BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ ĐÁNH GIÁ KỸ THUẬT REALTIME PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI GÂY VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: ĐẶNG VĂN PHÁT Niên khóa : 2007 - 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ ĐÁNH GIÁ KỸ THUẬT REALTIME PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI GÂY VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: TS.BS PHẠM HÙNG VÂN ĐẶNG VĂN PHÁT Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Con xin biết ơn cha mẹ nuôi nấng, dạy dỗ, động viên tạo điều kiện suốt thời gian học tập Em xin cảm ơn thầy cô trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh – Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức khoa học, kiến thức chuyên ngành, kinh nghiệm quý báu năm học trường Con xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ, bác sĩ Phạm Hùng Vân nhiệt tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức thời gian thực đề tài tốt nghiệp Em xin cám ơn chị Ngọc, chị Trang, anh chị phòng R&D, phòng QC, phòng vi sinh tận tình giúp đỡ em thời gian thực đề tài Cuối xin cám ơn bạn lớp DH07SH chia sẻ, động viên suốt thời gian học tập Đặng Văn Phát iii TÓM TẮT Viêm loét dày tá tràng bệnh phổ biến cộng đồng dân cư nước ta, bệnh thường gặp lọai bệnh đường tiêu hóa Bệnh gặp lứa tuổi người lớn chiêm tỷ lệ cao trẻ em Theo tổ chức y tế giới (WHO) vi khuẩn H pylori thuộc nhóm I tác nhân gây bệnh Người ta ước tính có 50% dân số bị nhiễm H pylori, chủ yếu nước phát triển với tần số nhiễm cao từ 50 - 90% Việt Nam nước có tỷ lệ nhiễm H pylori cao vào khoảng 70% người lớn Việc điều trị tiệt trừ H pylori giúp chữa lành bệnh giảm tỷ lệ tái phát Vì việc phát sớm diện H pylori để điều trị tiệt trừ cách điều cần thiết Do đã: “Xây dựng quy trình đánh giá kỹ thuật Realtime PCR việc phát vi khuẩn Helicobacter pylori gây bệnh viêm loét dày tá tràng” nhằm phát vi khuẩn sớm xác Chúng tơi sử dụng kit, chứng chuẩn, mẫu bệnh phẩm để xây dựng quy trình Kết cho thấy quy trình có độ nhạy cao Đánh giá kết phát mix Realtime PCR cách so sánh với kết PCR cho kết tương đồng cao Áp dụng quy trình 15 mẫu sinh thiết mơ dày, kết cho thấy có 12 mẫu dương tính Vì mix Realtime PCR dùng phát H pylori hồn tồn ứng dụng iv SUMMARY Gastroduodenal ulcer is one of the most popular disease in our country , and it’s also the most common type in gastroenteritis This disease occurs in all ages, however the proportion of adults who get sick is higher than children According to the world health organization WHO, the Helicobacter pylori bacteria is mean reason for this disease It is estimated that over 50% of the population has been infected with H pylori, mainly in developing countries with high infection frequencies from 50 - 90% Among them, Vietnam is also a country with high H pylori infection rate which is more than 70% adults get this bacteria The treatment eliminate H pylori can help heal and reduce recurrence rates So early detection of the presence of