BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu phân lập sử dụng số dòng Trichoderma để sản xuất phân hữu vi sinh từ bùn thải sinh học trình sản xuất thực phẩm Họ tên sinh viên : NGÔ THANH PHÚC Ngành : CÔNG NGHỆ HĨA HỌC Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 08 năm 2011 LỜI CÁM ƠN Em xin chân thành cám ơn thầy Phan Phước Hiền tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đề tài Em xin chân thành cám ơn cô Trần Minh Hiền, người hướng dẫn trực tiếp, truyền đạt kiến thức giúp em thực tốt đề tài này, em xin chân thành cám ơn tồn thể anh chị phòng Nơng hóa- Thổ nhưỡng, Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp miền Nam nhiệt tình hướng dẫn, giúp em hoàn thành đề tài Em xin chân thành cám ơn: Quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm TPHCM, q thầy mơn Cơng nghệ Hóa học tận tình hướng dẫn, dạy dỗ em năm học vừa qua Tp.HCM tháng năm 2011 Sinh Viên Ngơ Thanh Phúc i TĨM TẮT Đề tài “Nghiên cứu phân lập sử dụng số dòng Trichoderma để sản xuất phân hữu vi sinh từ bùn thải sinh học trình sản xuất thực phẩm” Sinh viên thực : Ngô Thanh Phúc Đơn vị : Lớp DH07HH, Bộ mơn Cơng nghệ Hóa, Đại Học Nơng Lâm TPHCM Thời gian từ : tháng 03 đến tháng 08/2011 Địa điểm : Phòng Hóa Nơng Thổ Nhưỡng, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, Địa 121, Nguyễn Bỉnh Khiêm, P.Đa Cao, Q1 TP Hồ Chí Minh Kết thu được:  Tìm chủng nấm Trichoderma  Tuyển chọn chủng nấm tốt để sản xuất phân hữu  Tìm CT phối trộn tốt để sản xuất phân hữu  Thử nghiệm thành công việc trồng cải giá thể CT  Giải vấn đề ô nhiễm môi trường ii SUMMARY Project “ research on subdivide and use some of Trichodermas to produce organic fertilizer from sewage sludge microbial biology which create from process of food production” Student performs: Ngo Thanh Phuc Unit: Class DH07HH, Department of Chemical Technology, Nong Lam University TPHCM Duration: from March to Augest/2011 Location: Department of Soil Chemistry and Agriculture, Institute of Southern Agriculture Science Address: 121 Nguyen Binh Khiem, Da Cao ward, District No.1, HCM city  09 strains of Trichoderma funguses were found out  Selection of the best fungal strains to produce organic fertilizer  The best formula for mixing to produce organic fertilizer was found out  Successful test in growing vegetables  Environment pollution was solved iii MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii BẢNG VÀ HÌNH ẢNH viii Chương I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Cơ sở khoa học đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học .1 1.5 Ý nghĩa thực tiễn Chương II TỔNG QUAN 2.1 Đại Cương Về Cellulose 2.1.1 Vị trí quan trọng cellulose 2.1.2 Cấu trúc đặc tính cellulose 2.1.3 Hệ enzyme cellulose 2.1.4 Cơ chế tác động 2.1.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên sinh tổng hợp cellulase vi sinh vật.6 2.1.6 Đại Cương Về Vi Sinh Vật Phân Giải Cellulose 2.2 Giới thiệu nấm Trichoderma 2.2.1 Vị trí phân loại 2.