VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ VUI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT THROMBIN TỪ PHỔI BÕ ỨNG DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO BĂNG GẠC CẦM MÁU NHANH VẾT THƯƠNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS LÊ MINH TRÍ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUÂN SỰ VIỆT NAM e Hà Nội - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui MỤC LỤC MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 11 Lý chọn đề tài 11 Mục têu nghiên cứu 12 Nội dung nghiên cứu 12 Những điểm đề tài Error! Bookmark not defined 4.1 Trên giới Error! Bookmark not defined 4.2 Trong nước Error! Bookmark not defined CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 1.1 CƠ CHẾ CẦM MÁU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CẦM MÁU 13 1.1.1 Cơ chế cầm máu 13 1.1.2 Các yếu tố đông máu 13 1.1.3 Các giai đoạn cầm máu 14 1.1.3.1 Co mạch chỗ 14 1.1.3.2 Tạo nút tiểu cầu 14 1.1.3.3 Tạo cục máu đông 15 1.1.3.4 Co cục máu đông tan cục máu đông 18 1.1.4 Các phương pháp cầm máu 19 1.1.4.1 Cầm máu thảo dược 19 1.1.4.2 Cầm máu phương pháp vật lý 19 1.1.4.3 Cầm máu số chất hóa học 20 1.2 THROMBIN 20 1.2.1 Khái quát chung thrombin 20 1.2.1.1 Cấu chúc chức 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui 1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động thrombin 22 1.2.1.4 Ứng dụng thrombin 23 1.2.2 Prothrombin 24 1.2.2.1 Thành phần prothrombin 24 1.2.2.2 Thời gian prothrombin 25 1.2.2.3 Kích hoạt prothrombin 25 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 27 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 30 2.1.1 Vật liệu 30 2.1.2 Hóa chất 31 2.1.3 Dung dịch đệm 31 2.1.4 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 32 2.1.4.1 Dụng cụ 32 2.1.4.2 Thiết bị 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Khảo sát hàm lượng thrombin phổi bò 33 2.2.1.1 Tách chiết thrombin tư mẫu phởi bò 33 2.2.1.3 Khảo sát thrombin mẫu phổi 33 2.2.1.4 Khảo sát hoạt tính thrombin 33 2.2.2 Tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò 33 2.2.2.1 Tách thrombin nồng độ ethanol khác 33 2.2.2.2 Tách thrombin nông độ aceton khác 35 2.2.2.3 Tách chiết thrombin ngưỡng nhiệt độ khác 36 2.2.2.4 Tách chiết thrombin độ pH khác 38 2.2.2.5 Tách chiết thrombin với ngưỡng thời gian ngâm tách mẫu khác 40 2.2.2.6 Tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin tư phởi bò 43 2.2.3 Nghiên cứu bổ sung chất an định (bền) cấu trúc thrombin tannic acid điều kiện môi trường thường 43 2.2.9.1 Đanh gia kha chuyên hoa fbrinogen cua thrombin 43 2.2.9.2 Ảnh hưởng chất an định 43 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui 3.1 Khảo sát hoạt tính thrombin số mẫu phổi bò thu thập vùng khác 44 3.2 Tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò 46 3.2.1 Tách thrombin nồng độ ethanol khác 46 3.2.2.Tách prothrombin nồng độ acetone khác 49 3.2.3 Tách thrombin điều kiện nhiệt độ khác 49 3.2.4 Tách thrombin cách ngưỡng pH khác 53 3.2.5 Tách thrombin với ngưỡng thời gian ngâm tách mẫu khác 54 3.3 Tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò 56 3.4 Kết nghiên cứu bổ sung chất an định (bền) cấu trúc thrombin tannic acid điều kiện môi trường thường 59 3.4.1 Đánh giá ảnh hưởng chất an định acid tannic thrombin 59 3.4.2 Ảnh hưởng chất an định thrombin 59 3.4.3 Ảnh hưởng chất an định thrombin bổ sung 0,05% tannic acid 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 Kết luận 66 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 I Tài liệu Tiếng Việt 67 II Tài liệu Tiếng Anh 68 PHỤ LỤC 73 PHỤ LỤC 1: Quy trình cơng nghệ gắn thrombin lên băng gạc phương pháp khác (phun, tẩm) 73 PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh thử nghiệm cầm máu thỏ băng gạc tẩm thrombin 75 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học Ts Lê Minh Trí Các nội dung nghiên cứu, kết quả, số liệu công bố đề tài trung thực đảm bảo độ tin cậy Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tch, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ ng̀n khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, luận văn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích ng̀n gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Thị Vui Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Minh Trí – Phòng Hóa sinh Viên Hoa hoc - Vât liêu, Viện KH & CN Quân Việt Nam - người trực tiếp hướng dẫn thực nghiên cứu mình, đem lại cho tơi kiến thức bơ trợ, vơ có ích thời gian thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tồn thể cán - nhân viên Phòng Cơng nghệ Enzyme – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt nam nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để thực nghiên cứu Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Đại học Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Viện Hoá học – Vật liệu, Viện KH & CN Quân Việt Nam tạo điều kiện cho tơi q trình học tập nghiên cứu Cơng trình hỗ trợ tư nhiệm vụ cấp Bộ Quốc phòng « Nghiên cứu chế tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thương tư thrombin tannic acid » Cuối xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, người ln bên tơi, động viên khuyến khích tơi q trình thực đề tài nghiên cứu Hà Nội, ngày 18 tháng 11 năm 2015 Lê Thị Vui Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các yếu tố đơng máu 2.1 Hóa chất sử dụng 2.2 Các dung dịch đệm 2.3 Các thiết bị sử dụng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol trình tách tới hoạt tính thrombin 3.2 Ảnh hưởng nờng độ acetone q trình tách tới hoạt tính thrombin 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ trình tách tới hoạt tính thrombin 3.4 Ảnh hưởng pH q trình tách tới hoạt tính thrombin 3.5 Ảnh hưởng thời gian ngâm tách mẫu trình tách tới hoạt tính thrombin 3.6 Ảnh hưởng số yếu tố tới hoat tinh thrombin 3.7 Đánh giá chất an định đến thrombin 3.8 Đánh giá chất an định đến thrombin bổ sung 0,05% tannic acid Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình 1.1 Minh hoạ đơng máu nội sinh ngoại sinh 1.2 Cấu trúc thrombin người 1.3 Cấu trúc không gian prothrombin 1.4 Cơ chê hoat đông thrombin 1.5 Thành phần prothrombin 1.6 Sơ đô vê sư hoat đông cua prothrombin 2.1 Các mẫu phổi thu thập 3.1 Điện di đô SDS-PAGE 3.2 Khảo sát hoạt tính thrombin mẫu phổi bò khác 3.3 SDS-PAGE protein tách từ mẫu phổi bò sử dụng ethanol 3.4 SDS-PAGE protein tach tư mâu phôi bo sư dung acetone 3.5 SDS-PAGE protein tach tư mâu phôi bo nhiệt độ khác 3.6 SDS-PAGE protein tach tư mâu phôi bo pH khac 3.7 SDS-PAGE protein tach tư mâu phôi bo ngâm mâu 3.8 Khảo sát khả chuyển hóa fibrionogen thrombin acid tannic 3.9 Ảnh hưởng Tween 20 thrombin thời điểm ban đầu 3.10 Ảnh hưởng tween 80 thrombin thời điểm ban đầu 3.11 Ảnh hưởng triton x100 thrombin thời điểm ban đầu 3.12 Ảnh hưởng SDS thrombin thời điểm ban đầu 3.13 Ảnh hưởng PEG 4000 thrombin Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Trang Lê Thị Vui 3.14 Ảnh hưởng tween 20 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu 3.15 Ảnh hưởng tween 80 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu 3.16 Ảnh hưởng triton x100 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu 3.17 Ảnh hưởng PEG 4000 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu 3.18 Ảnh hưởng SDS thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mỗi