H pylori for the treatment and eradication of properly is essential Thus, we have constructed the process and evaluation the Realtime PCR technique for earlier and more accurately detecting Helicobacter pylori bacteria that causes stomach ulcer duodenum We have used the kit, certified standard samples to build process The results showed that highly sensitive prosess Comparision between the qualitative PCR result and the quantitative Realtime PCR result showed the highly similinity Applying the above process on the 15 gastric biopsy samples, the results showed 12 positive samples So the Realtime PCR mix for detection H pylori is fully applicable v MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách hình x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vần đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Dạ dày - tá tràng 2.1.1 Dạ dày, tá tràng 2.1.2 Những bệnh lí thường gặp dày 2.1.3 Nguyên nhân yếu tố gây bệnh loét dày - tá tràng 2.1.4 Triệu chứng bệnh loét dày - tá tràng 2.1.5 Các biến chứng bệnh loét dày - tá tràng 2.2 Vi khuẩn Helicobacter pylori 2.2.1 Lịch sử 2.2.2 Đặc điểm chung 2.2.3 Đặc điểm tuýp di truyền 2.2.4 Dịch tể học 10 2.2.5 Thành phần - cấu tạo 11 2.2.5.1 Tính di động 11 2.2.5.2 Men urease 11 2.2.5.3 Yếu tố chống tăng sinh 12 2.2.5.4 Sự kết dính hồng cầu 12 vi 2.2.5.5 Các adhesion giúp thu giữ sắt 12 2.2.5.6 Phospholipase protease 12 2.2.5.7 VacA (vacuolating cytoxin VacA) Độc tố không bào 12 2.2.5.8 CagA gen (cytotoxine associated gen A) 12 2.3 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm Helicobacter pylori 14 2.3.1 Các thử nghiệm không xâm hại (noninvasive test) 14 2.3.1.1 Nghiệm pháp thở 13C 14C (UREA BREATH TEST = UBT) 14 2.3.1.2 Chẩn đoán huyết 14 2.3.1.3 Test huyết phát kháng thể kháng CagA 15 2.3.1.4 Tìm kháng thể kháng H pylori nước tiểu 15 2.3.1.5 Immunoblot 15 2.3.1.6 Phát kháng nguyên phân – HpSA 15 2.3.2 Các thử nghiệm xâm hại qua nội soi dày tá tràng (invasive test) 15 2.3.2.1 Thử nghiệm urease 15 2.3.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn 16 2.3.2.3 Chẩn đốn mơ bệnh học 16 2.3.2.4 Phản ứng chuỗi Polymerase - PCR 16 2.4 Kĩ thuật Realtime PCR 17 2.4.1 Realtime PCR 17 2.4.2 Các vấn đề kĩ thuật 17 2.4.2.1 Biểu đồ khuếch đại 17 2.4.2.2 Những tiêu chuẩn phản ứng PCR định lượng tối ưu 18 2.4.3 Các thành phần phản ứng Realtime PCR 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.2.1 Mẫu 20 3.2.2 Hóa chất 20 3.2.2.1 Hóa chất dùng tách chiết DNA 20 3.2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 20 3.2.2.3 Hóa chất cho phản ứng Realtime PCR 21 3.2.3 Dụng cụ thiết bị 22 vii 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Phương pháp xác định đánh giá độ nhạy kỹ thuật Realtime PCR 22 3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA 23 3.3.3 So sánh kĩ thuật Realtime PCR với PCR việc phát H pylori 23 3.3.3.1 Phương pháp phát H pylori kĩ thuật Realtime PCR 24 3.3.3.2 Phương pháp phát H pylori kĩ thuật PCR 25 3.3.3.3 So sánh kết thu phương pháp 