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10 2.2.3 Các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm sợi 11 2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma 11 2.3.1 Các nghiên cứu nước .11 2.3.2 Các nghiên cứu nước 12 2.4 Khái niệm phân bón hữu phân bón hữu vi sinh 12 2.4.1 Phân bón hữu 12 iv 2.4.2 Phân bón hữu vi sinh 13 2.5 Vai trò phân bón hữu sinh học, hữu vi sinh sản xuất nông nghiệp giới 14 2.6 Khái niệm ủ chất thải mùn .14 2.6.1 Quá trình ủ chất thải (composting) 14 2.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình ủ chất thải 15 2.7 Các loại bùn thải 16 2.8 Hàm lượng hữu cơ, dinh dưỡng bùn thải hữu 17 Chương III 18 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Nội dung nghiên cứu 18 3.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu .18 3.2.1 Thời gian 18 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 18 3.3 Vật liệu .18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Nội dung 1: Phân lập tuyển chọn đánh giá hoạt tính Trichoderma.20 3.4.2 Nội dung 2: Sơ chế cơng thức chất mang BBS + MXD + VSV .21 3.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất phân VS phân hữu VS .27 Chương IV 29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Một số tiêu hóa học mạt dừa bã bùn sữa trước trình xử lý 29 4.2 Kết phân lập nấm Trichoderma .30 4.3 Sơ định danh chủng nấm trichoderma .31 4.4 Một số tiêu theo dõi đống ủ qua trình xử lý sơ 36 4.4.1 Chỉ tiêu pH đóng ủ sau xử lý sơ .36 4.4.2 Sự thay đổi nhiệt độ trình ủ sơ chế 37 4.4.3 Tỷ lệ C/N% đống ủ đầu kết thúc xử lý 38 4.4.4 Đánh giá độ chín đống ủ (bằng Phương pháp plantest) 40 4.5 Kiểm tra mật độ nấm Trichoderma sp Trong chế phẩm phân VS .41 Chương V 43 v KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận: 43 5.2 Đề nghị: 43 PHỤ LỤC 46 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT MT Môi Trường BBS Bã Bùn Sữa MXD Mụn Xơ Dừa VS Vi Sinh VSV Vi Sinh Vật N_ts N tổng số P O _hh P O hữu hiệu K O_ts K O tổng số CT Công Thức CTTU Công Thức Tối Ưu BDU Bắt Đầu Ủ KTU Kết Thúc Ủ HCVS Hữu Cơ Vi Sinh Ctv Cộng tác viên HCVS1 phân hữu vi sinh ủ với chế phẩm khử trùng HCVS2 Phân hữu vi sinh ủ với chế phẩm không khử trùng vii BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Hình Cấu trúc hóa học cellulose Hình Cấu trúc khơng gian ba chiều cellulose Hình 2.1 Khuẩn ty quan sinh bào tử ( Gary, 2004) 11 Hình 2.2 Sợi nấm phát triển môi trường PDA 11 Bảng1 Một số tiêu hóa học mạt dừa bã bùn sữa ban đầu 31 Bảng 2.0 Khả phân giải CMC Trichoderma 32 Bảng 2.1 Mô tả chủng nấm phân lập 37 Bảng 2.2 pH đóng ủ sau 21 ngày 38 Bảng 2.3 Nhiệt độ đống ủ 39 Bảng 2.4 Kết phân tích tiêu C N 40 Bảng 2.5 Trọng lượng cải tươi thu hoạch sau ngày gieo 42 Bảng 2.6 Mật độ nấm sau 30 ngày ủ 43 Bảng 2.7 Mật độ nấm sau ngày ủ 44 Đồ Thị pH đống ủ đầu kết thúc xử lý sơ 38 Đồ thị 2.2 tỷ lệ C/N đống ủ điểm thời bắt đầu ủ kết thúc ủ 40 viii Chương I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Như biết, Việt Nam dù bước đường công nghiệp hóa, nước nơng nghiệp với 75% nông dân, nên nhu cầu sử dụng phân bón thuốc bảo vệ thực vật lớn Xu hướng sử dụng phân bón hóa học tăng nhanh điều tất yếu để bảo đảm lương thực phẩm cho nhân loại Tuy nhiên việc lạm dụng phân hóa học làm cho môi trường ngày ô nhiễm, làm đất đai bị suy thoái, hàm lượng dư