry LOQ Limit of quantification, giới hạn định lƣợng MeOH Methanol NIST National Institute of Standards and Technology NMR Nuclear Magnetic Resonance, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân PCRS Primary chemical reference substances, chất chuẩn sơ cấp ppm Part(s) per million, nồng độ phần triệu RSD Relative Standard Deviation, độ lệch chuẩn tƣơng đối Rs Độ phân giải S/N Signal to noice ratio, tín hiệu/ nhiễu SD Standard deviation, độ lệch chuẩn SKĐ Sắc ký đồ SRCS Secondary chemical reference substances, chất chuẩn thứ cấp tR Thời gian lƣu TCCS Tiêu chuẩn sở TKSK Tinh khiết sắc ký USP United States Pharmacopoeia, Dƣợc Điển Mỹ UV Ultra Violet, tia cực tím VNRS Viet Nam Reference Substances, Chất chuẩn quốc gia Việt Nam WHO World Health Organization, Tổ chức Y Tế Thế giới DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1: Tiêu khơ hình ảnh hoa, lồi Cleistanthus tonkinensis Jabl Hình 2: Cơng thức cấu tạo cleisindosid D Hình 1: Cách xác định tỷ số tín hiệu nhiễu (S/N) 17 Hình 1: Sắc ký đồ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy theo chƣơng trình gradient (1) chƣơng trình gradient (2) 21 Hình 2: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với pha động ACN – dung dịch đệm acetat pH = 4,0 theo chƣơng trình gradient 22 Hình 3: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với hệ dung môi ACN – dung dịch acid Formic 0,1 % 23 Hình 4: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với hệ dung môi ACN – H2O 23 Hình 5: Hình ảnh đỉnh pic cleisindosid D với thể tích tiêm 20 µL (1) 40 µL (2) 25 Hình 6: SKĐ mẫu trắng (ACN – H2O) dung dịch cleisindosid D 1000 ppm 28 Hình 7: Hệ số tinh khiết pic cleisindosid D phổ 3D sắc ký đồ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm 28 Hình 8: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm phân hủy H2O2 30 % so với SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm 29 Hình 9: SKĐ dung dịch cleisindosid D bị phân hủy tia UV 24 giờ, dung dịch acid sulfuric 0,1 N so với SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm 30 Hình 10: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm bị phân hủy nhiệt độ (cách thủy 80 o C) dung dịch NaOH 0,1 N 15 phút so với SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm 31 Hình 11: SKĐ dung dịch cleisindosid D 0,1 ppm 34 Hình 12: Biểu đồ thể mối liên quan diện tích nồng độ cleisindosid D 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan số tài liệu 10 Bảng 1: Các chƣơng trình s ắc ký đƣợc khảo sát 20 Bảng 2: Kết độ phân giải cleisindosid D với tạp chất liền kề 21 Bảng 3: Chƣơng trình gradient 21 Bảng 4: Chƣơng trình gradient chạy sắc ký 22 Bảng 5: Phổ cleisindosid D tạp chất liên quan 24 Bảng 6: Độ tinh khiết sắc ký cleisindosid D hàm lƣợng tổng tạp chất qua lần tiêm mẫu 25 Bảng 7: Kết thẩm định độ phù hợp hệ thống 33 Bảng 8: Kết tiêm lặp lại dung dịch cleisindosid D 0,1 ppm 34 Bảng 9: Quy trình pha dung dịch đƣờng chuẩn 35 Bảng 10: Kết thẩm định độ tuyến tính 36 Bảng 11: Kết thẩm định độ lặp lại 38 Bảng 12: Hàm lƣợng tổng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký cleisindosid D 39 Bảng 13: Độ tinh khiết sắc ký hàm lƣợng tạp chất liên quan cleisindosid D trình bảo quản 40 Bảng 14: Kết khảo sát ổn định tốc độ dòng 41 Bảng 15: Độ tinh khiết sắc ký hàm lƣợng tạp chất liên quan nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D (%) 41 Bảng 16: Kết khảo sát độ ổn định bƣớc sóng 42 ... “ Xây d? ??ng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan nguyên li ệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D đƣợc phân lập từ Chà chôi ” với mục tiêu: - Xây d? ??ng thẩm định phƣơng pháp xác định. .. HỌC D? ?ỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HOÀNG Mã sinh viên: 1301169 XÂY D? ??NG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISINDOSID D ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY... H2O) dung d? ??ch cleisindosid D 1000 ppm 28 Hình 7: Hệ số tinh khiết pic cleisindosid D phổ 3D sắc ký đồ dung d? ??ch cleisindosid D 1000 ppm 28 Hình 8: SKĐ dung d? ??ch cleisindosid D 1000