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết khảo sát độ nhạy qui trình 28 4.2 Kết phản ứng Realtime PCR chạy mẫu bệnh phẩm 29 4.3 Kết chạy phản ứng PCR mẫu bệnh phẩm 30 4.4 Đánh giá kết thu phương pháp 31 4.5 Thảo luận 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 viii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT Bp : base - pair DD : Dạ dày DNA : Desoxyribonucleic acid dNTP : deoxynucleotide triphosphate EDTA : Etylen Diamino Tetra Acetic kDa : kilo Dalton Kp : kilo base - pair H pylori : Helicobacter pylori PCR : Polymerase Chain Reaction TBE : Tris – borate EDTA TE : Tris – EDTA TT : Tá tràng TQ : taqman : Hemo β-globulin HBG ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần Realtime PCR mix để phát H pylori 21 Bảng 3.2 Thành phần HBG TQ mix, nhằm khuếch đại gen β-globulin 22 Bảng 4.1 Kết khảo sát độ nhạy chứng chuẩn 28 Bảng 4.2 Kết phản ứng Realtime PCR mẫu thực nghiệm 30 Bảng 4.3 Kết so sánh Realtime PCR PCR 32 x Hóa chất dùng điện di sản phẩm PCR Agarose 2% Dung dịch đệm TBE 0,5X Hóa chất phát huỳnh quang Ethium bromide 3.2.2.3 Hóa chất cho phản ứng Realtime PCR Enzyme Taq DNA polymerase phản ứng Realtime vừa có thêm hoạt tính exonuclease để cắt probe khỏi sợi DNA khuôn Realtime PCR dùng taqman probe để phát H pylori Bảng 3.1 Thành phần Realtime PCR mix để phát H pylori Thành phần gốc Master mix 2X Nồng độ hay hàm lượng gốc Nồng độ hay hàm lượng thể tích phản ứng Thể tích phải lấy để pha master mix (µl) 2X 1X 250 MgCl 50 mM 3,5 mM 35 UNG 1U/µl U/µl 1U dUTP 100 mM 200 µM Mồi xi HP-F 100 mM 25 pm Mồi ngược HP-R 100 mM 25 pm 5l HP-probe(FAM) Nước cất lần 100 mM pm 10 93 Đối với mẫu sinh thiết mô dày ta chạy thêm hệ thống HBG TQ mix HBG TQ mix sử dụng taqman probe làm probe phát huỳnh quang để khuếch đại gen βglobulin, gen tạo nên cấu trúc hemoglobin, liên quan đến trình vận chuyển oxy, gen ly trích với gen vi khuẩn q trình ly trích Gen β-globulin sử dụng làm gen tham chiếu để kiểm sốt q trình ly trích, kiểm sốt tác nhân ức chế trình 21 Bảng 3.2 Thành phần HBG TQ mix, nhằm khuếch đại gen β-globulin Thành phần gốc Nồng độ hay hàm lượng gốc Master mix 2X Nồng độ hay hàm lượng thể tích phản ứng Thể tích phải lấy để pha master mix (µl) 2X 1X 250 MgCl 50 mM 3,5 mM 35 UNG 1U/µl U/µl 1U dUTP 100 mM 200 µM Mồi xuôi HBG-F 100 mM 25 pm Mồi ngược HBG-R 100 mM 25 pm HBG-probe(FAM) 100 mM pm 10 Nước cất lần 93 3.2.3 Dụng cụ thiết bị Tủ hút Bio clean bench Tủ lạnh -30oC 40C Micropipette đầu típ vơ trùng Eppendorf loại (1,5 ml; 0,2 ml ) Máy vortex Máy ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút (eppendorf) Máy hút chân không Máy ủ nhiệt Máy PCR (biorad), Realtime PCR (CFX96) Máy chụp hình gel Các dụng cụ khác: găng tay, trang… 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp xác định đánh giá độ nhạy kỹ thuật Realtime PCR Bất kì phương pháp phát đối tượng mục tiêu mẫu giới hạn định Một phương pháp đánh giá tốt khi phát đối tượng quan tâm nồng độ thấp Vì độ nhạy phương pháp yêu cầu quan trọng kit