chất độc tố tăng sau nhiều năm sử dụng, Thực trạng phổ biến phạm vi toàn cầu nghiêm trọng nước phát triển Trước vấn đề vừa đảm bảo cung cấp nguồn lương thực, vừa trì cải thiện độ phì nhiêu đất đồng thời không ngừng nâng cao chất lượng nông sản, tăng hiệu kinh tế thân thiện với môi trường Vì cơng nghiệp giới mở theo hướng kết hợp nơng nghiệp thâm canh cao với nông nghiệp hữu mà hạt nhân ứng dụng công nghệ sinh học Hiện ứng dụng công nghệ vi sinh để sản xuất phân bón tạo hướng chiến lược quản lý dinh dưỡng trồng Các nhà khoa học, nhà kinh doanh nông dân quan tâm đến việc sử dụng vi sinh vật có sẵn tự nhiên nhằm biến đổi loại phế phẩm để sản xuất chế phẩm, phân bón vi sinh phục vụ cho nông nghiệp Xuất phát từ sở khoa học giống nấm mốc Trichoderma vi sinh vật có khả phân giải chất hữu đất nên ứng dụng nhiều công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Việt Nam nước đà cơng nghiệp hóa đại hóa đất nước nên bùn thải trình sản xuất lớn, nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên thành phần bùn thải qua xử lý sơ chất thải có chứa lượng lớn chất dinh dưỡng thích hợp làm phân vi sinh Vì tận dụng bùn thải sinh học để sản xuất phân vi sinh hữu công ty sản xuất thực phẩm 4.4.4 Đánh giá độ chín đống ủ (bằng Phương pháp plantest) Bảng 2.5 Trọng lượng cải tươi thu hoạch sau ngày gieo Trọng lượng cải tươi (g) Cơng thức thí nghiệm R1 R2 R3 R4 TB 100% Bùn sữa + 10% Vôi + Nấm 6,8 8,02 7,2 5,8 6,955 100% Mạt dừa +10% Vôi + Nấm 20,27 22,45 23,08 19,88 21,42 23,93 25,08 26,01 25,02 25,01 26,43 28,89 27,73 29,05 28,025 21,66 22,85 23,06 20,43 22 60% Bùn sữa + 40% Mạt dừa +10% Vôi + Nấm 50% bùn sữa + 50% Mạt dừa + 10% Vôi + Nấm 40% Bùn sữa + 60% Mạt dừa +10% Vôi + Nấm Xử lý thống kê GEN-STAT: Khác biệt công thức F pr : < 0,001 Khác biệt tỷ lệ phối trộn BBS MXD F pr : < 0,001 LSD(0.05) 1,787 CV% 5,7 Kết thúc thí nghiệm (ủ sau 30 ngày), tiến hành kiểm tra chất lượng mẫu ủ phương pháp plantest nhận thấy: Giữa cơng thức thí nghiệm cho trọng lượng cải tươi có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,001 Tỷ lệ phối trộn bã bùn sữa mụn xơ dừa có mối tương tác ảnh hưởng đến trọng lượng tươi cải thu hoạch (thu hoạch sau gieo hạt bảy ngày) có ý nghĩa thống kê mức 0,001 Từ kết Bảng 2.5 cho thấy trọng lượng cải tươi công thức 3, tương đương nhau, nhiều CT4, trọng lượng trung bình cải tươi 28,025g Cơng thức chọn để tiếp tục xử lý tiếp, nhiên chọn công thức để tiếp tục xử lý điều kiện thí nghiệm, vùng nguyên liệu cách xa để giảm chi phí vận chuyển nên chọn giảm 40 tỷ lệ bã bùn sữa mùi nghiệm thức nồng bùn sữa, chọn công thức để tiếp tục thí nghiệm Như qua kết ban đầu cho thấy hàm lượng cellulose lignin có giảm cao, trồng phát triển tốt Vì tỷ lệ phối trộn cơng thức làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu 4.5 Kiểm tra mật độ nấm Trichoderma sp chế phẩm phân VS Để tạo điều kiên thuân lợi cho trình ủ phân hữu vi sinh tiếp theo, xác mật độ nấm Trichoderma chất mang khử trùng không khử trùng CT4 phân VS sau 30 ngày ủ Bảng 2.6 Mật độ nấm sau 30 ngày ủ Lần lặp lại Mật độ nấm Trichoderma/g chế phẩm Chất mang KT Chất mang KKT 1,6.108 2,8.106 1,4.108 