BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY MUỒNG LÙN CHAMAECRISTA PUMILA (LAM.) K.LARSEN LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY MUỒNG LÙN CHAMAECRISTA PUMILA (LAM.) K.LARSEN LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển Ths Vũ Thanh Bình HÀ NỘI 2018 LỜI CÁM ƠN Luận văn thạc sỹ em hoàn thành nhiều thiếu sót, nhiên em ln trân trọng quãng thời gian thực luận văn cho em hội làm việc lĩnh hội nhiều kiến thức từ thầy cô, bạn bè Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.Nguyễn Mạnh Tuyển người Thầy hướng dẫn truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học, động viên em lúc khó khăn trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS.NCS.Vũ Thanh Bình, người hỗ trợ cho em nhiều trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn q Thầy Cơ anh chị em kỹ thuật viên môn Dược học cổ truyền, môn Dược lực, trường đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người bạn, người thân gia đình động viên tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn tất giúp đỡ quý báu Lê Minh Hằng MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN 1.1 CHI CASSIA 1.1.1 Vị trí phân loại chi Cassia 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Một số loài thuộc chi Cassia 1.1.3.1 Đặc điểm thực vật số loài thuộc chi Cassia 1.1.3.2 Thành phần hóa học số loài thuộc chi 1.2 CÂY MUỒNG LÙN 1.2.1 Đặc điểm thực vật, sinh thái, phân bố 1.2.2 Bộ phận dùng: 11 1.2.3 Các nghiên cứu thành phần hóa học Muồng lùn 11 1.2.4 Các nghiên cứu tác dụng dược lý Muồng lùn: 16 1.2.5 Công dụng muồng lùn 17 PHẦN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 18 2.1.2 Động vật thí nghiệm 18 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất địa điểm nghiên cứu 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Điều chế mẫu nghiên cứu 19 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết muồng lùn 22 2.2.2.1 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phương pháp dọn gốc tự phân đoạn dịch chiết muồng lùn: 22 2.2.1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 24 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan dịch chiết muồng lùn 25 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu – đánh giá kết 28 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Thành phần hóa hoạc dịch chiết Muồng lùn theo định hướng tác dụng chống oxy hóa 29 3.1.1 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn dịch chiết phương pháp dọn gốc tự do: 29 3.1.1.1 Kết thử tác dụng dọn gốc tự DPDH 29 3.1.1.2 Kết thử tác dụng dọn gốc tự SOD 30 3.1.2 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc chất phân đoạn dịch chiết ethyl acetat muồng lùn 32 3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết 35 3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 36 3.2 Tác dụng bảo vệ gan động vật thực nghiệm dịch chiết muồng lùn: 42 PHẦN BÀN LUẬN 51 4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa muồng lùn 51 4.1.1 Kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro 51 4.1.2 Về thành phần hóa học 52 4.2 Tác dụng sinh học 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT LUẬN: 59 KIẾN NGHỊ: 60 TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 61 PHỤ LỤC 61 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt C – NMR1H Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon (13) Nuclear – NMR magnetic resonance )Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 H – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ProtonPhổ cộng hưởng từ hạt NMRNMR nhân (Nuclear magnetic resonance) ALAT Alanin aminotransferase ASAT Aspartat aminotransferase C Cassia CC Sắc ký cột (Column chromatography) CCl4PAR Carbon tetrachlorideParacetamol DCM Dichloromethan DEPT Distortion Enhancement by PolarizationTransfer DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Phổ khối lượng ion hóa tia điện (Electrospray ionization mass spectrometry ) EtOAc Etyl acetat EtOH Ethanol GSH HSQC13C NMR IC50 Glutathion Heteronuclear Single Quantum CoherencePhổ cộng hưởng – từ hạt nhân carbon 13 (Carbon (13) Nuclear magnetic resonance ) Nồng độ ức chế 50% IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MDA Malondialdehyd NMRMS Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear resonance)Phổ khối (Mass spectrometry) SOD Superoxid dismutase TT Thuốc thử magnetic DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng 1.1 Thành phần hóa học lồi thuộc chi Cassia Việt Nam Bảng 1.2 Hàm lượng (mg/g khối lượng khô) số nhóm chất C.pumila Bảng 1.3 Định tính số hợp chất phân đoạn khác Cassia pumila Lamk Bảng 3.1 Kết tác dụng dọn gốc tự DPDH Bảng 3.2 Giá trị ức chế 50% (IC50) gốc tự DPDH mẫu thử chất đối chiếu Bảng 3.3 Kết tác dụng dọn gốc tự SOD Bảng 3.4 Giá trị ức chế 50% (IC50) gốc tự SOD mẫu thử chất đối chiếu Bảng 3.5 Dữ kiệu phổ NMR hợp chất TB6.4 Bảng 3.6 Dữ kiệu phổ NMR hợp chất TB3.5 Bảng 3.7 Dữ kiệu phổ NMR hợp chất TB12.10 Bảng 3.8 Tác dụng cao Muồng lùn hoạt độ AST huyết chuột lô nghiên cứu Bảng 3.9 Tác dụng cao Muồng lùn hoạt độ ALT huyết chuột lô nghiên cứu Bảng 3.10 Tác dụng cao Muồng lùn hoạt độ MDA huyết chuột lô nghiên cứu Bảng 3.11 Tác dụng cao Muồng lùn hoạt độ GSH dạng khử huyết chuột lô nghiên cứu Bảng 3.12 Tác dụng cao Muồng lùn hoạt độ SOD huyết chuột lô nghiên cứu Trang 11 12 29 29 31 32 37 39 41 42 44 45 47 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Cây muồng lùn thực địa 10 Hình 1.2 Senosid A 13 Hình 1.3 Senosid B 13 Hình 1.4 Senosid C 13 Hình 1.5 Senosid D 13 Hình 1.6 Rhein-8-O- glycoside 13 Hình 1.7 Chrysophanol 14 Hình 1.8 Emodin 14 Hình 1.9 Physcion Hình 1.10 1- Hentriacontanol 14 14 Hình 1.11 1- Hexacosanol 14 Hình 1.12 1- tetratriacontanol 14 Hình 1.13 Kaempferol-7-O- glucosid 15 Hình 1.14 Quercetin Hình 1.15 Kaempferol 15 Hình 1.16 β –sitosteron 15 Hình 1.17 Lanosterol 15 Hình 1.18 Campesterol 16 Hình 1.19 β –stigmasterol 16 Hình 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn lồi Chamaecrista pumila Lamk 20 Hình 3.1 Sơ đồ phân lập chất từ lồi Chamaecrista pumila Lamk Hình 3.2 Sắc ký hợp chất TB6.4, TB3.5, TB12.10 34 Hình 3.3 Liquiritigenin 38 Hình 3.4 Luteolin 40 Hình 3.5 (-)- festidinol 42 15 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều điều kiện thuận lợi cho hệ sinh vật phát triển, tạo hệ thực vật phong phú đa dạng.Trong số có nhiều dược liệu quý sử dụng Tuy nhiên nhiều thuốc sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa nghiên cứu hay nghiên cứu cách đầy đủ Vì việc nghiên cứu cỏ dùng làm thuốc điều cần thiết góp phần tạo sở khoa học cho việc sử dụng thuốc điều trị bệnh Cùng với phát triển xã hội đại gia tăng bệnh tật đặc biệt bệnh hiểm nghèo Bắt đầu vào năm 1950, nhà khoa học tập trung nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh như: suy tim, đột quỵ, bệnh lý tim mạch, tiểu đường, viêm gan, viêm khớp… đặc biệt bệnh ung thư ngày phổ biến gia tăng nhanh chóng, điều kiện sống ngày nâng cao Với hỗ trợ phương tiện kỹ thuật đại nhà khoa học chứng minh ngun nhân gây bệnh “gốc tự do” Trong Y học đại có nhiều nghiên cứu phương pháp loại bỏ gốc tự Nhưng tính an tồn thuốc có nguồn gốc từ dược liệu nên việc nghiên cứu tìm nguồn dược liệu dùng làm thuốc có tác dụng chống gốc tự việc cần thiết Muồng lùn (còn gọi Me đất) có tên khoa học Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen (tên đồng danh Cassia pumila Lam., Cassia prostrata Roxb Hay Senna prostrata Roxb.), họ Đậu (Fabaceae) [1], [6] Cây mọc hoang nhiều nơi Hà Tây, Ninh Bình, Thanh Hóa, Gia Lai, Đắc Lắc, Đồng Nai… Hiện nay, theo kinh nghiệm dân gian thường dùng phần mặt đất Muồng lùn đun nước uống giúp mát gan, giải độc 45 Pan Xuan, Kong Ling-Dong, et al (2000), "In vitro inhibition of rat monoamine oxidase by liquiritigenin and isoliquiritigenin isolated from Sinofranchetia chinensis", Acta pharmacologica Sinica, 21(10), pp 949-953 46 Pari L, Latha M (2002), "Effect of Cassia auriculata flowers on blood sugar levels, serum and tissue lipids in streptozotocin diabetic rats", Singapore Med J, 43(12), pp 617-621 47 Payasi A Chaudhary M., Singh B.M et al., (2010), "Sub-Acute Toxicity Studies of Paracetamol Infusion in Albino Wistar", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research, 2(2), pp 142-145 48 Rani Meena, Kalidhar SB (1999), "A New