BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC CÁC CÁ THỂ TỪ QUẦN THỂ PHÂN LY BC2F1 CÓ HÀM LƯỢNG AMYLOSE TRUNG BÌNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ SSR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : HUỲNH KHOA KHƠI Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC CÁC CÁ THỂ TỪ QUẦN THỂ PHÂN LY BC2F1 CĨ HÀM LƯỢNG AMYLOSE TRUNG BÌNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ SSR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TRƯƠNG QUỐC ÁNH HUỲNH KHOA KHÔI Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Thành kính tri ân tới cha mẹ gia đình ni nấng, dạy dỗ cho ăn học đến ngày hôm Em xin gởi lời biết ơn sâu sắc tới Thạc Sĩ Trương Quốc Ánh tận tình hướng dẫn động viên em suốt trình em thực đề tài Em xin cảm ơn thầy cô thuộc môn Công nghệ sinh học nói riêng trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM nói chung tận tình dạy bảo em suốt thời gian em học trường Em xin cảm ơn: - Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học ban lãnh đạo Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp miền Nam tạo điều kiện tốt cho em học tập trường làm đề tài Viện - Chị Tú Anh anh chị, thầy thuộc phòng Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp miền Nam giúp em hoàn thành đề tài - Các bạn lớp DH07SH bên cạnh giúp đỡ, động viên suốt trình học tập trường làm đề tài TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Huỳnh Khoa Khơi ii TĨM TẮT Cây lúa (Oryza sativa L.) lương thực quan trọng giới Giá lúa gạo không ổn định mà chất lượng yếu tố định đến giá trị thương phẩm nông sản Nhiệt độ trở hồ (GT), độ bền gel (GC) hàm lượng amylose (AC) ba tính trạng ảnh hưởng lớn đến phẩm chất cơm hạt gạo, đặc biệt hàm lượng amylose Giống lúa IR50404 có nhiều đặc tính tốt chất lượng hạt lại thấp (hàm lượng amylose cao 26%) Chính vậy, giống IR50404 chọn để cải thiện (làm giảm) hàm lượng amylose MAS thực 94 cá thể thuộc quần thể phân ly BC2F1 hai tổ hợp lai hồi giao IR50404/Jasmine 85 IR50404/VĐ20 DNA tổng số cá thể giống bố mẹ (IR50404, Jasmine 85, VĐ20) ly trích theo phương pháp CTAB Murray Thomson (1980) (có thay đổi) Sau đó, DNA tổng số kiểm tra phương pháp đo OD điện di gel agarose Phản ứng PCR tiến hành với marker RM190, sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 2,5% Đồng thời, kiểu hình (hàm lượng amylose) đánh giá phương pháp sinh hóa Sadavisam Manikam (1992) Sau đó, kiểu gen kiểu hình so sánh với Qua kết kiểm tra kiểu hình quần thể BC2F1, có 35 mẫu có hàm lượng amylose cao, 52 mẫu có hàm lượng amylose trung bình mẫu có hàm lượng amylose thấp Qua kiểm tra kiểu gen, có 48 mẫu có kiểu gen AA 46 mẫu có kiểu gen Aa Độ xác trung bình kiểu gen kiểu hình quần thể phân ly BC2F1 76,81%, riêng kiểu gen dị hợp Aa độ xác 86,96% Cuối cùng, chọn 40 cá thể lai có kiểu gen dị hợp (Aa) Với allele A (thể hàm lượng amylose cao) từ mẹ allele a (thể hàm lượng amylose thấp) từ bố, đồng thời cá thể có kiểu hình (hàm lượng amylose) phù hợp với kiểu gen dị hợp (trung bình) Từ khóa: lúa, microsatellite, SSR, hàm lượng amylose, marker phân tử ii SUMMARY The thesis’s name is “Research and selection of offsprings from segregational population BC2F1 with intermediate amylase content by SSR marker” The cultivated rice (Oryza sativa L) is the most world’s important crop plant The price of rice is not stable that quality is key factor to decide the value of agricultural products The gelatinization temperature (GT), gel consistency (GC) and amylose content (AC) are three basis traits that directly effect to cooking quality of rice grain, especially the amylose content IR50404 variety has many good characters but grain’s quality is low (high AC 26%) Therefore, rice variety IR50404 have been selected to improve (reduce) AC MAS have been applied on 94 individuals belong to segregational population BC2F1 of two backcrossing combination IR50404/Jasmine 85 and IR50404/VĐ20 Double - stranded DNA (dsDNA) of them and their recurrent parents (IR50404, Jasmine 85, VĐ20) were extracted according to CTAB method of Murray and Thomson (1980) (with mini modified) Then dsDNA were tested by OD measurement and electrophoresis on 0,5% agarose gel PCR reaction was conducted with marker RM190, PCR products were checked by electrophoresis on 2,5% agarose gel Also, phenotyping (AC) was estimated by biochemical method of Sadavisam and Manikam (1992) Then the genotype and phenotype were compared each other According to results of phenotypic assessment, there were 35 individuals with high AC, 52 ones for intermediate AC and ones showed low AC Based on genotypic analysis of BC2F1 population, there were 48 ones with genotype AA and 46 ones with genotype Aa Average accuracy between genotype and phenotype of the BC2F1 population was 76,81%, particularly for heterozygous genotype (Aa) was 86,96% Finally, we selected 40 offsprings that were heterozygous genotype (Aa) with allele A (high-amylose content) from the recurrent parent (IR50404) and allele a (low-amylose content) from the donor (Jasmine 85 or VĐ20) while they also had phenotype (amylose content) in accordance with heterozygous genotype (intermediate) iii Keyword: amylase content, AC, rice, backcross, molecular marker, microsatellite iv MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Chương MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược lúa 2.1.1 Phân loại khoa học 2.1.2 Nguồn gốc lúa trồng .4 2.1.3 Đặc điểm hình thể học 2.1.3.1 Rễ lúa 2.1.3.2 Thân lúa .8 2.1.3.3 Lá lúa 2.1.3.4 Hoa lúa 10 2.1.3.5 Hạt lúa 13 2.1.4 Các giai đoạn phát triển lúa 14 2.1.5 Sự khác biệt giống lúa hàm lượng amylose 16 2.1.6 Tình hình sản xuất lúa gạo nước giới 17 2.1.6.1 Tình hình sản xuất lúa gạo nước 17 2.1.6.2 Tình hình sản xuất lúa gạo giới 18 v 2.2 Tinh bột số nghiên cứu di truyền tính trạng hàm lượng amylose 19 2.2.1 Sơ lược tinh bột 19 2.2.1.1 Amylose 21 2.2.1.2 Amylopectin 22 2.2.2 Một số nghiên cứu di truyền tính trạng hàm lượng amylose 22 2.3 Quy trình ly trích DNA thực vật 30 2.4 Phương pháp đo mật độ quang kỹ thuật điện di 30 2.4.1 Phương pháp đo mật độ quang 30 2.4.2 Kỹ thuật điện di 31 2.5 Các marker dùng MAS 32 2.5.1 Marker hình thái 33 2.5.2 Marker sinh hóa 33 2.5.3 DNA marker 34 2.5.3.1 SSR marker 36 2.5.3.2 Các bước để sử dụng SSR marker 37 2.6 Phương pháp lai hồi giao 37 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 40 3.2 Vật liệu ban đầu hóa chất, thiết bị nghiên cứu 40 3.2.1 Vật liệu ban đầu 40 3.2.2 Hóa chất thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 41 3.2.2.1 Hóa chất 41 3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 41 3.3 Phương pháp nghiên cứu 42 3.3.1 Xây dựng quần thể BC2F1 42 3.3.2 Ly trích đánh giá chất lượng DNA tổng số 43 3.3.2.1 Ly trích DNA tổng số 43 3.3.2.2 Đánh giá chất lượng DNA tổng số 44 3.3.3 Tìm kiếm xác định marker 44 vi 3.3.4 Thiết kế phản ứng PCR 49 3.3.5 Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR 50 3.3.6 Đánh giá hàm lượng amylose quần thể BC2F1 50 3.3.7 Đánh giá kết dựa kiểu gen kiểu hình quần thể BC2F1 51 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 4.1 Kết 52 4.1.1 Kết kiểm tra DNA tổng số 52 4.1.2 Kết phân tích kiểu hình quần thể BC2F1 52 4.1.3 Kết phân tích kiểu gen quần thể BC2F1 53 4.1.4 So sánh kiểu gen kiểu hình quần thể BC2F1 56 4.2 Thảo luận 59 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 5.1 Kết luận 61 5.2 Đề nghị 61 Tài liệu tham khảo 62 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A: Ampe AC: Amylose Content BC: BackCross bp: base pair CTAB: CetylTrimethylAmmonium Bromide ctv: cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleotide Acid dNTP: Deoxynucleotide triphosphate F: forward GC: Gel Consistency GT: Gelatinization Temperature IRRI: International Rice Reasearch Institude MAS: Marker Assisted Selection OD: Optical Density PCR: Polymerase Chain Reaction QTL: Quantitative Trait Locus R: reverse RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphism RNA: Ribonucleotide Acid RNase: Ribonuclease SSR: Simple Sequence Repeats t: tentative Tm: melting temperature USDA: United States Department of Agriculture UV: Ultra