3,6.106 1,8.108 2,8.106 1,2.108 1,8.106 Từ kết cho thấy : chất mang khác mật độ nấm Trichoderma sp có khác biệt lớn, từ cho ta biết chất mang khử trùng loại bỏ hoàn toàn yếu tố tạp nhiễm, nấm mốc từ nấm Trichoderma sp sinh trưởng phát triễn tốt chất mang không khử trùng, không bị cạnh tranh dinh dưỡng Tuy nhiên chất mang không khử trùng nấm Trichoderma phát triển tốt, đạt đến 106/g Vì ta chọn hai chế phẩm hai chất mang tiếp tục phối trộn với CT4 để sản xuất phân hữu vi sinh 4.6 Kiểm tra tiêu phân hữu vi sinh 4.6.1 Kiểm tra mật độ nấm Trichoderma sp củaphân hữu vi sinh Mật độ nấm Trichoderma phân hữu vi sinh ủ với chế phẩm khử trùng không khử trùng sau ngày ủ (CFU/g phân hữu vi sinh) 41 Bảng 2.7 Mật độ nấm sau ngày ủ (CFU/g) STT HCVS1 HCVS2 2.106 1,2.104 Từ kết cho thấy mật độ nấm Trichoderma mọc công thức HCVS1 nhiều gần 100 lần so với HCVS2 , HCVS1 đạt tiêu chuẩn phân hữu vi sinh Muốn sản xuất phân hữu vi sinh thành công (theo tỷ lệ 1:20) mật độ men giống phải > 108 4.6.2 Ẩm độ phân hữu vi sinh sau ngày ủ TT Khối lượng mẫu Tổng lượng nước Ẩm độ phân bay HCVS1 20,03 6,46 32,25 HCVS2 20,01 6,84 34,2 Từ kết độ ẩm cho thấy ẩm độ đạt tiêu chuẩn phân hữu vi sinh (TCVN 7185 : 2002) 4.6.3 pH phân hữu vi sinh sau ngày ủ Bảng 2.7 pH phân hữu vi sinh sau ngày ủ Mẫu Lần Lần HCVS1 7.79 7.98 HCVS2 7.85 7.81 Từ kết đo pH cho thấy thỏa điều kiện làm phân hữu vi sinh tiêu chuẩn TCVN 7185 : 2002 4.6.4 Chỉ tiêu Salmonella 25g mẫu phân hữu vi sinh Không phát salmonella 25g mẫu HCVS1 HCVS2 (kiểm nghiệm viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam) 42 Chương V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận: Sau tháng làm đề tài đạt kết luận ban đầu sau:  Đã phân lập, mơ tả hình thái định danh sơ chủng nấm Trichoderma có hoạt lực phân giải cellulose cao từ mụn sơ dừa, đất, chế phẩm phân bón thị trường  Tuyển chọn ba chủng nấm Trichoderma M2, M4, M50 có khả phân giải cellulose cao, đường kính phân giải lần lược 52, 62, 64 mm  Nghiệm thức (50% BBS + 50% MSD) xử lý với ba chủng nấm Trichoderma sp tốt nhất, đạt suất trung bình 28,025g lúc trồng thử nghiệm Có thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu vi sinh  Nghiệm thức xử lý với Trichoderma nghiệm thức khả quan để sản xuất phân hữu vi sinh pH, nhiệt độ thuận lợi để nấm Trichoderma sinh trưởng phát triển  Mật độ nấm Trichoderma sp phân HCVS1 Đủ tiêu chuẩn làm phân hữu vi sinh ( CFU/g > 106) 5.2 Đề nghị: Do không đủ trang thiết bị, thời gian kinh phí nên đề tài khơng định danh xác tên chủng Trichoderma,và số tiêu phân hữu vi sinh, đề tài tiếp tục nghiên cứu sâu thêm đề nghị sinh viên khóa sau tiếp tục làm:  Định danh xác chủng Trichoderma sp phân lập phương pháp sinh học phân tử  Kiểm tra hoạt lực đối kháng sâu bệnh chủng nấm Trichoderma sp.