năm, giới, số người tử vong không cầm máu kịp thời tổn thương mạch máu ngày gia tăng khơng có dấu hiệu thuyên giảm Các tác nhân dẫn đến tổn thương mạch máu chủ yếu tác động bên xung đột, hoạt động sinh hoạt bình thường người tham gia giao thông, sử dụng vật sắc nhọn, vết thương côn trùng, động vật hút máu … gây nên Ngồi ra, bên thể có nhiều mơ chết tổn thương khiến yếu tố đông máu bị sử dụng q trình đơng máu khơng tập trung, khơng đủ để trì cầm máu mạch máu bị tổn thương Khi gặp trường hợp vậy, cần có phương pháp cầm máu nhanh, đơn giản, hiệu Tuy nhiên, khơng có kỹ vận dụng sơ cứu tâm lý bất ổn định khiến việc sơ cứu trở nên khó khăn dẫn đến trường hợp đáng tiếc Ở Việt Nam, theo nghiên cứu khảo sát Bệnh viện Việt Đức Hà Nội, phân tch 324.000 bệnh án bệnh nhân nhập viện từ năm 1990 đến 2002, nghiên cứu viên nhận bệnh nhân sơ cấp cứu thấp (khoảng - 10%), khoảng 50% số trường hợp sơ cứu thành công Hiện nay, phương pháp cầm máu chỗ thường phương pháp vật lý băng chèn, băng ép, đặt garo - đòi hỏi phải có dụng cụ phù hợp người sơ cứu phải có kĩ chuẩn, thao tác nhanh, xác Tuy nhiên, đa số người dân chưa trang bị kĩ trên, chưa có ý thức tự tm hiểu nên hiệu phương pháp không cao, dẫn đến nhiều trường hợp đáng tếc xảy Vì vậy, có phương pháp sơ cứu cầm máu đơn giản, hiệu nhanh nhu cầu cấp thiết Thrombin yếu tố có vai trò quan trọng sinh lý đơng máu tình trạng bệnh lý Thrombin sau hình thành chuyển fibrinogen thành fibrin đơn phân Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin dạng sợi, mạng lưới fibrin 2+ hình thành Giai đoạn có tham gia ion Ca tế bào máu giữ lại lưới fibrin tạo nên cục máu đơng Chính mạng lưới dính vào vị trí tổn thương thành mạch để ngăn cản chảy máu Bản chất máu đơng hình thành lưới fibrin từ fibrinogen nhờ thrombin Chính ứng dụng tiềm lớn thrombin, tiến hành đề tài : “Nghiên cứu tách chiết thrombin từ phổi bò ứng dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thương” Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn B A Hình 3.14 Ảnh hưởng tween 20 thrombin bô sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau C (B) sau 24 (C) (ĐC(-): khơng thrombin; ĐC(+): có thrombin) Ảnh hưởng chất Tween 80 A B Hình 3.15 Ảnh hưởng tween 80 thrombin bô sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau (B) C sau 24 (C) (ĐC(-): khơng thrombin; ĐC(+): có thrombin) Ảnh hưởng chất Trixton X100 A B Hình 3.16 Ảnh hưởng triton x100 thrombin bô sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau (B) sau 24 (C) (ĐC(-): không C thrombin; ĐC(+): có thrombin) Ảnh hưởng chất PEG 4000 A B Hình 3.17 Ảnh hưởng PEG 4000 thrombin bô sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau (B) sau 24 (C) ĐC(-): khơng C thrombin; ĐC(+): có thrombin Ảnh hưởng chất SDS A B Hình 3.18 Ảnh hưởng SDS thrombin bô sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau (B) sau 24 (C) (ĐC(-): không thrombin; ĐC(+): có thrombin) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tách thrombin từ phổi bò với trọng lượng phân tử 37 kDa Đã xác định điều kiện tối ưu để tách chiết thrombin từ phổi bò pH o o 8,5 , thời gian ngâm tách mẫu 12 đến 24 giờ, nhiệt độ C đến C, nôn ̀ g độ aceton 50%, nôn ̀ g độ ethanol 20%, dùng Tween 20 PEG 4000 nôn ̀ g độ từ 0,1% đến 1% chất an định thrombin Đã thử nghiệm khả cầm máu thrombin tách chiết theo hai cách : tẩm vào băng gạc phun trực tiếp thrombin vào vết thương Thời gian cầm máu băng gạc đến 10 giây, theo phương pháp phun – giây Kiến nghị - Tiếp tục nghiên xây dựng phương pháp chế tạo băng gạc cầm máu từ nguyên liệu thrombin - Hồn thiện quy trình đánh giá độ an tồn băng gạc gắn thrombin - Xây dựng