trước áp dụng thực tế Để tiến hành khảo sát độ nhạy của quy trình, trước hết người làm thí nghiệm phải có dung dịch DNA đích biết sẵn số copies Trong đề tài sử dụng mẫu 22 chuẩn plasmid có chứa gen đích để xác định vi khuẩn H pylori phương pháp Realtime PCR công ty Nam Khoa, sau khảo sát hàm lượng tiến hành pha loãng chuẩn dung dịch TE1X (theo hệ số pha lỗng 10 lần) sau chạy phản ứng Realtime PCR để xác định độ pha lỗng mix Realtime khả phát trình tự đích vi khuẩn Độ nhạy kit số lượng copies DNA đích thấp cho vào ống phản ứng mà cho sản phẩm khuếch đại mong muốn cách rõ ràng 3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA Dung dịch Phenol/Chloroform/Isopropanol phá vỡ tế bào giải phóng DNA gây tủa protein Sau ly tâm, hỗn hợp phân tách thành pha rõ rệt, thu nhận pha nước có DNA trên, loại bỏ phần tủa phía Sau DNA thu nhận cách tủa ethanol tuyệt đối nồng độ muối cao Cuối rửa tủa DNA ethanol 70% hòa vào dung dịch TE1X Phương pháp tiến hành: - Lấy mẫu mơ dày (qua nội soi), thêm 180 µl TE1X nghiền cho tan mơ - Thêm 20 µl proKprep trộn đều, thêm 200 µl TE1X (cho đủ 400 µl) ủ 56oC qua đêm - Thêm 400 µl P.C.I, vortex mạnh Ly tâm 13000vòng/phút 5phút - Thu dịch lỏng bên trên, bỏ cặn - Lặp lại bước thêm 400 µl P.C.I, vortex, ly tâm, để DNA sạch, tránh tủa protein - Thu dịch lỏng, bỏ cặn bên - Thêm 40 µl CH COONa 3M, pH 5,2 thêm 1000 µl ethanol 100%, vortex sau ủ lạnh -30oC 30 phút - Ly tâm 13000 vòng/phút 5phút, bỏ dịch, thu cặn - Rửa cặn với 1ml ethanol 70%, úp ngửa vài lần - Ly tâm 13000 vòng/phút phút, dùng hút chân không hút hết dịch, tránh làm cặn - Làm khơ máy ủ nhiệt 10 phút - Hòa tan 50 µl TE1X 3.3.3 So sánh kĩ thuật Realtime PCR với PCR việc phát H pylori 23 Các mẫu mô sinh thiết dày sau tách chiết DNAPREP PHCHL thu tồn DNA genome có mẫu, DNA genome dùng để chạy phản ứng Realtime PCR PCR Trong phản ứng Realtime PCR sử dụng mix H pylori TQ mix HBG TQ mix chạy mẫu DNA genome, để xác định mẫu dương tính hay âm tính đồng thời kiểm sốt q trình ly trích DNA có đạt hay khơng Còn phản ứng PCR, chúng tơi sử dụng DNA genome ly trích để chạy phản ứng PCR, sau điện di gel agarose, chụp hình gel để phát mẫu âm tính hay dương tính Từ bảng kết có chúng tơi nhận xét, đánh giá mix Realtime PCR việc phát H pylori Mẫu sinh thiết mô dày Tách chiết phương pháp sử dụng P.C.I DNA genome mẫu Thực phản ứng Realtime PCR Sử dụng H pylori TQ mix Thực phản ứng PCR Sử dụng HBG TQ mix Thu thập số liệu, phân tích kết Điện di sản phẩm PCR Phân tích, đánh giá kết So sánh kết thu được, nhằm đánh giá mix Realtime PCR việc phát H.pylori Hình 3.1 Các bước thực so sánh kĩ thuật Realtime PCR PCR mẫu 3.3.3.1 Phương pháp phát H pylori kĩ thuật Realtime PCR 24 Nguyên tắc: Sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn đăc hiệu dài khoảng 148 bp vùng gen urease H pylori Nếu mồi mẫu dò hoạt động tốt mẫu có vi khuẩn H pylori cho kết dương tính chu kì ngưỡng thích hợp Trong phản ứng Realtime PCR phát H pylori, chạy mix Realtime để phát vi khuẩn, chúng tơi chạy