đã phân lập  Tiếp tục kiểm tra mật độ nấm Trichoderma qua vài tháng  Nghiên cứu khử mùi đống ủ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bialatowicz M., Labza T and Lepiarczyk A., 2001 Composts produced of wood waste and biologically-active coagulum from fibreboard factory as organic fertilizer in vegetable crop rotation Zesyty Naukowe 34: 5-22 Bùi Xuân Đồng, 1982 Nhóm nấm Hyphomytes Việt Nam, tập I Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Dương Hoa Xô, 2008 Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh Truy cập ngày 16.10.2010. Đường Hồng Dật, 2002 Cẩm nang sử dụng phân bón Nhà xuất Nơng Nghiệp Hà Nội, 163 trang Đường Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đường, Nguyễn Thị Thanh Phụng, Trần Thị Cẩm Vân Hồng Lương Việt, 1979 Giáo trình Vi sinh vật học trồng trọt Nhà xuất Nông Nghiệp, 252 trang Elisa E and Manuela D S., 1998 Systematics and Environmental Application of the genus Trichoderma cricall Rewiews in Microbiology 24: 89-98 Gary J S., 2004 Trichoderma a guide to identification and biology Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA Hồng Đại Tuấn, 2000 Cơng nghệ sản xuất phân bón hữu – vi sinh – đa vi lượng Hudavil từ phế thải mía đường Báo cáo Hội nghị sản xuất sử dụng phân bón Hữu vi sinh cho mía Bộ NN & PTNT ngày 28/09/2000, Việt Nam Lại Hà Tố Hoa, 2006 Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITSrDNA vùng TEF Luận văn tốt nghiệp môn Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 10 Lê Văn Khoa, Nguyễn Xuân Cư, Bùi Thị Ngọc Dung, Lê Đức Trần Khắc Hiệp Cái Văn Tranh Phương pháp phân tích đất - nước - phân bón trồng Nhà xuất Giáo dục, Việt Nam, 242 trang.Lê Văn Căn, 1975 Sổ tay phân bón Nhà xuất Nơng Nghiệp,Hà Nội, Việt Nam 11 Lương Đức Phẩm, 1998 Công nghệ vi sinh Nhà xuất Hà Nội 44 12 Morris R A and Ma C H., 1975 Contributions of N from waste applications to vegetable: AVRDC research Managing soil fertility for intensive vegetable productionsystems in Asia 40:225-237 13 Phylogeny and evolution of the genus Trichoderma: a multigene approachM.A.Rifai,1969 14 Tác dụng phân hữu sản xuất nông nghiệp-Lê Văn Căn-1982 15 Khoa Học Đất Và Kỹ Thuật-Vi Sinh Vật Học-Nguyễn Lân Dũng-1983 16 Nguyễn Thị Ngọc Bích, “Kĩ Thuật Xenlulô Giấy”, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp HCM – 2003 45 PHỤ LỤC 1.Một số hình ảnh minh họa 46  Chủng nầm Trichoderma sp Đã phân lập gồm : Chủng M2 Chủng M7 Chủng M12 Chủng M4 Chủng M3 Chủng M8 Chủng M11 Chủng M50 Mẫu đối chứng vs M2 Mẫu đối chứng vs M50 Khả phân giải cellulose chủng nấm Trichoderma Khả phân giải cellulose M2, M4 47 Phân VS( chế phẩm VS) chất mang khử trùng không khử trùng Chế phẩm VS chất mang khử trùng 48 Ủ SƠ CHẾ CT4 BDU vs KTU Ủ SƠ CHẾ CT3 BDU vs KTU Ủ SƠ CHẾ CT2 BDU vs KTU 49 Cải trồng giá thể nguyên liệu (CT4) qua sơ chế Hình4 Cải trồng giá thể phân bón Hình Đánh giá độ chín cơng thức phương pháp trồng cải 50 Phân hữu VS dùng chế phẩm khử Phân hữu VS dùng chế phẩm trùng không khử trùng 2.Một số bảng tiêu kèm theo 2.1 pH đống ủ kết thúc sơ Bảng pH đống ủ kết thúc xử lý sơ (sau 21 ngày ủ) Số tt Công thức thí nghiệm pH ủ (21 ngày sau ủ) R1 R2 R3 R4 100% Bùn sữa + 10% Vôi + Nấm 8,12 7,98 7,98 8,04 100% Mạt dừa +10% Vôi + Nấm 7,53 7,67 7,63 7,56 60% Bùn sữa + 40% Mạt dừa +10% Vôi + Nấm 7,97 7,91 8,17 8,06 50% bùn sữa + 50% Mạt dừa + 10% Vôi + Nấm 8,24 8,17 8,14 8,19 40% Bùn sữa + 60% Mạt dừa +10% Vôi + Nấm 8,31 8,08 8,09 8,17 Thống kê GEN-STAT giai đoạn kêt thúc ủ Khác biệt công thức F pr