quy trình bảo quản băng gạc gắn thrombin TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Nghiêm Luật, Hồng Bích Ngọc, Vũ Thị Phương 2001 Hoá sinh Nxb Y học - Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng 1999 Hoá sinh học Nxb Giáo dục Hà Nội Trịnh Bình Dy2006 “Sinh lý học cầm máu đông máu” Sinh lý học tập 1, NXB Y học Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên 1998 Giáo trình sinh hố đại Nxb Giáo dục - Hà Nội Nguyễn Tiến Thắng 2003 Công nghệ enzyme protein Viện Sinh học Nhiệt Đới Tp Hơ Chí Minh Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Dỗn Diên 2002 Hố sinh cơng nghiệp Nxb Khoa học & Kỹ thuật - Hà Nội Nguyễn Đức Lượng 2004 Công nghệ enzyme, , NXB Đại học Quốc gia Thành Phố Hơ Chí Minh Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy Nguyễn Xuân Sâm 2004 Công nghệ enzyme NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Uyển Nguyễn Tiến Thắng 1999 Những kiến thức công nghệ sinh học NXB Giáo dục, Hà Nội II Tài liệu Tiếng Anh Aizawa P et al., (2008) Large-scale preparation of thrombin from human plasma In Elsevier, pp 560-567 Arni RK et al., (1993) Structures of the noncovalent complexes of human and bovine prothrombin fragment with human PPACK-thrombin In ACS Publications, pp 4727-4737 Ajtai K., Szilagyi L 1985 Biokémiai gyakorlatok.Tankonyv Jankonyv Kiado, Budapest USA Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press Inc New York, Bick RL, Murano G (1994) Physiology of hemostasis In, p 677 Bouchard BA et al., (1997) Effector cell protease receptor-1, a platelet activation- dependent membrane protein, regulates prothrombinase-catalyzed thrombin generation In ASBMB, pp 9244-9251 Bourin M-C, Lindahl U (1993) Glycosaminoglycans and the regulation of blood coagulation In Portland Press Ltd, p 313 Brummel KE et al., (1999) An integrated study of fibrinogen during blood coagulation In ASBMB, pp 22862-22870 Butenas S et al., (1997) Evaluation of the initation phase of blood coagulation using ultrasensitive assays for serine proteases In ASBMB, pp 21527-21533 10 Camera M et al., (1999) Cooperation between VEGF and TNF-α is necessary for exposure of active tssue factor on the surface of human endothelial cells In Am Heart Assoc, pp 531-537 11 Camire RM et al., (1995) The mechanism of inactivation of human platelet factor Va from normal and activated protein C-resistant individuals In ASBMB, pp 2079420800 12 Duckers C et al., (2009) Advances in understanding the bleeding diathesis in factor V deficiency In Wiley Online Library, pp 17-26 13 Eichinger S et al., (1995) Determinants of plasma factor VIIa levels in humans In American Society of Hematology, pp 3021-3025 14 Esmon CT et al., (1974) The conversion of prothrombin to thrombin V the actvation of prothrombin by factor Xa in the present of phospholipid In ASBMB, pp 77987807 15 Fager AM et al., (2010) Propertes of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functonal prothrombinase Arterioscler Thromb Vasc Biol 30:2400-2407 16 Franza BR et al., (1975) Activation of human prothrombin by a procoagulant fraction from the venom of Echis carinatus Identification of a high molecular weight intermediate with thrombin activity In ASBMB, pp 70577068 17 Furie B, Furie BC (2005) Thrombus formation in vivo In Am Soc Clin Investig, pp 3355-3362 18 Gailani D, Broze GJ (1991) Factor XI activation in a revised model of blood coagulation In American Association for the Advancement of Science, pp 909-912 19 Gentry PA (2004) Comparatve aspects of blood coagulation In Elsevier, pp 238-251 20 Goldsack NR et al., (1998) Molecules in focus Thrombin In Elsevier, pp 641-646 21 