thêm mix HBG TQ, nhằm khuếch đại gen βglobulin người, gen gen chủ nhà ly trích q trình ly trích mẫu sinh thiết mơ dày Sử dụng kết gen để đánh giá trình ly trích mẫu có tốt khơng, mẫu thử có đủ để thực phản ứng không, sản phẩm DNA genome ly trích có bị ức chế hóa chất ly trích khơng Phương pháp: • Sử dụng tube low – profile white (các tube giữ khay lạnh) Lần lượt cho 20 µl H pylori TQ mix vào 17 giếng, cho 20 µl HBG TQ mix v 15 ging khỏc Cho àl mu DNA genome mẫu bệnh phẩm giếng Mỗi mẫu tương ứng với giếng: giếng H pylori TQ mix, giếng HBG TQ mix • Cho µl TE1X vào giếng đối chứng âm, µl chứng dương vào giếng đối chứng dương tương ứng • Đóng nắp thật chặt, để tránh mix bay q trình ln nhiệt • Ly tâm nhẹ để dung dịch rơi xuống đáy tube khơng dính thành • Cho tube vào buồng ủ nhiệt máy để chạy Realtime PCR • Cài đặt chương trình chạy máy theo chu trình nhiệt: tube 95oC phút 30 giây 940C 15 giây 600C phút 40 chu kỳ Máy chụp hình cuối giai đoạn 600C taqman probe bị Taq polymerase thủy giải, giải phóng chất phát huỳnh quang 3.3.3.2 Phương pháp phát H pylori kĩ thuật PCR Nguyên tắc: Sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn đặc hiệu dài 303 bp vùng gen urease H pylori 25 Bộ mix phát H pylori công ty Nam Khoa nghiên cứu ứng dụng để xét nghiệm H pylori mẫu mô dày gửi đến phòng xét nghiệm Nam Khoa Phương phỏp: Cho 20 àl mix PCR phỏt hin H pylori vào tube eppendorf 0,2 • Sau cho tiếp µl DNA genome mẫu vào tube, sử dụng dung dịch TE1X vào tube đối chứng chứng âm, 5µl chứng dương vào tube đối chứng dương, chứng dương công ty Nam Khoa cung cấp • Đóng chặt nắp tube, ly tâm nhẹ để dung dịch rơi xuống đáy tube khơng dính thành tube • Đặt tube vào máy PCR • Cài đặt chương trình chạy máy theo chu trình nhiệt: 95oC phút 95oC 30 giây 55oC 30 giây 72oC phút 72oC 10 phút 40 chu kỳ Sau đó, sản phẩm PCR điện di gel agarose nồng độ 2% Phương pháp điện di sản phẩm PCR: • Chuẩn bị TBE 0,5 X Cho 50 ml TBE 10 X vào ống đong chứa 950 ml nước cất lắc • Chuẩn bị gel agarose 2% cách cho gram agarose vào 100 ml dung dịch TBE 0,5 X Sau đó, đun sơi lò viba tan hồn tồn khơng lợn cợn • Để thạch nguội nhiệt độ phòng khoảng 10 phút cho tiếp μl Ethidium bromide 10 mg/ml, trộn hòa tan Ethidium bromide vào thạch, tránh làm thạch có bọt khí trộn • Chuẩn bị khn đổ thạch, đặt lược vào khuôn đổ thạch vào khuôn cho đạt bề dày – mm Để nguội thạch đặc thạch nhiệt độ phòng • Khi thạch đặc, gỡ lược Sau đặt thạch vào máng điện di đổ dung dịch TBE 0,5 X cho ngập mặt thạch 26 • Hút μl loading dye trộn với μl sản phẩm PCR • Dùng micropipette cho tồn dung dịch vào giếng theo thứ tự,phải thêm DNA ladder vào giếng để chụp hình ta biết tương ứng với mẫu xuất vạch Chạy điện di 23 phút dòng điện 135 V • Sau chạy xong, lấy gel khỏi máng đọc kết tia UV Rồi chụp lại kết 3.3.3.3 So sánh kết thu phương pháp Sau có kết phương pháp việc phát vi khuẩn H pylori mẫu bệnh phẩm Chúng thực so sánh kết phương pháp để đánh giá mix Realtime PCR việc phát vi khuẩn H pylori 