BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐÀO TÚ ANH TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CLEISTANTOXIN PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI (CLEISTANTHUS TONKINENSIS) LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐÀO TÚ ANH TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CLEISTANTOXIN PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI (CLEISTANTHUS TONKINENSIS) LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đoàn Thị Mai Hƣơng NCS ThS Nguyễn Lâm Hồng HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đoàn Thị Mai Hƣơng - Viện Hóa Sinh Biển Việt Nam NCS.Ths Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên môn Kiểm Nghiệm Thuốc Độc Chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người trực tiếp hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô môn Kiểm Nghiệm Thuốc Độc Chất – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức giúp tơi áp dụng vào thực nghiệm để hồn thiện luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Lê Công Vinh anh chị trung tâm tiên tiến – Viện Hóa Sinh Biển Viện Hàn Lâm khoa học công nghệ Việt Nam, em Nguyễn Văn Hồng, Bùi Bích Phương sinh viên K68 – Trường Đại Học Dược Hà Nội hỗ trợ phối hợp với tơi q trình thực Những kinh nghiệm kỹ học hỏi góp phần giúp tơi thực nghiệm xác hơn, thực tế Cuối tơi xin kính chúc thầy, em dồi sức khoẻ thành công nghiệp Đồng kính chúc chú, anh chị Viện Hóa Sinh Biển ln mạnh khoẻ, đạt nhiều thành tựu công việc Trân trọng! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Ds Đào Tú Anh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thực vật Chà Chơi (Cleistanthus tonkinensis) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Sơ lược thực vật họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) 1.1.3 Sơ lược thực vật chi Cách Hoa (Cleistanthus) .3 1.1.3.1 Đặc điểm thực vật .3 1.1.3.2 Thành phần hóa học 1.1.3.3 Hoạt tính sinh học 1.1.4 Loài Cleistanthus tonkinensis 1.2 Hợp chất Cleistantoxin 1.2.1 Tính chất 1.2.2 Bộ liệu phổ cleistantoxin .5 1.2.3 Các nghiên cứu trước cleistantoxin .6 1.2.4 Một số nghiên cứu xác định tạp chất liên quan etoposid .7 1.3 Chất chuẩn quy trình thiết lập chuẩn 1.3.1 Khái niệm chất chuẩn đối chiếu 1.3.2 Phân loại chất đối chiếu hóa học .9 1.3.2.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (PCRS- chuẩn gốc) 1.3.2.2 Chất đối chiếu hóa học thứ cấp (SRCS-Chuẩn thứ cấp) 10 1.3.3 Tổng quan thiết lập chất chuẩn 10 1.4 Các kỹ thuật phân tích xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 13 1.4.1 Bản chất nguồn gốc tạp chất hoạt chất .13 1.4.2 Các kỹ thuật xác định tạp chất 14 1.4.2.1 Kỹ thuật xác định gián tiếp .14 1.4.2.2 Kỹ thuật xác định trực tiếp (phƣơng pháp tuyệt đối) 21 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .22 2.2.1 Nguyên liệu .22 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 22 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .23 2.2.1 Tinh chế xác định cấu trúc cleistantoxin phân lập từ Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) 23 2.2.2 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan HPLCDAD……………………………………………………………………………… 24 2.2.2.1 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 24 2.2.2.2 Thẩm định phƣơng pháp 24 2.2.3 Xác định hàm lượng tạp chất bay hơi, xác định hàm lượng tạp chất vô cơ, xác định độ tinh khiết chất đối chiếu nguyên liệu thiết lập chuẩn 25 2.2.3.1 Định lƣợng tạp chất bay 25 2.2.3.2 Xác định hàm lƣợng tạp chất vô 25 2.2.3.3 Xác định độ tinh khiết chất đối chiếu nguyên liệu thiết lập chuẩn 25 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 Tinh chế xác định cấu trúc cleistantoxin phân lập từ cao cồn Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) .27 3.1.1 Tinh chế