BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI BÍCH PHƢƠNG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISTONKINENSIS A ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHƠI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI BÍCH PHƢƠNG Mã sinh viên: 1301322 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISTONKINENSIS A ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CÂY CHÀ CHƠI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Lâm Hồng TS Đoàn Thị Mai Hƣơng Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất Ts Đồn Thị Mai Hƣơng- Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tạo điều kiện mặt cho tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội nhƣ Ths Lê Công Vinh anh chị Phòng tổng hợp hữu cơ, Viện hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, giúp đỡ thời gian vừa qua Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo cán nhân viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời dạy bảo giúp đỡ suốt năm năm học tập trƣờng Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ngƣời bên động viên, cổ vũ giúp đỡ để tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Bùi Bích Phƣơng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thực vật Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl Euphorbiaceae) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) 1.1.3 Chi Cleistanthus 1.1.4 Loài Cleistanthus tonkinensis 1.2 Sơ lƣợc hợp chất cleistonkinensis A 1.3 Chất chuẩn quy trình thiết lập chất chuẩn 1.3.1 Khái quát chất chuẩn 1.3.2 Quy trình thiết lập chất chuẩn 1.4 Tổng quan thẩm định phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan 1.4.1 Khái niệm 1.4.2 Các kỹ thuật phân tích tạp chất liên quan 1.4.3 Thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan 11 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Hóa chất, dung mơi, chất chuẩn 18 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Xác định hàm lượng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký cleistonkinensis A HPLC/DAD 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Xác định hàm lượng tạp chất liên quan đôk tinh khiết sắc ký cleistonkinensis A HPLC/DAD 19 2.4 Xử lý kết 22 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký cleistonkinensis A HPLC/DAD 23 3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 23 3.1.2 Thẩm định phương pháp 27 3.2 Bàn luận 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril APG Angiosperm Phylogeny Group ARS ASEAN Reference Standards ASEAN Association of Southeast Asian Nations d Độ chia nhỏ dd Dung dịch DAD Diode Array Detector ĐTK Độ tinh khiết EPCRS European Pharmacopeia Reference Substances GC Gas Chromatography GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry HPLC High Performance Liquid Chromatography ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals Human Use ICRS International Chemical Reference Substances IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantitation MeOH Methanol N Số đĩa lý thuyết NIST National Institute of Standards and Technology RS Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation of S Diện tích SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng S/N Signal/Noise T Hệ số đối xứng pic TB Trung bình TCCS Tiêu chuẩn sở TLC Thin Layer Chromatography TLQ Tạp liên quan tR Thời gian lƣu USPRS United States Pharmacopeia Reference Substances UV-VIS Ultraviolet - Visible Spectroscopy WHO World Health Organization DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Tỷ lệ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) 16 Bảng 2: Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) 17 Bảng 1: Chƣơng trình sắc ký gradient 23 Bảng 2: Chƣơng trình sắc ký gradient 24 Bảng 3: Kết khảo sát chƣơng trình sắc ký 24 Bảng 4: Khảo sát bƣớc sóng 26 Bảng 5: Chƣơng trình sắc ký 27 Bảng 6: Kết độ tinh khiết sắc ký dung dịch Cleistonkinensis A 1000 ppm điều kiện chiếu tia UV 32 Bảng 7: Kết thẩm định độ phù hợp hệ thống 35 Bảng 8: Độ lặp lại LOQ 36 Bảng 9: Kết khảo sát độ tuyến tính 37 Bảng 10: Kết thẩm định độ lặp lại 38 Bảng 11: Kết độ ổn định dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm: 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THI Hình 1: Tiêu Cleistanthus tonkinensis Hình 2: Quả Cleistanthus tonkinensis Hình 3: Signal/noise 14 Hình 1: Sắc ký đồ khảo sát chƣơng trình sắc ký gradient 23 Hình 2: Sắc ký đồ khảo sát chƣơng trình sắc ký gradient 24 Hình 3: Phổ hấp thụ UV-VIS cleistonkinensis A tạp chất liên quan 25 Hình 4: Kết khảo sát thể tích tiêm 26 Hình 5: SKĐ mẫu trắng dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm 29 Hình 6: Độ tinh khiết pic sắc ký dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm 29 Hình 7: Phổ 3D dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm 29 Hình 8: SKĐ Dung dịch phân giải Cleistonkinensis A - Cleistantoxin 30 Hình 9: Sắc ký đồ dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy điều kiện: H2O2 30% đun cách thủy 1000C 30 Hình 10: SKĐ cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy điều kiện chiếu tia UV 31 Hình 11: Độ tinh khiết pic sắc ký dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm điều kiện chiếu tia UV 31 Hình 12: Cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy H2SO4 0,1 N 32 Hình 13: Cleistonkinensis A phân hủy NaOH 0,1 N 33 Hình 14: Sắc ký đồ dung dịch cleistonkinensis A 0,05 ppm 35 Hình 15: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ tuyến tính diện tích pic nồng độ 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế Thể giới (WHO), ung thƣ nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai toàn cầu với 8,8 triệu ngƣời chết năm 2015 [22] Nhiều liệu trình điều trị đƣợc áp dụng nhƣ: hóa trị, xạ trị, can thiệp xâm lấn nhiên kết thu đƣợc chƣa nhƣ mong đợi Điều thúc đẩy nhà khoa học tìm tịi nghiên cứu phƣơng pháp, loại thuốc để chống lại bệnh Trên giới nhƣ Việt Nam, hƣớng nghiên cứu đƣợc quan tâm phát triển thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc từ dƣợc liệu Năm 2009, dự án "Phịng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật hệ thực vật Việt Nam" đƣợc khởi động, dịch chiết ethyl acetat 2500 loài thực vật Việt Nam đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ dịng ung thƣ biểu mơ KB Một kết bật dịch chiết từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis) Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indochinensis) cho phần trăm ức chế dịng tế bào ung thƣ biểu mơ KB đạt từ 88,40 - 95,17% Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu phân lập, tinh chế xác định cấu trúc đƣợc hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 khoảng 14 - 36 nM (tƣơng đƣơng với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml) [4] Bên cạnh đó, hợp chất glycosid cleistantoxin phân lập đƣợc từ Chà chơi có cấu trúc hóa học gần nhƣ tƣơng tự etoposid teniposid hai dẫn chất podophyllotoxin đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi Dựa kết này, nhóm tác giả nghiên cứu chế tạo cao định chuẩn phân đoạn giàu cleistantoxin aryltetralin lignan đƣợc chiết xuất từ Chà chôi để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thƣ Nhằm xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao định chuẩn đƣợc nghiên cứu điều trị ung thƣ, chất chuẩn cần đƣợc thiết lập để tiến hành định tính định lƣợng chất có mặt cao, chất chuẩn cleistonkinensis A đƣợc sử dụng làm dung dịch phân giải định lƣợng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký cleistantoxin nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan ... sinh viên: 1301322 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISTONKINENSIS A ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CÂY CHÀ CHƠI KH? ?A LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC... lƣợng tạp chất liên quan độ tinh khiết sắc ký cleistantoxin nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan nguyên. .. quan nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Cleistonkinensis A phân lập từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis)” với mục tiêu: - Xây dựn thẩm định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan độ tinh