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát độ nhạy quy trình Như đề cập trên, chúng tơi sử dụng mẫu DNA có nồng độ biết trước 105 copies/ml, tiến hành phã loãng theo bậc 10 mẫu DNA thu mẫu DNA nồng độ 105, 104, 103, 102, 101,100 thực phản ứng Realtime PCR cho mẫu nồng độ thu kết sau Bảng 4.1 Kết khảo sát độ nhạy chứng chuẩn Kết Ct 100 101 102 103 104 105 Chứng âm - + + + + + - No Ct 39,01 37,62 33,14 29,55 26,03 No Ct 105 copies/ml 104 copies/ml 103 copies/ml 102 copies/ml 101 copies/ml 100 copies/ml Chứng âm Hình 4.1 Kết khảo sát độ nhạy chứng chuẩn Các giếng chuẩn có đường biểu diễn khuếch đại dương tính chứng âm đường biểu diễn khuếch đại âm tính (nằm đường nền) Điều chứng tỏ: thứ q trình pha lỗng mix không bị nhiễm chéo, thứ PCR mix đủ nhạy giếng chuẩn có đường khuếch đại vượt qua đường Dựa vào kết dương tính nồng độ, chúng tơi nhận thấy nồng độ cuối cho kết dương tính 101 copies/ml 28 Hình 4.2 Biểu đồ chuẩn mẫu chuẩn dãy pha loãng Nhận xét: Theo kết thu hiệu khuếch đại phản ứng 99% nằm khoảng cho phép phản ứng Realtime PCR 90 - 105% Bình phương hệ số tương quan R2 = 0,998 đạt yêu cầu >=0,98, có nghĩa đường biểu diễn chuẩn đạt tuyến tính cao hiệu khuếch đại đạt yêu cầu 4.2 Kết phản ứng Realtime PCR chạy mẫu bệnh phẩm Sau kiểm tra độ nhạy mix Realtime PCR mẫu chuẩn, tiến hành chạy thử nghiệm 15 mẫu DNA genome bệnh nhân tách chiết theo phương pháp Phenol/Chloroform/Isopropanol, với mẫu chứng âm chứng dương Chạy song song loại mix H pylori TQ PCR HBG TQ PCR cho 15 mẫu bệnh phẩm để kiểm sốt q trình tách chiết, yếu tố ức chế ảnh hưởng đến phản ứng Nhận xét: Đối chứng âm cho kết âm tính chứng tỏ q trình thực phản ứng không bị tạp nhiễm hay nhiễm chéo Đối chứng dương cho kết dương tính rõ Vậy H pylori TQ PCR mix hoạt động tốt Đối với 15 mẫu DNA genome người bình thường chúng tơi nhận thấy mix HBG chạy cho kết tốt, chứng tỏ trình tách chiết thực tốt, hàm lượng DNA mẫu đủ, sản phẩm DNA khơng bị ức chế hóa chất ly trích Kết cho thấy 15 mẫu có 12 mẫu dương tính, mẫu âm tính 29 Bảng 4.2 Kết phản ứng Realtime PCR mẫu thực nghiệm STT 10 11 12 13 14 15 16 17 Kí hiệu mẫu 97085 97290 97340 97829 98019 98020 98237 98295 98296 98469 98709 99192 99309 99310 99311 Chứng âm Chứng dương Tên Bình HP mix No Ct HBG mix 23,54 Khanh Dung Bảo Trung Linh Phong Duy Khang Nam Cường Thúy Cảnh An Giang 22,81 24,91 27,08 34,43 27,97 30,97 No Ct 29,10 29,14 26,87 26,79 26,17 No Ct 34,85 No Ct 35,12 20,73 21,71 24,14 29,14 23,42 26,73 29,45 25,10 24,17 23,16 19,14 20,27 25,11 29,60 4.3 Kết chạy phản ứng PCR mẫu bệnh phẩm 15 mẫu DNA genome chạy phản ứng Realtime PCR, sử dụng để chạy phản ứng PCR, với mix công ty Nam Khoa áp dụng thành công Sản phẩm PCR điện di gel agarose, mẫu dương tính cho băng sáng vạch 303bp Nhận xét: qua hình điện di, thu kết sau Đối chứng âm không xuất vạch băng, chứng tỏ tượng nhiễm chéo cho mẫu vào mix Đối chứng dương cho băng sáng, rõ Chứng tỏ mix hoạt động tốt, trình luân nhiệt tốt Sản phẩm PCR mẫu có vạch băng rõ, sáng, khơng có tượng nhiều băng Chứng