cleistantoxin phân lập từ cao cồn Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) 27 3.1.1.1 Giai đoạn 1: Tách phân đoạn cao cồn (168 g) đƣợc chiết xuất từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis, Jabl.) cột tổng silicagel 27 3.1.1.2 Giai đoạn 2: Phân lập từ phân đoạn (6,5273 g) cột silicagel .28 3.1.1.3 Giai đoạn 3: Phân lập chất cleistantoxin (7B) từ dịch cột sephadex 29 3.1.1.4 Giai đoạn 4: Quy trình tinh chế cleistantoxin phƣơng pháp kết tinh 31 3.1.2 Xây dựng liệu nhận dạng cleistatoxin tinh chế 31 3.1.2.1 Tính chất: 31 3.1.2.2 Góc quay cực riêng: 31 3.1.2.3 Xác định nhiệt độ nóng chảy 31 3.1.2.4 Dự đoán giá trị pka cleistantoxin nguyên liệu thiết lập chuẩn phần mềm ChemBioOffice 2014 33 3.1.2.5 Bộ liệu phổ 33 3.2 Xây dựng phƣơng pháp xác định tạp chất liên quan nguyên liệu thiết lập chất chuẩn HPLC-DAD .42 3.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký .42 3.2.1.1 Khảo sát lựa chọn cột dung môi pha động 42 3.2.1.2 Lựa chọn bƣớc sóng phát 45 3.2.1.3 Khảo sát thể tích tiêm 47 3.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 48 3.2.2.1 Độ đặc hiệu 48 3.2.2.2 Độ phù hợp hệ thống 55 3.2.2.3 Giới hạn định lƣợng (LOQ) 57 3.2.2.4 Độ tuyến tính .58 3.2.2.5 Độ chụm 59 3.2.2.6 Độ ổn định dung dịch phân tích 64 3.3 Xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chuẩn .64 3.3.1 Xác định hàm lượng tạp bay phương pháp khối lượng làm khô…………… ………………………………………………………………… 64 3.4 Xác định độ tinh khiết phƣơng pháp quét nhiệt vi sai 67 3.5 Xây dựng tiêu chuẩn sở nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin …………………………………………………………………………….67 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 70 4.1 Tính ứng dụng: 70 4.2 Quy trình phân lập, tinh chế 70 4.3 Bộ nhận dạng cleistantoxin 70 4.4 Xây dựng phƣơng pháp xác định tạp chất liên quan HPLC-DAD 70 4.5 Xác định hàm lƣợng tạp bay tạp chất vô 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 KẾT LUẬN 73 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số điều kiện sắc ký xác định tạp chất liên quan etoposid Bảng 1.2: Ví dụ xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chuẩn 12 Bảng 1.3: Các phương pháp định lượng tạp chất liên quan 14 Bảng 1.4: Các tiêu cần thẩm định số quy trình phân tích 17 Bảng 1.5: Các phương pháp định lượng tạp bay 18 Bảng 1.6: Các phương pháp định lượng tạp vô 20 Bảng 2.1: Dung mơi hóa chất sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.1: Kết xác định nhiệt độ nóng chảy nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin DSC mao quản theo DĐVN V phụ lục 6.7 32 Bảng 3.2: Các đỉnh phổ IR đặc trưng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 34 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR nguyên liệu thiết lập chất chuẩn so với tài liệu công bố [28] 37 Bảng 3.4: Bộ liệu nhân dạng cleistantoxin 41 Bảng 3.5: Chương trình gradient 43 Bảng 3.6: Tối ưu hóa chương trình dung mơi (chương trình gradien 2) 44 Bảng 3.7: Khảo sát bước sóng 203 nm 286 nm 46 Bảng 3.8: Chương trình Gradien 48 Bảng 3.9: Kết thẩm định độ phù hợp hệ thống 56 Bảng 3.10: Độ lặp lại LOQ 57 Bảng 3.11: Kết khảo sát độ tuyến tính .58 Bảng 12: Kết thẩm định độ lặp lại 60 Bảng 3.13: Kết thẩm định độ xác trung gian 61 Bảng 3.14: Kết thẩm định độ tái lặp 62 Bảng 3.15: Kết đánh giá khác biệt phương sai phòng thí nghiệm 63 Bảng 3.16: Kết khảo sát độ ổn định dung dịch phân tích 64 Bảng 3.17: Kết định lượng tạp bay .65 Bảng 3.18: Kết định lượng tạp chất vô phương pháp tro sulphat 66 Bảng 3.19: Kết xác định độ tinh khiết cleistantoxin nguyên liệu thiết lập chuẩn 66 Bảng 3.20: Tiêu chuẩn sở nguyên liệu thiết lập chuẩn cleistantoxin 67 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo cleistantoxin Hình 1.2: Dữ liệu NMR cleistantoxin (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, CDCl3) Hình 1.3: Cấu trúc Cleistantoxin Etoposid….