Greenhalgh DG et al., (2009) Recombinant thrombin: safety and immunogenicity in burn wound excision and grafting In LWW, pp 371-379 22 Heldebrant CM et al., (1973) The activation of prothrombin II Partial reactions, physical and chemical characterization of the intermediates of activation In ASBMB, pp 7149-7163 23 Hugel Bnd et al., (1999) Elevated levels of circulatng procoagulant microparticles in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and aplastic anemia In American Society of Hematology, pp 3451-3456 24 Krishnaswamy S et al., (1987) Actvation of human prothrombin by human prothrombinase Influence of factor Va on the reacton mechanism In ASBMB, pp 32913299 25 Kerese I 1984 Methods of Protein analysis Akademiai Kiado, Budapes 26 Stryer l., 1981 Biochmistry W H Freeman and company, San francisco 27 Lee JM 2000 Biochemical Engineering Prentice Hall Inc USA 28 Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK 29 Lawson JH, Mann KG (1991) Cooperative activaton of human factor IX by the human extrinsic pathway of blood coagulation In ASBMB, pp 1131711327 30 Mann KG et al., (1992) Surface-dependent hemostasis In: Seminars in hematology, pp 213-226 31 Mann KG et al., (1990) Surface-dependent reactions of the vitamin K- dependent enzyme complexes Blood 76:1-16 32 Markland FS, Damus PS (1971) Purification and properties of a thrombin- like enzyme from the venom of Crotalus adamanteus (Eastern diamondback rattlesnake) In ASBMB, pp 6460-6473 33 Miletich JP et al., (1979) Deficiency of factor Xa-factor Va binding sites on the platelets of a patient with a bleeding disorder In American Society of Hematology, pp 10151022 34 Minnema MC et al., (1999) The role of factor XI in coagulation: a matter of revision In: Seminars in thrombosis and hemostasis New York: Stratton Intercontinental Medical Book Corporation, c1974-, pp 419-428 35 Morrissey JH et al., (1993) Quantitation of actvated factor VII levels in plasma using a tissue factor mutant selectively deficient in promotng factor VII activation In American Society of Hematology, pp 734-744 36 Mosesson MW (1992) The roles of fibrinogen and fibrin in hemostasis and thrombosis In: Seminars in hematology, p 177 37 Naski MC et al., (1991) Characterization of the kinetic pathway for fibrin promotion of α-thrombin catalyzed activation of plasma factor XIII Biochemistry 30:934-941 38 Nesheim ME et al., (1979) The contributon of bovine factor V and factor Va to the activity of prothrombinase In ASBMB, pp 10952-10962 39 Osterud B et al., (1977) Factor V actvity of platelets: evidence for an activated factor V molecule and for a platelet activator In American Society of Hematology, pp 819834 40 Rand MD et al., (1994) Platelet coagulation factor Va: the major secretory platelet phosphoprotein In American Society of Hematology, pp 2180-2190 41 Rosing J et al., (1986) Formation of meizothrombin as intermediate in factor Xa- catalyzed prothrombin activation In ASBMB, pp 4224-4228 42 Seegers WH (1940) Purification of prothrombin and thrombin: chemical properties of purified preparations In ASBMB, pp 103-111 43 Seegers WH et al., (1938) The purification of thrombin In ASBMB, pp 91-95 44 Singla NK et al., (2009) A phase 3b, open-label, single-group immunogenicity and safety study of topical recombinant thrombin in surgical hemostasis In Elsevier, pp 68-74 45 Stubbs MT, Bode W (1995) The clot thickens: clues provided by thrombin structure In Elsevier, pp 23-28 46 Tanaka-Azevedo AM et al., (2010) Thrombin inhibitors from different animals In Hindawi Publishing Corporation 47 Tollefsen DM et al., (1982) Heparin cofactor II