Violet V: Volt viii Hình 3.3 Hộp thoại kết tìm kiếm BLAST - Bước 4: Xem kết sau click vào “RESULTS” để quay hộp thoại kết (như bước 3) để xem kết lại (hình 3.4) 50 Hình 3.4 Kết chi tiết cho trình tự marker 3.3.4 Thiết kế phản ứng PCR Bảng 3.2 Thành phần hóa chất phản ứng PCR Hóa chất Nồng độ sử dụng PCR buffer 1X MgCl2 mM dNTPs 100 M Mồi xuôi 0,25 M Mồi ngược 0,25 M Taq polymerase 1,5U DNA mẫu 100ng H2O Thêm vừa đủ 25 l 51 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Biến tính ban đầu 94 Biến tính 94 Bắt cặp 55 (35 chu kỳ) Kéo dài 72 Kéo dài cuối 72 Trữ mẫu Đến lấy mẫu Bước 3.3.5 Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 2,5%, hiệu điện 160 V, thời gian 90 phút Sản phẩm PCR load vào giếng loading dye với tỉ lệ : (5 µl sản phẩm : µl loading dye) 3.3.6 Đánh giá hàm lượng amylose quần thể BC2F1 Hàm lượng amylose cá thể lai quần thể BC2F1 đánh giá phương pháp sinh hóa Sadavisam Manikam (1992) Theo Nguyễn Tiến Huyền (2005) phương pháp gồm bước: Bước 1: Tác nhân iod Hòa tan iodine 10 g KI nước cất, lên thể tích 500 ml lắc cho tan hết, dùng giấy bạc bọc kín, bảo quản tủ tối để sử dụng Bước 2: Pha dung dịch chuẩn Hòa tan 100 mg amylose 10 ml NaOH N, sau lên đến thể tích 100 ml nước cất, bảo quản tủ lạnh nhiệt độ - 4oC để sử dụng Bước 3: Xác định hàm lượng amylose *Nguyên lý: Iodine hấp thụ vào chuỗi xoắn phân tử amylose tạo thành hợp chất màu xanh xác định bước sóng 590 nm *Các bước tiến hành cụ thể (Nguyễn Tiến Huyền, 2005): - Cân 100 mg bột, thêm 1ml ethanol sau thêm 10 ml NaOH N để qua đêm - Lên thể tích 100 ml 52 - Lấy 2,5 ml dung dịch thêm khoảng 20 ml nước cất giọt phenophtalein - Chuẩn độ HCl 0,1 N màu hồng biến - Lấy 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ml dung dịch amylose chuẩn, bước tiến hành giống mẫu - Tính lượng amylose có mẫu phân tích dùng đường chuẩn - Hòa tan ml tác nhân iodine vào 50 ml sử dụng làm blank - Tính tốn: Số đo máy quang phổ kế áp dụng lên đường chuẩn x mg Amylose (%) = (x / 2,5) * 100 3.3.7 Đánh giá kết dựa kiểu gen kiểu hình quần thể BC2F1 Để kiểm tra mức độ xác hàm lượng amylose thấp hàm lượng amylose cao dòng lai hồi giao 53 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết 4.1.1 Kết kiểm tra DNA tổng số Sau ly trích, mẫu DNA tổng số kiểm tra phương pháp điện di đo OD Khi kiểm tra gel agarose 0,5%, mẫu DNA tổng số có băng mờ, đứt gãy lẫn nhiều tạp chất ly trích lại Các mẫu có chất lượng thấp do: - Mẫu trữ - 80oC lâu, - Ly trích DNA từ mẫu già, - Nghiền khơng mịn hồn tồn mẫu lá, - Sau nghiền mẫu cho vào eppendorf không đem trữ nên gây tượng mẫu tan chảy, - Khi hút dịch không cẩn thận nên làm lẫn cặn vào mẫu DNA thu Sau sai sót phát khắc phục, chất lượng DNA tổng số cải thiện Băng DNA tổng số rõ khơng (hoặc giảm bớt) nồng độ tạp chất Tạp chất Hình 4.1 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số Kết định lượng máy đo OD cho kết tốt, tỉ lệ OD260/OD280 mẫu nằm khoảng 1,5 - 2,2; phù hợp để thực phản ứng PCR 4.1.2 Kết phân tích kiểu hình quần thể BC2F1 Nhìn chung, IR50404 giống lúa tốt (ngắn ngày, chịu phèn) chất lượng gạo (hạt gạo ngắn, bạc bụng, cơm khô, hàm lượng amylose cao (26%)) Theo Hiệp hội lương thực (2009), có hai giải pháp dành cho lúa IR50404: nhà khoa học phải tìm tòi, lai tạo giống khác có đặc tính IR50404 chất lượng cao 54 hệ thống nông nghiệp phải nổ lực để giảm diện tích.Vì vậy, IR50404 chọn để cải thiện hàm lượng amylose, giúp trở nên hoàn thiện hơn, tăng giá trị xuất giá trị sử dụng nước Ngược lại, Jasmine 85 VĐ20 hai giống lúa có chất lượng hạt gạo tốt, cơm mềm dẻo nên phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng Hai giống lúa hai giống cho (giống bố) đề tài Bảng 4.1 Hàm lượng amylose giống bố mẹ STT Giống lúa Hàm lượng amylose (%) Đánh giá Giống bố/mẹ IR50404 25,9 Cao Mẹ Jasmine 85 19,2 Thấp Bố VĐ20 18,6 Thấp Bố Thông qua phép kiểm tra phương pháp sinh hóa (Sadavisam Manikam, 1992), ta có kết kiểm tra kiểu hình (hàm lượng amylose) 94 cá thể lai quần thể BC2F1 Hàm lượng amylose mẫu từ 20 - 25% đánh giá có hàm lượng amylose trung bình, >25% hàm lượng amylose cao