……………………………….8 Hình 3.1: Quy trình phân lập tinh chế cleistantoxin 30 Hình 3.2: Độ tinh khiết sắc ký cleistantoxin trước tinh chế 30 Hình 3.3: Độ tinh khiết sắc ký cleistantoxin sau tinh chế 31 Hình 3.4: Giản đồ nhiệt DSC xác định nhiệt độ nóng chảy nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistatoxin 32 Hình 3.5: Kết dự đoán pka cleistantoxin .33 Hình 3.6: Phổ IR cleistantoxin tài liệu công bố [28] 33 Hình 3.7: Phổ IR nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin .34 Hình 3.8: Phổ UV-VIS nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 35 Hình 3.9: Phổ HR-MS nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin .35 Hình 3.10: Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500MHz) nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 36 Hình 3.11: Phổ 13C-NMR (CDCl3, 500MHz) nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 36 Hình 3.12: Phổ 1H-1H COSY nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 39 Hình 3.13: Phổ HMBC nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin .39 Hình 3.14: Phổ NOESY nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 40 Hình 3.15: Phổ CD nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 41 Hình 3.16: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan tách khỏi cleistantoxin cột phenyl hệ pha động ACN: đệm acetat pH theo chương trình gradient 43 Hình 3.17: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin cột C18 hệ pha động ACN: Acid formic : Triethylamin : nước theo chương trình gradient 43 Hình 3.18: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin cột C18 hệ pha động ACN: nước theo chương trình gradient 44 Hình 3.19: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin cột C18 hệ pha động ACN: nước theo chương trình gradient 45 Hình 3.20: Phổ UV cleistantoxin tạp chất liên quan .46 Hình 3.21: Kết khảo sát thể tích tiêm 47 Hình 3.22: Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng cleistantoxin 1000 ppm 50 Hình 3.23: Xác định độ tinh khiết pic cleistantoxin 1000 ppm 50 Hình 3.24: Phổ 3D dung dịch cleistantoxin 1000 ppm 51 Hình 3.25: Sắc ký đồ dung dịch phân giải cleistonkinensis B - cleistantoxin cleistonkinensis A .52 Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180105000007.D Sample Name: Cleistantoxin 1000 ppm (do lap lai) Signal 1: DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % | -| | -| | | | 12.357 BV 0.2004 2.39767 1.43876e-1 5.829e-3 12.677 VB 0.2121 2.71708 1.52351e-1 6.606e-3 17.693 BB 0.2731 4.99802 2.19942e-1 0.0122 19.300 BB 0.4157 4.11112e4 1387.35327 99.9469 21.535 BB 0.2555 2.52514 1.19029e-1 6.139e-3 25.435 BB 0.4305 9.20086 2.51697e-1 0.0224 Totals : 4.11331e4 1388.24017 ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 3/21/2018 5:32:37 PM hong Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180105000008.D Sample Name: Cleistantoxin 1000 ppm (do lap lai) ===================================================================== Acq Operator : Hoang Acq Instrument : Instrument Location : Vial Injection Date : 1/5/2018 5:33:35 PM Inj Volume : 50.0 µl Acq Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG7B.M\HONG 7B- TAP LQ.M Last changed : 1/5/2018 5:22:58 PM by Hoang (modified after loading) Analysis Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG7B.M\HONG 7B- TAP LQ.M Last changed : 3/21/2018 5:31:10 PM by hong (modified after loading) Sample Info : Cleistantoxin 1000 ppm (do lap lai-1,07), v=1ml/p, V 50 mcL MP: ACN-H2O: 0' 30-70, 5' 30-70, 10' 50-50, 50' 70-30, 55' 30-70, end: 60' cot Inertsil ODS-3, 4,6x250mm, 5mcr Additional Info : Peak(s) manually integrated 19.273 DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off (HONG 7B_TAP LQ\180105000008.D) mAU 25.386 17.692 20.750 21.481 -2 -4 10 20 30 40 50 ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Sample Amount: : 1.00000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Instrument 3/21/2018 5:36:35 PM hong [ng/ul] (not used in calc.) Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180105000008.D Sample Name: Cleistantoxin 1000 ppm (do lap lai) Signal 1: DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % | -| | -| | | | 17.692 BV 0.3423 11.12222 4.15532e-1 0.0241 19.273 VV 0.4177 4.61329e4 1538.99036 99.9169 20.750 VB 0.2502 4.93947 2.43953e-1 0.0107 21.481 BB 0.2843 7.01733 3.05191e-1 0.0152 25.386 BB 0.4106 15.29818 4.64114e-1 0.0331 Totals : 4.61713e4 1540.41915 ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 3/21/2018 5:36:35 PM hong Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000003.D Sample Name: ClEISTANTOXIN 1000PPM 10,09 ===================================================================== Acq Operator : HONG Acq Instrument : Instrument Location : Vial Injection Date : 3/8/2018 11:20:20 AM Inj Volume : 30.0 µl Acq Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG7B.M\HONG 7B- TAP LQ.M Last changed : 3/8/2018 11:57:16 AM by HONG (modified after loading) Analysis Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG 16A- TAP LQ.M Last changed : 3/21/2018 4:14:41 PM by hong (modified after loading) Sample Info : ClEISTANTOXIN 1000PPM 10,09, 0' ACN:H2O 30: 70 > 20' 50:50 50' 70:30 55' 30:70 STOP 60', V= 30UL ,v = 1,5 ML /PHUT Additional Info : Peak(s) manually integrated 20.874 DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off (HONG 7B_TAP LQ\180308000003.D) mAU 29.078 18.528 23.004 23.468 -2 -4 10 20 30 40 50 ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Sample Amount: : 1.00000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Instrument 3/21/2018 4:14:45 PM hong [ng/ul] (not used in calc.) Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000003.D Sample Name: ClEISTANTOXIN 1000PPM 10,09 Signal 1: DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % | -| | -| | | | 18.528 BB 0.1661 2.04039 1.56522e-1 0.0132 20.874 BB 0.2028 1.54625e4 1196.54309 99.9471 23.004 BB 0.1743 1.40820 1.09272e-1 9.102e-3 23.468 BB 0.1767 2.06857 1.56030e-1 0.0134 29.078 BB 0.2062 2.65989 1.86682e-1 0.0172 Totals : 1.54707e4 1197.15160 ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 3/21/2018 4:14:45 PM hong Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000004.D Sample Name: ClEISTANTOXIN 1000PPM 10,17 ===================================================================== Acq Operator : HONG Acq Instrument : Instrument Location : Vial Injection Date : 3/8/2018 12:24:16 PM Inj Volume : 30.0 µl Acq Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG7B.M\HONG 7B- TAP LQ.M Last changed : 3/8/2018 12:22:04 PM by HONG (modified after loading) Analysis Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG 16A- TAP LQ.M Last changed : 3/21/2018 4:14:41 PM by hong (modified after loading) Sample Info : ClEISTANTOXIN 1000PPM 10,17, 0' ACN:H2O 30: 70 > 20' 50:50 50' 70:30 55' 30:70 STOP 60', V= 30UL ,v = 1,5 ML /PHUT Additional Info : Peak(s) manually integrated 20.857 DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off (HONG 7B_TAP LQ\180308000004.D) mAU 29.044 22.944 23.444 18.506 -2 -4 10 20 30 40 50 ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Sample Amount: : 1.00000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Instrument 3/21/2018 4:18:31 PM hong [ng/ul] (not used in calc.) Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000004.D Sample Name: ClEISTANTOXIN 1000PPM 10,17 Signal 1: DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % | -| | -| | | | 18.506 BB 0.1655 2.00171 1.60502e-1 0.0129 20.857 BB 0.1987 1.55090e4 1216.79749 99.9507 22.944 BB 0.1536 1.05982 8.98452e-2 6.830e-3 23.444 BB 0.1687 2.13203 1.62942e-1 0.0137 29.044 BB 0.1732 2.45953 1.80202e-1 0.0159 Totals : 1.55166e4 1217.39098 ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 3/21/2018 4:18:31 PM hong Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000005.D Sample Name: CLEISTANTOXIN 1000ppm ===================================================================== Acq Operator : HONG Acq Instrument : Instrument Location : Vial Injection Date : 3/8/2018 1:30:34 PM Inj Volume : 30.0 µl Acq Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG7B.M\HONG 7B- TAP LQ.M Last changed : 3/8/2018 1:44:33 PM by HONG (modified after loading) Analysis Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG 16A- TAP LQ.M Last changed : 3/21/2018 4:14:41 PM by hong (modified after loading) Sample Info : CLEISTANTOXIN 1000ppm (12.39) , ACN:H2O 0' 30:70 20' 50 :50 50' 70:30 55 30:70 STOP 60' v = 1,5 ML/P V = 30 uL Additional Info : Peak(s) manually integrated 20.665 DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off (HONG 7B_TAP LQ\180308000005.D) mAU 28.784 18.301 22.704 23.221 -2 -4 10 20 30 40 50 ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Sample Amount: : 1.00000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Instrument 3/21/2018 4:22:09 PM hong [ng/ul] (not used in calc.) Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000005.D Sample Name: CLEISTANTOXIN 1000ppm Signal 1: DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % | -| | -| | | | 18.301 BB 0.1734 2.46201 1.94808e-1 0.0151 20.665 BB 0.1986 1.62425e4 1275.29883 99.9353 22.704 BB 0.1770 1.88580 1.36643e-1 0.0116 23.221 BB 0.1812 2.15425 1.73135e-1 0.0133 28.784 BB 0.2170 4.01006 2.55692e-1 0.0247 Totals : 1.62530e4 1276.05911 ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 3/21/2018 4:22:09 PM hong Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000006.D Sample Name: CLEISTANTOXIN 1000ppm ===================================================================== Acq Operator : HONG Acq Instrument : Instrument Location : Vial Injection Date : 3/8/2018 2:33:47 PM Inj Volume : 30.0 µl Acq Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG7B.M\HONG 7B- TAP LQ.M Last changed : 3/8/2018 2:32:13 PM by HONG (modified after loading) Analysis Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG 16A- TAP LQ.M Last changed : 3/21/2018 4:14:41 PM by hong (modified after loading) Sample Info : CLEISTANTOXIN 1000ppm (12.35) , ACN:H2O 0' 30:70 20' 50 :50 50' 70:30 55 30:70 STOP 60' v = 1,5 ML/P V = 30 uL Additional Info : Peak(s) manually integrated 20.618 DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off (HONG 7B_TAP LQ\180308000006.D) mAU 22.621 23.169 18.229 28.759 -2 -4 10 20 30 40 50 ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Sample Amount: : 1.00000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Instrument 3/21/2018 4:26:34 PM hong [ng/ul] (not used in calc.) Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000006.D Sample Name: CLEISTANTOXIN 1000ppm Signal 1: DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % | -| | -| | | | 18.229 BB 0.2494 4.98590 2.49274e-1 0.0307 20.618 BB 0.2008 1.62419e4 1273.24731 99.9295 22.621 BB 0.1968 2.02599 1.40032e-1 0.0125 23.169 BB 0.1493 1.69544 1.50703e-1 0.0104 28.759 BB 0.1818 2.75111 2.20171e-1 0.0169 Totals : 1.62534e4 1274.00750 ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 3/21/2018 4:26:34 PM hong Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000007.D Sample Name: CLEISTANTOXIN 1000ppm ===================================================================== Acq