Purification and properties of a heparin-dependent inhibitor of thrombin in human plasma In ASBMB, pp 2162-2169 48 Tracy PB et al., (1985) Human prothrombinase complex assembly and functon on isolated peripheral blood cell populations In ASBMB, pp 21192124 49 Wencel-Drake JD et al., (1986) Ultrastructural localization of coagulaton factor V in human platelets In American Society of Hematology, pp 244-249 50 Yang H-L et al., (1994) Humic acid induces expression of tissue factor by cultured endothelial cells: regulation by cytosolic calcium and protein kinase C In, pp 325-330 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Quy trình cơng nghệ gắn thrombin lên băng gạc phương pháp khác (phun, tẩm) 1.1 Đanh gia kha chuyên hoa fibrinogen cua thrombin Dịch thrombin sau tách từ mẫu khảo sát hoạt tính có mẫu với phản ứng 20 µl fibrinogen 200 l NaCl 0,9%; sau đo bô sung 50 l thrombin; vơi mâu đôi chưng không sư dung thrombin Quan sat thơi gian chuyên hoa fibrinogen fibrin 1.2 Điện di SDS-PAGE Khối lượng phân tử tương đối protein tinh độ dịch protein đánh giá điện di gel polyacrylamide (Laemmli, 1970) 1.3 Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein xác định theo Bradford (Bradford, 1976) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 73 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui 1.4 Nghiên cứu điều kiện gắn thrombin lên gạc Thrombin sau tnh kiểm tra điện di hoạt tnh chuyên hoa fibrinogen cua thrombin Dịch thrombin phun tẩm lên gạc urgon gạc có kích thước 2x6 cm, 4x6 cm 10x10 cm 1.5 Kiểm tra hiệu sử dụng băng gạc gắn thrombin thỏ trắng Thỏ gây chảy máu ỏ đùi, phun dung dịch thrombin gắn gạc có gắn thrombin vào vết thương Quan sát thời gian đông máu Mẫu đối chứng gây chảy máu để máu đông tự nhiên Thrombin tinh Băng /gạc 200 l/băng Băng có tầm thrombin Số hóa Trung tâm HĐánh ọc liệu ĐHTN giá–độ ổn định http://www Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm lrc.tnu.edu.vn Lê Thị Vui PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh thử nghiệm cầm máu thỏ băng gạc tẩm thrombin Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 75 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Vết thương vị trí đùi thỏ, sử dụng băng tẩm thrombin (tách chiết từ phổi bò), ngưng chảy máu sau 10 giây Khơng có tượng chảy máu thứ phát Vết thương vị trí đùi thỏ, sử dụng băng tẩm thrombin (tách chiết từ máu), ngưng chảy máu sau 15 giây Khơng có tượng chảy máu thứ phát Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 76 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Vết thương vị trí đùi thỏ, sử dụng băng thường, ngưng chảy máu sau phút, xuất chảy máu thứ phát Vết thương vị trí ngực thỏ, ngưng chảy máu sau giây sau têm dịch thrombin Khơng có tượng chảy máu thứ phát Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 77 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Xác nhận người hướng dẫn Lê Minh Trí Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 78 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui ... thrombin Chính ứng dụng tiềm lớn thrombin, tiến hành đề tài : Nghiên cứu tách chiết thrombin từ phổi bò ứng dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thương Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN... chất đến trình tách chiết thrombin từ phổi bò; Nghiên cứu điều kiện tách chiết, tinh thrombin từ phổi bò Đánh giá ảnh hưởng số chất an định lên hoạt tính thrombin Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN... thái Tài nguyên Sinh vật Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò, điều kiện tinh thrombin , đánh giá ảnh hưởng số chất an định lên hoạt tính thrombin tách chiết Nội