tỏ khơng có tượng tạp nhiễm, q trình chạy PCR tốt Các mẫu có băng sáng vị trí 303bp mẫu dương, mẫu khơng có băng sáng âm tính Khơng có tượng băng sáng vị trí khác ngồi vạch 303bp, chứng tỏ primer đặc hiệu đặc hiệu cho gen urease H pylori 30 303 bp 303 bp 303 bp 303 bp Hình 4.3 Hình điện di mẫu DNA genome bệnh nhân (Sản phẩm PCR mẫu bệnh phẩm cho kết điện di vạch 303 bp, (-) chứng âm, (+) chứng dương, thang DNA ladder cho băng từ 100-1000 bp) 4.4 Đánh giá kết thu phương pháp Nhận xét: Trong 15 mẫu DNA genome bệnh nhân, kết chạy phản ứng Realtime PCR PCR cho kết giống nhau, có 12 mẫu dương tính mẫu âm tính Như khơng có tượng âm tính giả hay dương tính giả xảy Điều có nghĩa mix Realtime PCR có khả phát đặc hiệu vi khuẩn H pylori Nhưng có lợi sử dụng kĩ thuật Realtime PCR ta chạy song song gen tham chiếu β-golobulin để kiểm sốt sản phẩm DNA ly trích 31 Đồng thời với kỹ thuật Realtime PCR ta xây dựng quy trình định lượng tương đối để định lượng vi khuẩn có mẫu Bảng 4.3 Kết so sánh Realtime PCR PCR Stt Kí hiệu mẫu Realtime PCR Tên Ct Kết luận PCR kết 97085 Bình No Ct Âm tính Âm tính 97290 Khanh 22,81 Dương tính Dương tính 97340 Dung 24,91 Dương tính Dương tính 97829 Bảo 27,08 Dương tính Dương tính 98019 Trung 34,43 Dương tính Dương tính 98020 Linh 27,97 Dương tính Dương tính 98237 Phong 30,97 Dương tính Dương tính 98295 Duy No Ct Âm tính Âm tính 98296 Khang 29,10 Dương tính Dương tính 10 98469 Nam 29,14 Dương tính Dương tính 11 98709 Cường 26,87 Dương tính Dương tính 12 99192 Thúy 26,79 Dương tính Dương tính 13 99309 Cảnh 26,17 Dương tính Dương tính 14 99310 An No Ct Âm tính Âm tính 15 99311 Giang 34,85 Dương tính Dương tính 4.5 Thảo luận Nghiên cứu kit phát vi khuẩn H pylori, độ nhạy quy trình khảo sát 101 copies/ml Với kỹ thuật Realtime kết mà thu nhận tốt Trong q trình ly trích DNA, gen β-golobulin ly trích khuếch đại song song với DNA vi khuẩn, sở để kiểm tra trình ly trích, kiểm tra sản phẩm DNA HP TQ mix có thêm thành phần dUTP enzyme UNG, giúp loại trừ nguy ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại Nếu khơng áp dụng biện pháp khơng sớm muộn thảm họa ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại xảy 32 Realtime PCR hệ thống kín giúp giảm nguy ngọai nhiễm, giảm thời gian làm xét nghiệm chẩn đoán so với phương pháp PCR truyền thống Kết nhanh chóng, xác, giảm độc hại cho người làm thí nghiệm Giới hạn đề tài chưa khảo sát cách tính tương đối số sử dụng gen tham chiếu β-golobulin theo công thức Δ ΔCt Livak Do giới hạn cỡ mẫu nên chúng tơi đánh giá xác khả phát vi khuẩn H pylori phương pháp Realtime PCR so với PCR có tốt khơng 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Với mục tiêu chẩn đốn nhanh, xác diện vi khuẩn H pylori gây tượng viêm loét dày nhằm kiểm soát loại bỏ diện vi khuẩn, tiến hành đề tài, kết đạt sau: o Độ nhạy quy trình khảo sát mẫu chuẩn plasmid 101copies/ml o Gen tham chiếu β-golobulin sử dụng để kiểm soát sản phẩm DNA, đồng thời để mẫu âm tính thực âm tính (tức khơng có tượng âm tính