Anthraquinone Derivative from Cassia fistula Linn Pods", ChemInform, 30(25), pp 49 Rastogi Ram P, Mehotra BN (1990), "Compendium of Indian medicinal plants: volume 1960-1969", Drug research Perspectives, 10, pp 50 Roopashree TS, Dang Raman, et al (2008), "Antibacterial activity of antipsoriatic herbs: Cassia tora, Momordica charantia and Calendula officinalis", International Journal of Applied Research in Natural Products, 1(3), pp 20-28 51 Sadique J, Chandra T, et al (1987), "Biochemical modes of action of Cassia occidentalis and Cardiospermum halicacabum in inflammation", Journal of ethnopharmacology, 19(2), pp 201-212 52 Saganuwan Gulumbe (2006), "Evaluation of in-vitro antimicrobial activities and phytochemical constituents of Cassia occidentalis", Animal Research International, 3(3), pp 566-569 53 Saito Chieko, Lemasters John J, et al (2010), "c-Jun N-terminal kinase modulates oxidant stress and peroxynitrite formation independent of inducible nitric oxide synthase in acetaminophen hepatotoxicity", Toxicology and applied pharmacology, 246(1-2), pp 8-17 66 54 Saito Shizuka, Okamoto Yasuko, et al (2004), "Effects of alcoholic solvents on antiradical abilities of protocatechuic acid and its alkyl esters", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 68(6), pp 1221-1227 55 Sharma BL, Singh DAULAT, et al (2013), "Studies on some primary metabolite’s extraction and quantification in different plant parts of selected cassia species", Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 6(2), pp 309-314 56 Sharma RA, Singh Daulat, et al (2012), "Phytochemical evaluation and quantification of primary metabolites of Cassia pumila Lamk", Nature and Science, 10(2), pp 25-28 57 Sharma Ram Avtar, Bhardwaj Richa, et al (2012), "Antimicrobial activity of sennosides from Cassia pumila Lamk", Journal of Medicinal Plants Research, 6(19), pp 3591-3595 58 Singh Daulat, Sharma Santosh K, et al (2012), "Screening of Some Glycosidic Flavonoids and their Anti Microbial Activity of Cassia Pumila Lamk", Asian Journal of Research in Chemistry, 5(2), pp 305-311 59 Southon IW, Bisby FA, et al (1994), "Phytochemical dictionary of the Leguminosae Volume Plants and their constituents", pp 166 60 Spolarics Zoltán, Meyenhofer Markus (2000), "Augmented resistance to oxidative stress in fatty rat livers induced by a short-term sucrose-rich diet", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 1487(2), pp 190-200 61 Stroev EA, Makarova VG (1989), "Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory", Laboratory manual in biochemistry, pp 243-256 62 Suresh G, Tiwari Ashok K, et al (2012), "New advanced glycation end-products inhibitors from Dichrostachys cinerea Wight & Arn", Journal of natural medicines, 66(1), pp 213-216 67 63 Tiwari HP, Misra M (1993), "Phytochemical investigation of Cassia- glauca Bank.", Jounal of the Indian chemical society, 70(7), pp 653-653 64 Upadhyaya SK, Singh V (1986), "Phytochemical evaluation o fCassia obtusifolia L and Cassia tora L", Proceedings: Plant Sciences, 96(4), pp 321-326 65 Yadav A, Bhardwaj R, et al (2014), "Isolation, quantification and antimicrobial activities of phytosterols from different parts of Cassia pumila lamk", Int J Pharm, 4, pp 86-92 66 Zhu Licai, Yu Shujuan, et al (2008), "Preparative separation and purification of five anthraquinones from Cassia tora L by high-speed countercurrent chromatography", Separation and Purification Technology, 63(3), pp 665-669 67 Koh P H., Mokhtar R A., et al (2012), "Antioxidant potential of Cymbopogon citratus extract: alleviation of carbon tetrachloride-induced hepatic oxidative stress and toxicity", Hum Exp Toxicol, 31(1), pp 81-91 68 Takada Y., Noguchi T., et al (1982), "Superoxide dismutase in various tissues from rabbits bearing the Vx-2 carcinoma in the maxillary sinus", Cancer Res, 42(10), pp 4233-5 69 Wasowicz W., Neve J., et al (1993), "Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage", Clin Chem, 39(12), pp 2522-6 68 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Phổ 1H NMR, 13C NMR , DEPT Liquiritigenin Hình 6.1 Phổ 1H NMR hợp chất TB6.4 