Operator : HONG Acq Instrument : Instrument Location : Vial Injection Date : 3/8/2018 3:36:57 PM Inj Volume : 30.0 µl Acq Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG7B.M\HONG 7B- TAP LQ.M Last changed : 3/8/2018 3:35:23 PM by HONG (modified after loading) Analysis Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG 16A- TAP LQ.M Last changed : 3/21/2018 4:14:41 PM by hong (modified after loading) Sample Info : CLEISTANTOXIN 1000ppm (10.35) , ACN:H2O 0' 30:70 20' 50 :50 50' 70:30 55 30:70 STOP 60' v = 1,5 ML/P V = 30 uL Additional Info : Peak(s) manually integrated 20.664 DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off (HONG 7B_TAP LQ\180308000007.D) mAU 28.790 22.679 23.227 18.290 -2 -4 10 20 30 40 50 ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Sample Amount: : 1.00000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Instrument 3/21/2018 4:29:40 PM hong [ng/ul] (not used in calc.) Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000007.D Sample Name: CLEISTANTOXIN 1000ppm Signal 1: DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % | -| | -| | | | 18.290 BB 0.1937 3.08781 2.47253e-1 0.0164 20.664 BB 0.2010 1.88138e4 1472.87378 99.9390 22.679 BB 0.1746 2.03600 1.59863e-1 0.0108 23.227 BB 0.1742 2.64287 2.19897e-1 0.0140 28.790 BB 0.1971 3.71289 2.82889e-1 0.0197 Totals : 1.88253e4 1473.78368 ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 3/21/2018 4:29:40 PM hong Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000008.D Sample Name: CLEISTANTOXIN 1000ppm ===================================================================== Acq Operator : HONG Acq Instrument : Instrument Location : Vial Injection Date : 3/8/2018 4:42:20 PM Inj Volume : 30.0 µl Acq Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG7B.M\HONG 7B- TAP LQ.M Last changed : 3/8/2018 4:38:34 PM by HONG (modified after loading) Analysis Method : D:\CHEM32\1\METHODS\HONG 16A- TAP LQ.M Last changed : 3/21/2018 4:14:41 PM by hong (modified after loading) Sample Info : CLEISTANTOXIN 1000ppm (10.31) , ACN:H2O 0' 30:70 20' 50 :50 50' 70:30 55 30:70 STOP 60' v = 1,5 ML/P V = 30 uL Additional Info : Peak(s) manually integrated 20.651 DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off (HONG 7B_TAP LQ\180308000008.D) mAU 28.791 18.263 22.684 23.195 -2 -4 10 20 30 40 50 ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Sample Amount: : 1.00000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Instrument 3/21/2018 4:32:51 PM hong [ng/ul] (not used in calc.) Page of Data File D:\CHEM32\1\DATA\HONG 7B_TAP LQ\180308000008.D Sample Name: CLEISTANTOXIN 1000ppm Signal 1: DAD1 A, Sig=286,8 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % | -| | -| | | | 18.263 BB 0.1747 2.41957 2.12721e-1 0.0126 20.651 BB 0.1986 1.91462e4 1502.73572 99.9341 22.684 BB 0.1657 1.94550 1.60236e-1 0.0102 23.195 BB 0.2072 4.13485 2.88508e-1 0.0216 28.791 BB 0.2052 4.12312 3.06069e-1 0.0215 Totals : 1.91588e4 1503.70325 ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 3/21/2018 4:32:51 PM hong Page of ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐÀO TÚ ANH TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CLEISTANTOXIN PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI (CLEISTANTHUS TONKINENSIS) LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT... xác định độ tinh khiết cleistantoxin phân lập từ Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn" thực với mục tiêu: 1) Tinh chế xây dựng liệu nhận dạng cleistatoxin phân. .. minh họa cho việc xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chất chuẩn theo hướng dẫn WHO trình bày bảng 1.2 [32] 11 Bảng 1.2: Ví dụ xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chuẩn Thành phần