giả) o Sản phẩm DNA genome bệnh nhân sau chạy Realtime có kết quả, sử dụng DNA genome để chạy phản ứng PCR Kết so sánh phương pháp tốt, có độ tương đồng cao 5.2 Đề nghị Tiến hành xây dựng cách tính số copies DNA vi khuẩn theo phương pháp Δ ΔCt Livak (2001) Tiến hành nghiên cứu số lượng mẫu lớn để đánh giá khả phát mix Realtime so với mix PCR cách xác Tiến hành khảo nghiệm mix Realtime mẫu mảng bám để tìm đánh giá khả phát mix Khi việc lấy mẫu dễ dàng hơn, phát vi khuẩn nhanh hơn, tránh tác hại xấu đáng tiếc xảy 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bio-Rad Laboratories 2008 Realtime PCR – kỹ thuật ứng dụng Bùi Hữu Hoàng 2009 Cập nhật thơng tin Helicobacter pylori, tạp chí khoa học tiêu hóa Việt Nam Phạm Hùng Vân, PCR Realtime PCR vấn đề áp dụng thường gặp, NXB y học Phùng Đắc Cam Nguyễn Thái Sơn 2003 Helicobacter pylori bệnh dày tá tràng, NXB y học Võ Hùng Lâm 2010 Phương pháp chuẩn đoán nhiễm Helicobacter pylori Tài liệu Tiếng Anh H.J.L Brooks et al 2004 Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 50 (2004) 1–5 Ramı´rez-La´zaro MJ, Lario S, Casalots A, Sanfeliu E, Boix L, et al (2011) Real-Time PCR Improves Helicobacter pylori Detection in Patients with Peptic Ulcer Bleeding PLoS ONE 6(5): e20009 doi:10.1371/journal.pone, volume 6, issue Qiang He et al 2002 Real-Time Quantitative PCR for Detection of Helicobacter pylori, 3720-3728 D Kobayashi et al 2001 Gastric mucosal density of Helicobacter pylori estimated by realtime PCR compared with results of urea breath test and histological grading, vol 51, 305-311 Nguồn tham khảo từ website http://www.baocamau.com.vn/newsdetails.aspx?id=29&newsid=10396 http://www.benhvienlongxuyen.com/nuke/viewimg.php?imglink=uploads/News/pi c/1163732126.nv.jpg http://benhvien198.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=127:noi 31&catid=39:tinkhoahoc&Itemid=59 http://www.bing.com/health/article/mayo-126640/GERD?q=gerd&qpvt=acidreflex http://www.dangtranmy.com/BaiViet/10/251/164/Chua-tri-cac-benh/Chua-viemda-day -ta-trang-bang-thuoc-Nam.html http://www.helicobacterpyloritest.com/helicobacter-pylori-ulceration.html http://it.wikipedia.org/wiki/File:H_pylori_virulence_factors_en.png http://www.sciencephoto.com/media/11656/enlarge http://www.100scienze.it/index.php?/plugin/tag/helicobacter+pylori 10 http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn 11 http://www.suckhoedoisong.vn 35 ... kỹ thuật Realtime PCR việc phát vi khuẩn Helicobacter pylori gây bệnh viêm loét dày tá tràng nhằm phát vi khuẩn sớm xác Chúng tơi sử dụng kit, chứng chuẩn, mẫu bệnh phẩm để xây dựng quy trình. .. TÀI LIỆU 2.1 Dạ dày - tá tràng 2.1.1 Dạ dày, tá tràng 2.1.2 Những bệnh lí thường gặp dày 2.1.3 Nguyên nhân yếu tố gây bệnh loét dày - tá tràng 2.1.4 Triệu chứng bệnh loét dày - tá tràng 2.1.5... pháp tách chiết DNA 23 3.3.3 So sánh kĩ thuật Realtime PCR với PCR việc phát H pylori 23 3.3.3.1 Phương pháp phát H pylori kĩ thuật Realtime PCR 24 3.3.3.2 Phương pháp phát H pylori kĩ thuật PCR