69 Hình 6.2 Phổ 13CNMR hợp chất TB6.4 70 Hình 6.3 Phổ DEPT hợp chất TB6.4 71 PHỤ LỤC 2: Phổ Phổ 1H NMR, 13C NMR , DEPT Luteolin Hình 6.4 Phổ 1H NMR hợp chất TB3.5 72 Hình 6.5 Phổ 13CNMR hợp chất TB3.5 73 Hình 6.6 Phổ DEPT hợp chất TB3.5 74 PHỤ LỤC 3: Phổ Phổ 1H NMR, 13C NMR , HSQC (-)-Festidinol Hình 6.7 Phổ 1H NMR hợp chất TB12.10 75 Hình 6.8 Phổ 13CNMR hợp chất TB12.10 76 Hình 6.9 Phổ HSQC hợp chất TB12.10 77 PHỤ LỤC 2: Phiếu giám định tên khoa học mẫu Mng lùn thu hái Hòa Bình 78 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BẢN TRÍCH YẾU LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Minh Hằng Khóa: CH21 Chuyên ngành: Dược liệu-Dược học cổ truyền Mã số: 60720406 Tên đề tài: " Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa đánh giá tác dụng bảo vệ gan Muồng lùn Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen” Tên sở đào tạo: Trường Đại học Dược Hà Nội Mục đích đối tượng nghiên cứu 1.1 Mục đích - Xác định số thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa Muồng lùn - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao toàn phần cao phân đoạn EtOAc chiết xuất từ Muồng lùn 1.2 Đối tượng nghiên cứu - Phần mặt đất Muồng lùn Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen - Nơi thu hái: Lạc Sơn - Hòa Bình Thời điểm: 9/2016 Phương pháp nghiên cứu sử dụng 2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu - Phần mặt đất Muồng lùn : sấy khô, nghiền nhỏ, chiết xuất dung môi EtOH 800 nhiệt độ thường Gộp, cô dịch chiết cao toàn phần EtOH - Từ cao toàn phần EtOH, lắc với dung mơi hữu có độ phân cực tăng dần (n – hexan, Dicloromethan, EtOAc, n-butanol), cô cất quay, sấy khô, thu cao phân đoạn 2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học - Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phương pháp dọn gốc tự DPDH SOD từ cao tổng cao phân đoạn muồng lùn - Phân lập hợp chất phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa tốt sắc ký pha thuận, pha đảo Nhận dạng chất phân lập dựa thơng số lý hóa nhiệt độ chảy, số liệu phổ, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC 2.3 Nghiên tác dụng bảo vệ gan - Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cao tổng cao phân đoạn EtOAc, mơ hình gây độc gan paracetamol - Chuột nhắt trắng chia làm lô, cho uống nước cất, silymarin, cao toàn phần cao phân đoạn EtOAc: Với liều 250mg/kg, 500mg/kg , sau ngày gây độc gan paracetamol, sau 24 lấy máu xoang hốc mắt gan xác định số AST, ALT, MDA, GSH, SOD Kết kết luận 3.1 Kết - Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phương pháp dọn gốc tự phân đoạn dịch chiết muồng lùn: cao phân đoạn Ethyllacetat có khả chống oxy hóa tốt - Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ phân đoạn EtOAc TB6.4, TB12.10, TB3.5 xác định là: Liquiritigenin, (-)-Festidinol, Luteolin - Đánh tác dụng bảo vệ gan cao toàn phần cao phân đoạn EtOAc: Với liều 250mg/kg, 500mg/kg có tác dụng giảm hoạt độ AST, ALT, MDA; tăng hoạt độ GSH, SOD, nhiên khác lô chuột sử dụng cao phân đoạn EtOAc mức liều 500mg/kg có ý nghĩa thống kê, khác lô chuột sử dụng cao tồn phần cao phân đoạn EtOAc lại khơng có ý nghĩa thống kê Do tác dụng bảo vệ gan mơ hình tốt sử dụng cao phân đoạn EtOAc mức liều 500mg/kg 3.2 Kết luận - Cao phân đoạn ethylacetat có tác dụng chống oxy hóa invitro tốt - Chiết xuất, phân lập hợp chất từ phân đoạn EtOAc là: Liquiritigenin, (-)-Festidinol, Luteolin - Cao toàn phần cao phân đoạn EtOAc có tác dụng bảo vệ gan Tuy nhiên cao phân đoạn EtOAc mức liều 500mg/kg có tác dụng tốt kết tác dụng có ý nghĩa thống kê CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN HỌC VIÊN PGS TS Nguyên Mạnh Tuyển NCS ThS Vũ Thanh Bình Lê Minh Hằng ... sau: Nghiên cứu thành phần hoá học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa muồng lùn Chamaecrista pumila (Lam. ) K. Larsen Đánh giá tác dụng bảo vệ gan động vật thực nghiệm dịch chiết muồng lùn Chamaecrista. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY MUỒNG LÙN CHAMAECRISTA. .. gian việc sử dụng muồng lùn để chữa bệnh gan, tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa đánh giá tác dụng bảo vệ gan thực nghiệm muồng lùn với